600 ChinJGastroenterol,207,Vol.22,No0 发现位于上皮细胞顶侧的紧密连接改变在肠道屏障功能中发挥关键作用, 紧密连接主要由 claudin 蛋白 occuludin 蛋白 JAM 等结构蛋白分子共同组成 [3] 来源于植物或水果的提取物( 如姜黄素 槲皮素 苹果原浆

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1 胃肠病学 207 年第 22 卷第 0 期 599 实验性结肠炎大鼠结肠上皮 claudin 2 4 表达改变 武晓琳 赵春燕 江海洋 范聪聪 2# 王丽波 吉林大学基础医学院病原微生物学系 2 (3002) 吉林大学第一医院胃肠内科 背景 : 溃疡性结肠炎 (UC) 是一种慢性非特异性肠道炎症病变, 大量研究表明,UC 肠黏膜损伤与紧密连接蛋白改变有关 目的 : 探讨实验性结肠炎大鼠结肠中 claudin 2 4 的表达 方法 : 将 40 只雌性 Wistar 大鼠随机分为正常对照组和模型组, 给予大鼠 7.5mg/mL 恶唑酮灌肠制备实验性结肠炎模型, 以等量 0.9% NaCl 溶液灌肠作为正常对照 造模 7d 后, 行大体评分和结肠组织学评分, 以 ELISA 法检测血清和结肠中细胞因子 TNFα IL4 IL5 IL0 含量, 免疫组化和蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白 claudin 2 4 蛋白表达, 实时 PCR 法检测 claudin 2 4mRNA 表达 结果 : 与正常对照组相比, 模型组结肠大体评分和组织学评分均显著升高 (P<0.05); 血清和结肠组织 IL4 和 IL5 含量均显著增高 (P<0.05), 而两组 TNFα 和 IL0 含量无明显差异 (P>0.05);claudin 4 mrna 和蛋白表达显著降低 (P<0.05),claudin2mRNA 和蛋白表达显著增高 (P<0.05) 结论: 实验性结肠炎大鼠中紧密连接蛋白 claudin 2 4 的分布和表达发生改变, 导致肠黏膜屏障功能受损, 有望作为 UC 治疗的潜在靶点 关键词紧密连接蛋白质类 ; 恶唑酮 ; 结肠炎, 溃疡性 ; 细胞因子类 ChangesofExpresionsofClaudin,2,4inExperimentalColitisRats WUXiaolin,ZHAOChunyan,JIANG Haiyang,FAN Congcong,WANGLibo 2. DepartmentofPathogenBiology,ColegeofBasicMedicalSciences,Jilin University,Changchun(3002); 2 DepartmentofGastroenterology,theFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun Correspondenceto:WANGLibo, wanglibo75@63.com Background:Ulcerativecolitis(UC)isachronicinflammatorydisorder.Studieshaveshownthatintestinalinjuryof UCisrelatedtochangesoftightjunctionproteins.Aims:Toinvestigatetheexpresionsandlocalizationsoftightjunction proteinclaudin,2,4.methods:fortyfemalewistarratswererandomlydividedintonormalcontrolgroupandmodel group.ratsinmodelgroupreceived7.5mg/mloxazoloneenematoinduceexperimentalcolitis.ratsreceived0.9% NaClsolutionenemawereservedasnormalcontrols.Macroscopicscoreandhistologicalscorewereasesed.ELISAwas usedtodetermineserumandcolontisueinflammatoryfactortnfα,il4,il5,il0levels.proteinexpresionsoftight junctionproteinclaudin,2,4weremeasuredbyimmunohistochemistryandwesternbloting.mrnaexpresionsof claudin,2,4weredeterminedbyrealtimepcr.results:comparedwithnormalcontrolgroup,macroscopicscore