6 期刘海映等 : 口虾蛄高血糖激素基因全长 cdna 的克隆及表达分析 99 nus) [10] 中华绒螯蟹 ( 犈狉犻狅犮犺犲犻狉狊犻狀犲狀狊犻狊 ) [11] 斑节对虾 ( 犘犲狀犪犲狌狊犿狅狀狅犱狅狀 ) [12] 刀额新对虾 ( 犕犲狋犪狆犲狀犪犲狌狊犲狀 狊犻狊 ) [13] 红斑青蟹
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1 第 38 卷第 6 期海洋学报 Vol.38,No 年 6 月 HaiyangXuebao June2016 刘海映, 张秀芹, 隋宥珍, 等. 口虾蛄高血糖激素基因全长 cdna 的克隆及表达分析 [J]. 海洋学报,2016,38(6):98 109,doi: /j.issn LiuHaiying,ZhangXiuqin,SuiYouzhen,etal.MolecularcloningandexpressionofafullengthcDNAofencodingcrustaceanhypergly cemichormone(chh)in 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 [J]. Haiyang Xuebao,2016,38 (6):98 109,doi: /j.issn 口虾蛄高血糖激素基因全长犮犇犖犃的克隆及表达分析 刘海映 1, 张秀芹 1, 隋宥珍 1, 李宏俊 2, 邢坤 1, 姜玉声 3, 杨贵福 1, 陈雷 1, 张娜 1 (1. 大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室, 辽宁大连 ;2. 国家海洋环境监测中心, 辽宁大连 ;3. 大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室, 辽宁大连 ) 摘要 : 本文首次采用 RACE 技术获得口虾蛄 ( 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 ) 眼柄部高血糖激素 (crustaceanhy perglycemichormone,chh) 基因 cdna 全长序列, 共 2421bp,5 UTR 长度为 180bp,3 UTR 为 1821 bp, 开放阅读框 (ORF) 长 420bp, 编码 139 个氨基酸 预测蛋白二级结构 α 螺旋 23.74%, 延伸链占 23.02%, 无规则卷曲占 53.24%, 预测分子量为 15.47kD, 等电点 ( 狆犐 ) 为 CHH 成熟肽包含 6 个 CHH 家族中位置保守的 Cys 残基,C 端为 GK, 推断为 ES 型 CHH 基因 聚类分析表明 : 口虾蛄 CHH 和十足目 CHH 聚为同一个分支的两亚群, 具有较近的亲缘关系 荧光定量 PCR 分析结果表明,CHH 基因在肠中表达量最高, 在眼柄 触角中有较高的表达量, 在肌肉中表达量相对较低, 在卵巢中表达最低, 而在精巢中不表达 关键词 : 口虾蛄 ; 高血糖激素 CHH; 分子克隆 ; 荧光定量 PCR; 表达分析中图分类号 :Q71 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 引言 高血糖激素 (crustaceanhyperglycemichormone, CHH) 是甲壳动物眼柄中含量丰富且研究最多的激素, 由眼柄 X 器官 - 窦腺复合体合成和分泌, 在甲壳类动物的生长 繁殖和蜕皮等生理过程中具有重要作 [1 2] 用 与高血糖激素协同调控作用的 CHH 家族神经多肽激素还包括蜕皮抑制激素 (molt inhibiting hormone,mih) 性腺抑制激素 (gonad inhibitinghor mone,gih) 和大颚器抑制激素 (mandibularorgan in hibitinghormone,moih) 等, 这些神经多肽激素氨基 酸序列具有较高的相似性 CHH 基因不仅对甲壳类动物蜕皮和生殖起重要作用, 同时还参与了调控甲壳动物的能量代谢 血糖调节和渗透压调节等重要生理 [3 7] 活动 甲壳动物高血糖激素神经肽由信号肽, 相关肽 (precursor relatedpeptide,cprp), 二盐基切割位点 (KR 或 RR), 成熟肽 氨基酸和 C 端酰氨化 [6,8] 封阻位点组成 根据相关肽基因序列(CPRP) 的有无可以将 CHH 家族神经肽分为 CHH 与 MIH/ GIH/MOIH 两个亚族, 即 CHHⅠ 族与 CHHⅡ 族 目前,CHH 基因已相继在日本沼虾 ( 犕犪犮狉狅犫狉犪犮犺犻狌犿狀犻狆狆狅狀犲狀狊犲 ) [9] 美洲螯龙虾 ( 犎狅犿犪狉狌狊犪犿犲狉犻犮犪 收稿日期 : ; 修订日期 : 基金项目 : 国家海洋局海洋公益项目 ( ); 国家自然科学基金资助项目 ( ) 作者简介 : 刘海映 (1957 ), 男, 辽宁省大连市人, 教授, 硕士生导师, 主要研究方向为渔业资源增殖 E mail:hyliu@dlou.edu.cn 通信作者 : 邢坤 (1984 ), 副教授, 山东省临沂市人, 主要从事海洋生物学与渔业资源学研究 E mail:xingkun@dlou.edu.cn