andhistologicalscoreweresignificantlyincreased(p<0.05),serum andcolontisueil4andil5levelswere significantlyincreased(p<0.05)inmodelgroup,however,nosignificantdiferencesintnfαandil0levelswere foundbetweenthetwogroups(p>0.05).mrnaandproteinexpresionsofclaudin,4weresignificantlydecreasedin modelgroupthaninnormalcontrolgroup(p<0.05),whilemrnaandproteinexpresionsofclaudin2weresignificantly increased(p<0.05).conclusions:changesofdistributionsandexpresionsoftightjunctionproteinclaudin,2,4 arefoundinexperimentalcolitisrats,whichmayleadtoimpairedepithelialbarier,andmightbeservedaspotentialtarget fortreatmentofuc. Keywords Claudins; Oxazolone; Colitis,Ulcerative; Cytokines 溃疡性结肠炎 (ulcerativecolitis,uc) 是一组反复发作的慢性炎症性肠道疾病, 影响包括儿童在内 DOI:0.3969/j.isn 基金项目 : 吉林省科技发展项目计划 ( GH) # 本文通信作者, wanglibo75@63.com 的几乎各个年龄段的人群, 已成为全球性疾病 [] 然而, 其病因尚未完全阐明, 目前普遍认为 UC 的致病因素可能包括遗传 免疫异常 环境 肠道微生物等的相互作用, 最终导致结肠炎症的发生 [2] 肠黏膜屏障受损可能是导致 UC 发生的病理基础 近年

2 600 ChinJGastroenterol,207,Vol.22,No0 发现位于上皮细胞顶侧的紧密连接改变在肠道屏障功能中发挥关键作用, 紧密连接主要由 claudin 蛋白 occuludin 蛋白 JAM 等结构蛋白分子共同组成 [3] 来源于植物或水果的提取物( 如姜黄素 槲皮素 苹果原浆等 ) 已在 Caco2 细胞株中证实可通过抑制激酶或促使转录因子表达来调节 claudin 表达, 从而增加跨上皮电阻, 改善肠上皮屏障功能 上述实验结论可能延伸到人小肠上皮, 从而对肠相关疾病的研究起积极作用 [46] 目前 claudin 在 UC 病因 诊断 预后以及治疗中的分子机制研究少见 本研究通过给予恶唑酮诱导大鼠实验性结肠炎模型, 并检测 claudin 蛋白表达, 旨在探讨紧密连接在 UC 中的作用, 从而为其用于 UC 的诊治提供一定的依据 材料与方法一 主要材料清洁级雌性 Wistar 大鼠 ( 吉林大学动物实验中心 )40 只, 体质量 80~20g 恶唑酮购自 Sigma 公司 ;claudin 兔多克隆抗体购自 ImmunoWay 公司 ;claudin2 兔多克隆抗体购自 Abcam 公司 ; claudin4 山羊多克隆抗体购自 SantaCruz 公司 ; GAPDH 鼠单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司 ;Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司 ;RNAisoPlus 试剂盒 SuperPrimeScript RTreagentKitwithgDNA Erase 试剂盒和 SuperScript TM Ⅲ ReverseTranscriptase 均购自 TaRaKa 公司 ;IL4 IL5 IL0 TNFα 大鼠 ELISA 检测试剂盒均购自 R&D 公司 二 研究方法. 动物分组与造模方法 : 按照 Abdin [7] 的实验方法, 将大鼠分为模型组和正常对照组, 每组各 20 只 大鼠禁食不禁水 d,0% 水合氯醛腹腔注射麻醉后, 将一直径 2mm 的静脉输液管由肛门轻缓插入至 8cm 处, 模型组大鼠注射浓度为 7.5mg/mL 的恶唑酮.mL, 正常对照组注射等体积 0.9% NaCl 溶液, 倒置 min, 以利药物与肠壁充分接触而不致于经肛门溢出 结束后, 动物平躺, 自然清醒, 自由饮食 每日观察并记录各组大鼠存活状况, 精神状态 进食 活动 排便等情况 2. 标本采集 : 造模后第 7 天,0% 水合氯醛麻醉大鼠, 取结肠组织 部分结肠组织以 4% 多聚甲 醛溶液固定, 石蜡包埋, 行 HE 染色和免疫组化染色, 剩余结肠组织置于液氮中保存, 用于实时 PCR 和蛋白质印迹法 3. 观察指标 : 造模后存活率 : 主要观察模型组大鼠死亡情况 2 造模后一般情况 : 包括大鼠饮食 体质量 排便 皮毛 活动情况 精神状态等情况 3 造模后结肠组织损伤大体形态评分和组织学评分方法 : 大体评分指标包括黏连 局部充血 溃疡和炎症 黏连和充血按有无以及轻重程度分别计 0 2 分, 出现炎症 溃疡数目增加 个 溃疡直径 >2cm 时每增加 cm 计分均加 分 组织学评分指标包括溃疡 炎症 肉芽肿 纤维化以及病变深度, 按有无和轻重程度分别计 0 2 分, 病变深度达黏膜下层 肌层 浆膜层分别计 2 3 分, 各项相加得总评分 4HE 染色 : 光学显微镜下观察组织炎症和溃疡情况 4.ELISA 法 : 取各组大鼠血清和结肠组织, 按照 ELISA 试剂盒说明书, 设置标记标准孔和样品孔后分别加入待测样本 0μL 样本稀释液 40μL 以及检测抗体 00μL, 封板膜封住反应孔,37 恒温箱孵育 h, 清洗反应板 每孔先后加入底物 A B 各 50μL,37 避光孵育 5min 最后加入终止液 50μL,5min 内在 450nm 波长处测定各孔 A 值 5. 免疫组化染色 : 取各组大鼠结肠组织切片二甲苯脱蜡,3% H 2 O 2 孵育 30min 以阻断内源性过氧化氢酶,PBS 洗涤,% BSA 封闭 30min 后滴加一抗 (claudin 2 4 工作浓度分别为 ),4 过夜,PBS 洗涤, 加入二抗 DAB 显色, 苏木素复染 脱水 透明 封片, 显微镜下观察 以细胞质呈棕黄色或棕褐色为阳性表达 6. 实时 PCR 法 : 提取结肠组织总 RNA, 逆转录合成 cdna 各目的基因的引物序列见表, 反应条件 :95 0min;95 0s,60 60s,40 个循环 上 CFX96 TM RealTimeSystem(BioRad) 荧光定量仪, 具体步骤按照说明书进行 以 GAPDH 作为内参, 采用 2 -ΔΔCt 法分析样本中目的基因 mrna 相对表达量 7. 蛋白质印迹法 : 提取结肠组织全蛋白并测定蛋白含量 取 60μg 蛋白行 SDSPAGE 电泳, 转移到 PVDF 膜上, 加入抗 claudin 抗体 ( 工作浓度 200) 抗 claudin2 抗体 ( 工作浓度 300) 抗 claudin4 抗体 ( 工作浓度 200)4 过夜, 次日用

3 胃肠病学 207 年第 22 卷第 0 期 60 TBST 洗涤 3 次, 加入二抗孵育 h, 化学发光 ECL 放射自显影 以 GAPDH 作为内参,ImageJ 软件处理分析蛋白条带灰度值 表 目的基因引物序列 基因 引物序列 (5 3 ) 产物长度 (bp) GAPDH F:GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTA R:TGGTAACCAGGCGTCCGATA 24 claudin F:AACAACCTCTTACCCAACACCAC R:ACAGCCAAGACCCTCATAGCC 232 claudin2 F:AACACGCCTTTCCTATTTCCAC R:TGGCTTCCAGGTCAGCATAAC 64 claudin4 F:CGCTACTCTTGCCGTTTCTCG R:CTCCACCCTTCCCTCAAACCT 27 三 统计学分析所有实验均重复 3 次, 取均值 应用 SPSS9.0 统计软件, 所得数据以 x±s 珋表示, 两组均数比较采用独立样本 t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 结果一 大鼠一般情况模型组大鼠 3d 内出现排便次数增多 稀便 便上有黏液或脓点 肛周有粪便等表现, 少数出现黏液血便, 其中 4 只大鼠因症状严重而于造模 3d 左右死亡 死亡大鼠腹腔内可见大量腹水, 胃腔高度扩张, 空回肠亦明显扩张, 结直肠水肿 肠壁颜色灰暗, 肠壁变薄, 部分呈坏疽状, 其中 只可见穿孔灶 ( 图 ) 正常对照组大鼠饮食正常 反应灵活 体质量增加, 毛发无光泽, 大小便正常均无腹泻和血便 二 组织病理学改变模型组大鼠结肠黏膜上皮糜烂 溃疡形成, 黏膜下水肿 杯状细胞和腺体减少, 固有层有弥漫性中性粒细胞 淋巴细胞浸润, 黏膜下淋巴细胞增生 ; 正常对照组结肠黏膜上皮完整, 黏膜下亦无腺体和杯状细胞消失, 仅见少量炎症细胞浸润 ( 图 2) 模型组大体评分和结肠组织学评分明显高于对照组 (P<0.05)( 表 2) 三 血清和结肠组织细胞因子含量与正常对照组大鼠相比, 模型组血清和结肠组织 IL4 和 IL5 含量均显著增高 (P<0.05), 而两组 TNFα 和 IL0 含量无明显差异 (P>0.05)( 表 3 表 4) 图 模型组死亡大鼠大体表现图表 2 大鼠结肠组织学评分比较 ( x±s) 珋 组别 例数 大体评分 组织学评分 模型组 20 8.± ±0.5 正常对照组 20.4± ±0.4 图 2 各组大鼠结肠组织 HE 染色图 四 紧密连接蛋白 claudin 分布和表达免疫组化结果显示,claudin 2 4 在正常对照组以及模型组大鼠结肠上皮中均有不同程度的表达, 主要位于细胞质 与正常对照组相比, 模型 表 3 各组大鼠血清细胞因子含量比较 ( x±s,pg/ml) 珋 组别 例数 TNFα IL4 IL5 IL0 正常对照组 ± ± ± ±3.57 模型组 ± ± ± ±2.26 P 值