2 6 期刘海映等 : 口虾蛄高血糖激素基因全长 cdna 的克隆及表达分析 99 nus) [10] 中华绒螯蟹 ( 犈狉犻狅犮犺犲犻狉狊犻狀犲狀狊犻狊 ) [11] 斑节对虾 ( 犘犲狀犪犲狌狊犿狅狀狅犱狅狀 ) [12] 刀额新对虾 ( 犕犲狋犪狆犲狀犪犲狌狊犲狀 狊犻狊 ) [13] 红斑青蟹 ( 犆犪犾犻狀犲犮狋犲狊狊犪狆犻犱狌狊 ) [14] 等多种甲壳类动物中克隆, 同时 CHH 基因的分子结构和组织表 [9,14] 达等方面也被深入地研究 然而, 这些工作在虾蟹的研究多以十足目物种为研究对象, 且 CHH 基因在甲壳动物中的进化关系至今尚不清楚 因此, 有必要对包括口足目在内的甲壳动物 CHH 基因序列特性进行研究, 为探甲壳动物生长 繁殖相关基因的功能演化提供重要依据 口虾蛄 ( 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 ) 俗称虾爬子, 隶属于节肢动物门 (Arthropoda) 甲壳纲 (Crustacea) 软甲亚纲 (Eumalacostraca) 口足目 (Stomatopoda) 虾蛄科 (Squilidae) 口虾蛄属 ( 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪 ) 口虾蛄作为我国沿海地区重要的海产经济甲壳类渔业资源, 其经济价值高 国内外关于口虾蛄分子生物学的研究主要 [15 17] 集中在遗传多样性分析等方面, 对口虾蛄功能 [18] 基因的报道很少, 而口虾蛄 CHH 基因的功能性研究目前尚未见报道 本文以口虾蛄为实验材料, 采用 cdna 末端快速扩增 (RACE) 方法克隆 CHH 基因全长 cdna 序列, 对 CHH 基因在口虾蛄不同组织中表达规律进行荧光定量分析, 旨在为口虾蛄蜕皮等相关功能研究和作用机制奠定基础, 同时为其他甲壳类动物 CHH 家族基因的功能研究提及进化机制提供参考 2 材料与方法 2.1 材料 实验虾蛄口虾蛄来自大连近岸水域, 取性腺发育成熟的雌雄个体, 体长范围为 10.5~16.0cm, 在实验室控温循环水槽中暂养 1 周, 水温维持在 25,pH8.2, 持续充气, 每天投喂新鲜菲律宾蛤仔 ( 犚狌犱犻狋犪狆犲狊狆犺犻犾犻狆狆犻 狀犪狉狌犿 ) 两次 试剂和仪器 3 FulRACE CoreSetwithPrimeScript TM RTa ses 试剂盒 5 FulRACECoreSetwithPrimeScript TM RTases 试剂盒 PrimeScriptRTreagentKitwithgD NAEraser SYBRPremixExTaq(TliRNaseH Plus) 均购自 Takara;pEASY T1 载体 感受态细胞 Trans5αChemicaly Competent Cel(TransGen Bio tech); 动物总 RNA 快速抽提试剂盒 全血总 RNA 快速抽提试剂盒 AXYGEN 柱式凝胶回收试剂盒 去 RNA 酶离心管等均来自 SangonBiotech;PCR 引物由 SangonBiotech 合成 实验所用仪器包括微型离心机 ( 日本 TOMY), 紫外分光光度计 (EppendorfBioPho tometer), 梯度 PCR 扩增仪 (Eppendorf Autherized ThermalCycler), 凝胶成像系统 (UVPEC3Imaging System); 荧光定量 PCR 仪 (TaKaRaCodeTP700) 2.2 方法 总 RNA 提取与 cdna 的合成口虾蛄总 RNA 的提取, 实验设置 3 个平行样本, 每个样本挑选 3 只活力好的成体口虾蛄, 分别提取血淋巴 眼柄 触角 肌肉 精巢 卵巢 脑和肠道 8 个组织的总 RNA 抽取血液 3mL, 采用全血总 RNA 快速抽提试剂盒提取总 RNA; 取眼柄 6 只 ( 约 25mg), 剥离色素组织后迅速溶入液氮, 按照动物总 RNA 快速抽提试剂盒提取总 RNA, 其他组织总 RNA 的提取同眼柄 采用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测各组织总 RNA 的完整性, 并通过紫外分光光度计测定 OD260 和 OD280 值, 检验总 RNA 纯度及浓度 眼柄总 RNA 按照 FulRACE CoreSetwith PrimeScript TM RTases 试剂盒说明书进行反转录,-20 保存, 用于后续 CHH 基因 cdna 全长序列的克隆 ; 按照 Prime