4 602 ChinJGastroenterol,207,Vol.22,No0 表 4 各组大鼠结肠组织细胞因子表达比较 ( x±s,pg/ml) 珋 组别 例数 TNFα IL4 IL5 IL0 正常对照组 ± ± ± ±9.99 模型组 ± ± ± ±37.52 P 值 组大鼠结肠组织中 claudin 4 表达明显下降, 而 claudin2 表达明显增加 ( 图 3) Da=0.992u 图 3 各组大鼠结肠组织中 claudin 2 4 表达 ( 免疫组化染色, 200) 五 实时定量 PCR 检测 claudin 2 4mRNA 表达与正常对照组相比, 模型组 claudin 4mRNA 表达显著降低 (P<0.05), 而 claudin2mrna 表达显著增高 (P<0.05)( 图 4) 六 蛋白质印迹法检测 claudin 2 4 蛋白表达与正常对照组相比, 模型组 claudin 4 蛋白表达显著降低 (P<0.05), 而 claudin2 蛋白表达显著增高 (P<0.05)( 图 5) 图 4 各组大鼠结肠组织中 claudin 2 4mRNA 表达 ( 实时 PCR 法 ) 图 5 各组大鼠结肠组织中 claudin 2 4 蛋白表达 ( 蛋白质印迹法 ) 讨论近年肠黏膜屏障功能在 IBD 病理生理过程中的作用逐渐引起重视 机械屏障是肠黏膜屏障的重要组成部分, 由单层肠上皮细胞和细胞间连接 ( 包括紧密连接 黏附连接和缝隙连接 ) 组成, 紧密连接通透性是决定肠道通透性的关键因素, 维持完整的紧密连接形态和功能对保护肠黏膜屏障 防止细菌易位具有重要意义 急性期 IBD 患者肠黏膜屏障受损, 肠道通透性增加, 肠上皮完整性受损, 如溃疡 糜烂等肉眼可见病变是引起屏障功能受损的主要原因, 但在上皮组织完整的肠黏膜区同样可见紧密连接结构受损 通透性增加 [8] 细胞因子通过两种方式影响紧密连接, 一是调节紧密连接蛋白的表达, 二是影响紧密连接蛋白重新分布的过程 [9] 恶唑酮为一种半抗原, 可诱发大鼠结肠发生接触性过敏反应 恶唑酮诱导的实验性结肠炎为 IL4 介导的以 IL4/IL5 含量增高为主 TNFα 和 INFγ 含量正常的典型 Th2 型炎症 本研究中, 与正常对照组相比, 模型组大鼠血清以及结肠组织促炎细胞因子 IL4 和 IL5 表达显著增

5 胃肠病学 207 年第 22 卷第 0 期 603 高, 而 TNFɑ 和 IL0 表达无明显差异 但 UC 发病过程中涉及多种细胞因子, 如促炎细胞因子 ILα ILβ IL2 IL6 IL8 IL2 IL7 IL23 IFN 均与 UC 的发病和进展密切相关, 而抗炎细胞因子如 IL 4 IL0 和 IL3 与 UC 的发病以及病理特征密切相关, 促炎因子和抗炎因子共同影响结肠黏膜炎症的发生 发展, 因此各细胞因子在恶唑酮诱导 UC 中的作用仍需进一步研究 紧密连接复合体由 occludin claudin 以及膜周蛋白 JAM 和 ZO 蛋白以及相关激酶组成 Claudin 蛋白是组成紧密连接复合体的功能和结构基础, 可直接影响上皮 / 内皮组织跨上皮细胞电阻, 决定紧密连接复合体的离子选择性, 并调节紧密连接复合体的通透性 一部分 claudin 可加固细胞间的连接, 其表达上调可降低紧密连接复合体的通透性, 称之为 封闭性 claudin 蛋白, 包括 claudin 等 ; 另一部分 claudin 分子可通过形成特异性离子通道而增加紧密连接复合体的通透性, 称之为 渗漏性 claudin 蛋白, 如 claudin2 可增加紧密连接结构孔数量, 增加经细胞旁物质运输, 尤其是 Na + 离子的吸收 claudin 蛋白与 occludin ZO 蛋白相连, 在组装成熟的紧密连接结构和维持紧密连接复合体的完整性方面发挥重要作用 [9] 本研究免疫组化 蛋白质印迹法和实时 PCR 结果均显示, 与正常对照组相比, 恶唑酮诱导的结肠炎大鼠结肠上皮渗漏性紧密连接蛋白 claudin2 表达增加, 封闭性紧密连接蛋白 claudin 4 表达显著下降 推测这些紧密连接蛋白表达变化是引起恶唑酮大鼠结肠紧密连接复合体受损 肠黏膜屏障 [0] 功能下降的主要机制 Fischer 等的研究表明 