ScriptRTreagentKitwithgDNAEraser 试剂盒说明书进行反转录,-20 保存, 以备于不同组织的表达荧光定量 PCR 检测 反转录体系为 : 总 RNA 为 10 μl 5 PrimeScriptbufer2 (forrealtime)4μl PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL RTPrimermix1 μl RTPrimermix1μL RNaseFreedH 2O4μL 反应条件 :37 15min,85 5s 口虾蛄 CHH 基因全长的克隆通过 Blast 搜索, 利用口虾蛄肌肉组织转录组文库筛选出的 CHH 基因部分序列, 采用 Primer5.0 软件设计 3 RACE 特异性引物 (CHH3 1 和 CHH3 2) 并合成 ( 表 1) 根据 3 FulRACE 试剂盒说明书, 以口虾蛄眼柄 cdna 为模板扩增 CHH 基因 cdna 的 3 端序列 OuterPCR 反应条件 :94 预变性 3 min; 94 变性 30s,55 退火 30s,72 延伸 60s,20 个循环 ;72 最后延伸 10 min; 反应体系 25μL Inner PCR 反应条件 :94 预变性 3 min;94 变性 30s, 55 退火 30s,72 延伸 60s,30 个循环 ;72 最后延伸 10min; 反应体系 50μL InnerPCR 产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测, 切胶回收 DNA 后, 与 peasy T1 载体连接, 然后转化到感受态大肠杆菌中,37 孵育 1h 后接种 LB 固体培养基,37 过夜培养, 随机挑
3 100 海洋学报 38 卷 取阳性单克隆菌落于 LB 液体培养基,37 摇床中培养 9h, 取 3 个平行菌液各 1mL, 送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序, 并采用 NCBI 中 Blastx 软件对 3 端 cdna 序列进行同源性分析 根据已得 CHH 基因 3 端 cdna 序列结合口虾蛄肌肉组织转录组文库, 利用 Primer5.0 软件设计 5 RACE 特异性引物 (CHH 5)( 表 1), 并根据 5 Ful RACE 试剂盒说明书扩增 CHH 基因 cdna 的 5 端序列 反应循环数为 25, 其他条件同上 序列拼接和分析 应用 ContigExpress 软件将 3 端和 5 端序列进行拼接后得到口虾蛄 CHH 基因全长 cdna 序列 在 NCBI 中 ORF 寻找开放阅读框并翻译出相应的氨基酸序列, 通过 GOR 方法在线预测对 CHH 蛋白进行结构域分析 ; 利用 SignaP4.0 软件进行信号肽预测 ; 使用 ClustalX 软件及 DNAStar 软件包中的 MegAlign 软件对蛋白序列作比对及同源性分析, 并用 MAGE4.0 软件对甲壳动物 CHH 氨基酸序列进行 NJ(Neighbour Joining 法 ) 系统进化树构建 [19 20] 实时荧光定量表达分析根据获得的 CHH 基因全长 cdna 序列设计荧光定量特异引物 CHH F 和 CHH R, 由宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司设计合成内参引物 Actb F 和 Actb R( 表 1) 分别将 3 个平行样本反转录得到的 cdna 混合作为模板 RT PCR 反应体系为 25μL: 上下游引物各 1 μl,12.5μl 的 SYBRPremixExTaqⅡ (TliRNaseH Plus)(2 ),8.5μL 的 dh 2O 模板 cdna2μl( 总量 50 ng) PCR 反应条件 ( 两步法 ):95 预变性 30s;95 变性 5s,60 延伸 30s,40 个循环 对各样品的目的基因和管家基因 (Actb) 分别做 3 个重复, 同时做 3 个不加 cdna 模板的阴性对照重复, 反应条件同上 应用 SYBRGreenⅠ 荧光染料嵌合法, 将管家基因作为内参基因, 分别对各样品的管家基因和目的基因进行定量, 将眼柄 CHH 基因 mrna 的表达量设定为 1, 用 2 -ΔΔCt 法计算目的基因 mrna 在不同组织中的相对表达量 表 1 口虾蛄犆犎犎基因克隆和荧光定量犘犆犚所用的引物及其序列 犜犪犫.1 犘狉犻犿犲狉狊犪狀犱狋犺犲犻狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犻狀犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪犆犎犎犵犲狀犲犮犾狅狀犻狀犵犪狀犱狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲狉犲犪犾 狋犻犿犲犘犆犚 引物 序列 (5 3 ) 长度 /bp 作用 CHH3 1 GTGCGACGACTGTTACAACCTTTACC 26 3 端序列一次扩增 CHH3 2 GCACCACGCCCTCCAATCCTCTTTGT 26 3 端序列二次扩增 Outer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 23 3 FulRACE Inner CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 33 CHH 5 GCACCACGCCCTCCAATCCTCTTTGT 26 5 端序列扩增 Outer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA 23 5 FulRACE Inner CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG 34 CHH F CCTCCGCACCCTTTATACCA 20 RT PCRprimer CHH R CACACACAAATCAAACACTACCACA 25 Actb F TCGACTTTGAGGGTGAAATGAA 20 RT PCRcontrolprimer Actb R GAGGAAGGAAGGCTGGAAGAG 25 3 结果和分析 3.1 犆犎犎基因全长犮犇犖犃的克隆采用 3 RACE 和 5 RACE 获得 1969bp 的 3 端片段以及 751bp 的 5 端片段, 两端重叠部分的碱基包含 292bp 经 ContigExpress 软件拼接后得到 2421bpCHH 基因 cdna 序列全长, 包括 180bp5 UTR,420bp 的 ORF 和终止密码子,1821bp 的 3 UTR,3 端非编码区没有加尾信号, 但具有典型的 Po ly(a) 尾 ( 图 1) 3.2 犆犎犎基因序列生物信息学分析开放阅读框编码 129 个氨基酸, 用 DNAMAN 软件分析得到该 CHH 蛋白分子量为 15.47kD, 理论等电点狆犐为 7.049, 碱性氨基酸 15 个, 酸性氨基酸 15 个, 疏水性氨基酸 46 个, 极性氨基酸 44 个 GOR 方法在线预测 CHH 蛋白质的二级结构, 该蛋白由 α 螺旋 23.74%, 延伸链 23.02%, 无规则卷曲 53.24% 组成
4 ６期 刘海映等 口虾蛄高血糖激素基因全长 ＤＮＡ 的克隆及表达分析 １０１ 图 １ 口虾蛄 ＣＨＨＤＮＡ 序列及其编码的氨基酸序列 Ｆ １ Ｎｕ ｏ ｄ ｄｄ ｄｕ ｄｍ ｏ ｄ ｏ ｆ犗狉 犪 狋 狅 狊 犻 犾 犾 犪狅 狉 犪 狋 狅 狉 犻 犪 ＣＨＨＤＮＡ ｇ ｑｕ 狇狌 阴影部分表示信号肽 下划线表示 ＣＨＨ 前体相关肽 二盐基切割位点用竖线 表示 潜在的酰胺化位点 表示终止密码子 Ｇ １３８ 用斜体表示 ｙ Ｓ ｐ ｄ ｈ ｄ ｄ ＣＨＨ ｕ ｏ ｄｐ ｄ ｕｄ ｄ ｈ ｖ ｄ ｈ ｄ ｂ ｇ ｐ ｐ ｐ ｖ ＫＲ ｈ ｐｕ ｖ ｍ ｄ ｏ Ｇ １３８ ｈ ｋ ｄ ｏｐ ｏ ｄｏ ｇ ｙ Ｓ ４ ０Ｓ ｖ 在 线 预 测 口 虾 蛄 ＣＨＨ 前 体 ｇ 信号肽的切割位点在 Ｓ ２４ 和 Ａ ２５ 之间 同时发现 ｇ ＣＨＨ 前体相关肽 ＣＰＲＰ 和成 熟肽连 接位点即二 盐 基切割位点是 Ｋ６４Ｒ６５ 由此可知 ＣＨＨ 前体包含
5 102 海洋学报 38 卷 信号肽 (24 个 Aa) CPRP(39 个 Aa) 二盐基切割位点 KR 和成熟肽 (74 个 Aa), 且在成熟肽部分第 12 个氨基酸位上没有 CHH 家族 Ⅱ 型肽所特有的 Gly 残基 成熟肽包含在 CHH 家族中 6 个半胱氨酸 Cys 残基 (Cys72,Cys88,Cys91,Cys104,Cys108,Cys117) 和 5 个保守的氨基酸残基 (Arg78,Asp90,Asn93,Arg96, 和 Phe114),N 末端没有焦谷氨酸残基封阻, 但 C 端具有潜在的酰氨化封阻位点 Gly138( 图 2) 图 2 口虾蛄 CHH 前体与其他十足目甲壳动物 CHH 前体的氨基酸序列比对 Fig.2 Alignmentofprecursoraminoacidesequenceof 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 CHH withotherdecapod crustaceanprepro CHHs 竖线 表示信号肽和二盐基的切割位点 ; 灰色部分为保守氨基酸 Thesinglepeptideanddibasiccleavagesitesareindicatedbytheverticalline ;signalwithgreyisconservativeaminoacids 3.3 序列比对分析及系统进化树构建采用 RACE 技术从口虾蛄眼柄中获得了 