TNFα 单克隆抗体阿达木单抗可缓解 TNFα 引起的结肠癌细胞株 T84 细胞紧密连接蛋白 claudin 2 4 以及 occludin 表达减少导致的细胞屏障功能紊乱以及渗透性增加 因此细胞屏障的保护作用将成为抗 TNFα 治疗机制的研究新方向, 这一作用可对炎症性肠病造成的结肠上皮重塑以及组织损伤均具有重要意义 [] 总之, 结肠炎大鼠结肠组织中 claudin 2 4 表达改变与黏膜屏障损伤 功能紊乱以及渗透性改变可能具有重要联系, 可作为 UC 的治疗研究靶点, 是 UC 药物治疗疗效的重要评价指标以及药物机制研究的重要方向, 未来需行进一步研究探讨 参考文献 CosnesJ,GowerRouseauC,SeksikP,etal.Epidemiology andnaturalhistoryofinflammatoryboweldiseases[j]. Gastroenterology,20,40(6): RandhawaPK,SinghK,SinghN,etal.A review on chemicalinducedinflammatoryboweldiseasemodelsin rodents[j].koreanjphysiolpharmacol,204,8(4): RodaG,SartiniA,ZambonE,etal.Intestinalepithelial cels in inflammatory bowel diseases[j]. World J Gastroenterol,200,6(34): LuZ, DingL, Lu Q, etal. Claudinsin intestines: Distribution and functionalsignificance in health and diseases[j].tisuebariers,203,(3):e EpsteinJ,DocenaG,MacDonaldTT,etal.Curcumin suppresesp38mitogenactivatedproteinkinaseactivation, reduces ILbeta and matrix metaloproteinase3 and enhancesil0inthemucosaofchildrenandadultswith inflammatoryboweldisease[j].brjnutr,200,03 (6): VreeburgRA,vanWezelEE,OcaaCalahoroF,etal. Appleextractinducesincreasedepithelialresistanceand claudin4expresionincaco2cels[j].jscifoodagric, 202,92(2): AbdinAA.Targetingsphingosinekinase(SphK)and apoptosisbycolonspecificdeliveryformulaofresveratrolin treatmentofexperimentalulcerativecolitisinrats[j].eur JPharmacol,203,78(3): HaberVE, Čuic'S, Kramaric'MD, etal. Claudin expresioninanimalmodelsofibd andhumandisease [J].NewHorizTranslMed,205,2(2):66. 9 HeringNA, Fromm M, SchulzkeJD. Determinantsof colonicbarierfunctionininflammatoryboweldiseaseand potentialtherapeutics[j].jphysiol,202,590(5): FischerA, Gluth M, Pape UF, etal. Adalimumab preventsbarierdysfunctionandantagonizesdistinctefects oftnfαontightjunctionproteinsandsignalingpathways inintestinalepithelialcels[j].amjphysiolgastrointest LiverPhysiol,203,304():G970G979. AmashehS,Fromm M,GünzelD.Claudinsofintestine andnephron acorelation ofmoleculartightjunction structureandbarierfunction[j].actaphysiol(oxf), 20,20():3340. ( 收稿 ; 修回 )

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