CHH 基因 cdna 全长, 将该基因及其编码的氨基酸序列与已公布的虾蟹类 CHH MIH 和 GIH 序列 ( 表 2) 比对, 结果表明 ( 图 2 图 3b 和表 3): 推导的前体与寄居蟹 ( 犘犪犵狌狉狌狊犫犲狉狀犺犪狉犱狌狊 )CHH 的同源性最高, 达到了 47%; 其次是与日本沼虾 CHH 和挪威海螯虾 ( 犖犲 狆犺狉狅狆狊狀狅狉狏犲犵犻犮狌狊 )CHHA 前体相似 (44%); 与其他虾 蟹的 CHH 前体 MIH 前体和 GIH 前体同源性相对较低 (34%~43% 30%~33% 和 22%~30%) 口虾蛄 CHH 成熟肽同样与寄居蟹 CHH 的同源性最高 (59%), 而与铠甲虾 ( 犌犪犾犪狋犺犲犪狊狋狉犻犵狅狊犪 )CHH 的相似性达到 58%; 与挪威海螯虾 CHHA 挪威海螯虾 CHHB 和欧洲鳌龙虾 ( 犎狅犿犪狉狌狊犵犪犿犿犪狉狌狊 )CHHA 的成熟肽相似性均达 57%, 与其他虾蟹类的同源性为 46%~55%
6 6 期刘海映等 : 口虾蛄高血糖激素基因全长 cdna 的克隆及表达分析 103 Fig.3 图 3 口虾蛄 CHH 成熟肽与其他甲壳动物 MIH 前体的氨基酸序列比 Multiplealignmentsof 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 CHH withmihsfromothercrustaceans 灰色部分为保守氨基酸 ; 绿色部分是 MIH 基因特有的氨基酸 SignalwithgreyisconservativeaminoacidandgreenisthespecificaminoacidsofMIH 表 2 用于比对的甲壳动物犆犎犎 / 犕犐犎 / 犌犐犎 犜犪犫.2 犆狉狌狊狋犪犮犲犪狀狊犆犎犎 / 犕犐犎 / 犌犐犎犳狅狉狊犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋 序列名称 GenBan 登录号 物种 犗. 狅狉犪狋狅狉犻犪 CHH KJ 口虾蛄犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 犘. 狆犲犾犪犵犻犮狌狊 CHH Q9U5D2 远海梭子蟹犘狅狉狋狌狀狌狊狆犲犾犪犵犻犮狌狊 犛. 狆犪狉犪犿犪犿狅狊犪犻狀 CHH PO AFH5809 拟穴青蟹犛犮狔犾犪狆犪狉犪犿犪犿狅狊犪犻狀 犆. 狆狉狅犱狌犮狋狌狊 CHH3 PO ABQ41269 食用黄道蟹犆犪狀犮犲狉狆犪犵狌狉狌狊 犘. 犫犲狉狀犺犪狉犱狌狊 CHH PO ABE02191 寄居蟹犘犪犵狌狉狌狊犫犲狉狀犺犪狉犱狌狊 犌. 狊狋狉犻犵狅狊犪 CHH PO ACS35347 铠甲虾犌犪犾犪狋犺犲犪狊狋狉犻犵狅狊犪 犕. 犲狀狊犻狊 CHH Q9NGP0 刀额新对虾犕犲狋犪狆犲狀犪犲狌狊犲狀狊犻狊 犘. 犿狅狀狅犱狅狀 CHH1 O97383 斑节对虾犘犲狀犪犲狌狊犿狅狀狅犱狅狀 犕. 犼犪狆狅狀犻犮犪狊 CHH2 Q9U5D2 日本囊对虾犕犪狉狊狌狆犲狀犪犲狌狊犼犪狆狅狀犻犮犪狊 犎. 犵犪犿犿犪狉狌狊 CHHB ABA42180 欧洲螯龙虾犎狅犿犪狉狌狊犵犪犿犿犪狉狌狊
7 104 海洋学报 38 卷 续表 2 序列名称 GenBan 登录号 物种 犖. 狀狅狉狏犲犵犻犮狌狊 CHHB PO AAQ22392 挪威海螯虾犖犲狆犺狉狅狆狊狀狅狉狏犲犵犻犮狌狊 犎. 犪犿犲狉犻犮犪狀狌狊 CHHB 美洲螯龙虾犎狅犿犪狉狌狊犪犿犲狉犻犮犪狀狌狊 犘. 犮犾犪狉犽犻 CHH Q25683 克氏原螯虾犘狉狅犮犪犿犫犪狉狌狊犮犾犪狉犽犻 犕. 狀犻狆狆狅狀犲狀狊犲 CHH AEJ54624 日本沼虾犕犪犮狉狅犫狉犪犮犺犻狌犿狀犻狆狆狅狀犲狀狊犲 犕. 犾犪狀犮犺犲狊狋犲狉 ichh O77220 沼虾犕犪犮狉狅犫狉犪犮犺犻狌犿犾犪狀犮犺犲狊狋犲狉犻 犆. 犿犪犲狀犪狊 HH P14944 三叶真蟹犆犪狉犮犻狀狌狊犿犪犲狀犪狊 犛. 狅犾犻狏犪犮犲犪 CHH AAQ75760 榄绿青蟹犛犮狔犾犪狅犾犻狏犪犮犲犪 犌. 狀犪狋犪犾犻狊 CHH ABL09570 圣诞岛红蟹犌犲犮犪狉犮狅犻犱犲犪狀犪狋犪犾犻狊 犈. 狊犻狀犲狀狊犻狊 MIH DEQ 中华绒螯蟹犈狉犻狅犮犺犲犻狉狊犻狀犲狀狊犻狊 犉. 犮犺犻狀犲狀狊犻狊 MIH AAL55258 中国明对虾犉犲狀狀犲狉狅狆犲狀犪犲狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊 犔. 狏犪狀狀犪犿犲犻 MIH1 AAR04348 凡纳滨对虾犔犻狋狅狆犲狀犪犲狌狊狏犪狀狀犪犿犲犻 犕. 犲狀狊犻狊 GIH AAL33882 刀额新对虾犕犲狋犪狆犲狀犪犲狌狊犲狀狊犻狊 犎. 犪犿犲狉犻犮犪狀狌狊 GIH P55320 美洲螯龙虾犎狅犿犪狉狌狊犪犿犲狉犻犮犪狀狌狊 表 3 口虾蛄犆犎犎与其他十足目犆犎犎 / 犕犐犎成熟肽和前体的相似性 犜犪犫.3 犜犺犲犻犱犲狀狋犻狋狔狅犳狆狉狅犆犎犎 / 犆犎犎犿犪狋狌狉犲犫犲狋狑犲犲狀犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪犪狀犱狅狋犺犲狉犱犲犮犪狆狅犱犮狉狌狊狋犪犮犲犪狀狊 (%) 序列名称 口虾蛄 CHH 成熟肽 口虾蛄 CHH 前体 犘. 犫犲狉狀犺犪狉犱狌狊 CHH PO 犖. 狀狅狉狏犲犵犻犮狌狊 CHHB PO 犕. 狀犻狆狆狅狀犲狀狊犲 CHH PO 犎. 犵犪犿犿犪狉狌狊 CHHA 犎. 犵犪犿犿犪狉狌狊 CHHB 犌. 狊狋狉犻犵狅狊犪 CHH PO 犕. 犲狀狊犻狊 CHH 犖. 狀狅狉狏犲犵犻犮狌狊 CHHB PO 犘. 犮犾犪狉犽犻 CHH 犘. 狆犲犾犪犵犻犮狌狊 CHH 犛. 狆犪狉犪犿犪犿狅狊犪犻狀 CHH PO 犆. 狆狉狅犱狌犮狋狌狊 CHH3 PO 使用 MEGA4.0 软件构建 NJ 系统进化树 ( 图 4), 结果表明 CHH 家族中的 MIH CHH 和 GIH 氨基酸序列聚为 2 个不同的亚类, 其中 GIH 和 MIH 聚为一亚类,CHH 单独聚为一亚类, 这与 CHH 家族成员的分组相一致 另外,CHH 组又聚成 2 个分支, 其中口虾蛄 CHH 为一分支, 而十足目虾蟹类的 CHH 聚为另一分支 3.4 口虾蛄犆犎犎基因的组织表达分析采用荧光定量 PCR 技术检测 CHH 基因在口虾蛄体内不同组织的表达情况 实验对于每个组织 CHH 基因及管家基因分别做 3 个重复 ( 图 5) 结果 显示, 口虾蛄 CHH 基因除了在在精巢中没有表达外, 在所检测的其它组织中均有表达, 其表达量由高到低依次为肠 眼柄 脑 肌肉和卵巢 若将卵巢表达量设为 1, 肠中含量最高, 为卵巢的 倍 ; 其次眼柄的表达量为卵巢的 倍, 触角组织的表达量为卵巢的 倍 ; 在脑的表达量为卵巢的 倍 ; 在肌肉中的表达量较低, 仅为卵巢的 1.67 倍 4 讨论 4.1 口虾蛄犆犎犎序列特征甲壳动物 CHH 神经肽激素家族的蛋白质组成
8 ６期 刘海映等 口虾蛄高血糖激素基因全长 ＤＮＡ 的克隆及表达分析 １０５ 图 ４ 口虾蛄与其他甲壳动物 ＣＨＨ 前体的 ＮＪ系统进化树 Ｆ ４ Ｎ Ｊ ｏ ｇｐｈｙ ｏｇ ｏ ｆ犗狉 犪 狋 狅 狊 犻 犾 犾 犪狅 狉 犪 狋 狅 狉 犻 犪ｄｏ ｈ ｕ ｐ ｏｃｈｈ ｇ ｇｈｂｏ ｙ ｐ 狇狌 图 ５ ＲＴ ＰＣＲ 方法检测 ＣＨＨ 基因在口虾蛄不同组织内的表达 Ｆ ５ Ｅｘｐ ｏ ｏ ｆｃｈｈ ｍｒｎａ ｄ ｆ ｆ ｕ ｏ ｆ犗狉 犪 狋 狅 狊 犻 犾 犾 犪狅 狉 犪 狋 狅 狉 犻 犪 ｂｙｒｔ ＰＣＲ ｇ 狇狌 包括 ７２ ７８ 个 氨 基 酸 的 高 度 保 守 序 列 ２１ ２２ 同 源 基因序列比对结果表明 图 ２ 口虾 蛄 ＣＨＨ 前 体 序 列与其他甲壳动物 ＣＨＨ 氨基酸序列结构一致 前体 包括信号肽的 ２４ 个氨 基酸 成熟 肽的 ７４ 个氨基 酸
9 106 海洋学报 38 卷 还有 CHH 家族 Ⅰ 型神经肽所特有的 CHH 前体相关肽, 以及二盐基切割位点 KR 其信号肽的切割位点在 Ser24 和 Arg25 之间, 这与其他虾蟹类 CHH 的信 [9] 号肽切割位点相对位置一致 成熟肽具有 6 个保守的 Cys 残基和 5 个保守的氨基酸残基 (Arg78 Asp90 Asn93 Arg96 Phe114),6 个保守的半胱氨酸残基间形成 3 个二硫键, 推测这些高度保守的结构位点可能与其基本生理功能作用密切相关 从以上的序列结构特征分析可以得出该序列为口虾蛄的 CHH cdna 序列, 口虾蛄 CHH 成熟肽 N 末端虽没有焦谷氨酸残基封阻, 但具有酰氨化封阻位点 GK, 推导为 ES 型 CHH 基因 口虾蛄 CHH 和其他十足目虾蟹 MIH 的氨基酸序列相比对 ( 图 3), 结果发现 : 成熟肽氨基酸序列相似性相对较低, 且在成熟肽部分第 12 个氨基酸位上没有 CHH 家族 Ⅱ 型神经肽 (MIH,GIH) 所特有的 Gly 残基, 但其高度保守的氨基酸都集中在 6 个半胱氨酸残基周围 系统发育树中也可以看出,CHH 与 MIH 和 GIH 距离较远, 如此表明, 它们虽然同处一个家族中, 但氨基酸的组成不同, 且在序列长度上也存在很大差异的 目前, 在黑背陆地蟹 ( 犌犲犮犪狉犮犻狀狌狊犾犪狋犲狉犪犾犻狊 ) [23] 和利莫斯螯虾 ( 犗狉犮狅狀犲犮狋犲狊犾犻犿狅狊狌狊 ) [24] 的 CHH 具有抑制蜕皮的作用, 由于 CHH 分子的空间结构与 MIH 存在一定的相似性, 据此引起 CHH 与 Y 器官表面受体发生特异性结合, 从而抑制了蜕皮活动 在日本囊对虾 MIH 基因结构的研究中,Katayama 等曾指出, 成熟肽第 72 位点上的氨基酸 (Ile) 对于 MIH 的活性 [25] 至关重要, 但是在口虾蛄以及十足目虾蟹的 CHH 成熟肽中第 72 位点上的氨基酸是 Val 经分析可知, Val 与 Ile 都属于非极性氨基酸, 因此推测口虾蛄 CHH 成熟肽 72 位点上氨基酸 (Val) 很可能是行使抑 [11] 制蜕皮功能的重要位点 4.2 口虾蛄犆犎犎系统进化系统进化显示整个 CHH 系统发育树口虾蛄 CHH 基因与十足目虾蟹类的 CHH 为同一个分支的 2 个亚组, 然后与十足目虾蟹类的 MIH GIH 聚为一簇, 口虾蛄 CHH 与 MIH GIH 进化关系相对较远 由图 3 可知, 十足目虾蟹类的 CHH 又分为枝鳃亚目 ( 犕. 犲狀狊犻狊, 犘. 犿狅狀狅犱狅狀 ) 和腹胚亚目 2 支, 其中腹胚亚目虾蟹类的 CHH 分为 2 个亚群 : 螯虾下目 ( 犎. 犵犪犿 犿犪狉狌狊, 犎. 犪犿犲狉犻犮犪狀狌狊, 犗. 犾犻犿狅狊狌狊 ) 龙虾下目 ( 犖. 狀狅狉 狏犲犵犻犮狌狊 ) 真虾下目 ( 犕. 犾犪狀犮犺犲狊狋犲狉犻, 犕. 狀犻狆狆狅狀犲狀狊犲 ) 的 CHH 属于一个亚群, 短尾下目 ( 犆. 犿犪犲狀犪狊, 犆. 狆狉狅犱狌犮 狋狌狊, 犛. 狅犾犻狏犪犮犲犪, 犘. 狆犲犾犪犵犻犮狌狊, 犌. 狀犪狋犪犾犻狊 ) 的 CHH 则属于另一个亚群, 这些物种的 CHH 基因的进化关系与 [26] 甲壳动物分类系统一致 进化分析表明氨基酸序 [6] 列同源性较高的物种间 CHH 基因功能类似 此外, 大多数虾蟹的 CHH 形成各自下目的分支结构, 表明 CHH 基因序列的演变可能随着不同门类甲壳动物的独自进化后产生 在十足目虾蟹 CHH 的进化分支中有 5 处 boost strap 值低于 50%, 这可能是由于参考比对的物种均属于不同下目分类, 如日本沼虾 罗氏沼虾 热液口虾属于真虾下目, 而螯龙虾 利莫斯螯虾属螯虾下目, 挪威海螯虾属于龙虾下目 研究发现,CHH 家族神经多肽激素 CHH 的系统演化与口虾蛄的酚氧化酶 (propo) 氨基酸序列在甲壳动物中聚类分析结果一 [18] 致 随着越来越多的甲壳动物 CHH 基因序列全长被克隆, 更为全面和准确的系统发育分析将成为可能 4.3 犆犎犎基因组织表达差异 CHH 是甲壳动物眼柄器官中含量丰富且研究最 [12] [27] 多神经肽激素 在斑节对虾和罗氏沼虾的眼柄中均检测到大量的 CHH 神经肽, 而在红斑青蟹眼柄 [14] 神经节中也检测出很高的 CHH 基因表达量, 在其它甲壳动物以眼柄为中心的中枢系统中 CHH 基因表达量均较高 其他组织中 CHH 基因的表达情况因物种不同存在差异, 如拟穴青蟹和日本鑚肠 肝胰腺组织中 CHH 基因均有较高表达, 而日本沼虾肠 [9,28 29] 肝胰腺组织中 CHH 基因表达量均较低 在对日本沼虾 CHH 基因表达荧光定量检测中发现, CHH 基因在眼柄中的表达量最高, 精巢次之, 在卵巢中的表达量最低, 作者推测 CHH 基因可能与雄性生 [9] 殖过程相关 ; 在日本鑚 CHH 基因表达荧光定量检测中,CHH 基因在精巢中也有较高表达, 作者同样认 [29] 为 CHH 可能与甲壳动物雄性发育密切相关 本文研究结果表明,CHH 基因在口虾蛄精巢中不表达, 分析可能原因有二 : 一方面与物种本身存在差异有关, 如通过半定量检测 CHH 基因在三疣梭子蟹 ( 犘狅狉狋狌狀狌狊狋狉犻狋狌犫犲狉犮狌犾犪狋狌狊 ) 各组织中表达情况, 结果表明, 在 CHH 基因在 XO SG 胸神经节 腹神经节 Y 器和肠中表达, 而在视网膜 心 精巢 卵巢 肌肉 脑 [30] 腮和肝胰腺等组织中不表达 另一方面与 CHH 存在多种构型现象有关, 如罗氏沼虾眼柄中存在两种 CHHcDNA 构型, 分别为 CHH 与 CHH Ⅰ CHH 构型含有 3 个外显子 (Ⅰ Ⅱ 和 Ⅳ), 只在眼柄当中表达 ; 而
10 6 期刘海映等 : 口虾蛄高血糖激素基因全长 cdna 的克隆及表达分析 107 CHH Ⅰ 构型则含有全部 4 个外显子, 并且可以在心脏 腮 触角腺和胸神经节当中检测到 这一结果表明,CHH 基因在转录过程中不同的剪接方式可以导致产生不同的 CHH 构型, 进而翻译成不同构型的 [31] CHH 多肽, 在不同组织发挥多种生理功能, 比如 [14] Choi 等克隆了红斑青蟹眼柄的 CHH 1 基因及类 CHH 激素源前体基因, 发现 CHH 1 基因仅在眼柄神经中枢中表达, 而类 CHH 激素源前体基因在胸神经节 腹神经节 脑中表达, 而在眼柄神经中枢中不表达 在以后的研究中, 可对不同繁殖时期口虾蛄 CHH 基因组进行研究, 以分析 CHHcDNA 不同构型, 从而探讨该基因不同组织表达特异性机制 5 结论 本研究首次克隆得到口虾蛄 CHH 基因全长 cd NA 序列, 并对其氨基酸结构特征进行了同源分析和探讨, 结果表明 CHH 序列相对保守, 与其他十足目动物氨基酸序列结构一致 研究结果为口虾蛄 CHH 多肽相关功能性研究奠定基础, 同时也为其他甲壳类动物 CHH 基因的研究及系统演化提供借鉴 参考文献 : [1] LiuLei,LauferH,WangYajun,etal.Aneurohormoneregulatingbothmethylfarnesoatesynthesisandglucosemetabolisminacrustacean[J].Bio chemicalandbiophysicalresearchcommunications,1997,237(3): [2] TangChenhui,LuWeiqun,WainwrightG,etal.Molecularcharacterizationandexpressionofmandibularorgan inhibitinghormone,arecentlydis coveredneuropeptideinvolvedintheregulationofgrowthandreproductioninthecrabcancerpagurus[j].biochemicaljournal,1999,343(2): [3] KelerR.Crustaceanneuropeptides:structures,functionsandcomparativeaspects[J].Experientia,1992,48(5): [4] 蔡生力. 甲壳动物内分泌学研究与展望 [J]. 水产学报,1998,22(2): CaiShengli.Areviewofcrustaceanendocrinology[J].JournalofFisheriesofChina,1998,22(2): [5] DeKleijnDPV,VanHerpF.MolecularbiologyofneurohormoneprecursorsintheeyestalkofCrustacea[J].ComparativeBiochemistryandPhys iologypartb:biochemistryandmolecularbiology,1995,112(4): [6] LacombeC,GrèveP,MartinG.Overviewonthesub groupingofthecrustaceanhyperglycemichormonefamily[j].neuropeptides,1999,33(1): [7] 杨济芬, 朱冬发, 沈建明, 等. 甲壳动物高血糖激素家族生理功能研究进展 [J]. 动物学杂志,2009,44(1): YangJifen,ZhuDongfa,ShenJianming,etal.Physiologicalsignificanceofcrustaceanhyperglycemichormonefamily[J].ChineseJournalofZoolo gy,2009,44(1): [8] KelerR.Crustaceanneuropeptides:structures,functionsandcomparativeaspects[J].Experientia,1992,48(5): [9] 金舒博, 王宁, 乔慧, 等. 青虾高血糖激素基因全长 cdna 序列的克隆及表达分析 [J]. 中国水产科学,2013,20(1): JinShubo,WangNing,QiaoHui,etal.MolecularcloningandexpressionofafullengthcDNAencodingcrustaceanhyperglycemichormone(CHH) inorientalriverpawn( 犕犪犮狉狅犫狉犪犮犺犻狌犿狀犻狆狆狅狀犲狀狊犲 )[J].JournalofFisherySciencesofChina,2013,20(1): [10] DeKleijnDPV,DeLeeuwEPH,VandenBergMC,etal.CloningandexpressionoftwomRNAsencodingstructuralydiferentcrustaceanhy perglycemichormoneprecursorsinthelobster 犎狅犿犪狉狌狊犪犿犲狉犻犮犪狀狌狊 [J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-GeneStructureandExpression, 1995,1260(1): [11] 王艳华, 张亦陈, 孙妍, 等. 中华绒螯蟹高血糖激素基因的克隆和分子结构解析 [J]. 水产学报,2013,37(7): WangYanhua,ZhangYichen,SunYan,etal.Cloningandmolecularstructureanalysisofcrustaceanhyperglycemichormone(Ers CHH)in 犈狉犻狅 犮犺犲犻狉狊犻狀犲狀狊犻狊 [J].JournalofFisheriesofChina,2013,37(7): [12] WiwegweawA,UdomkitA,PanyimS.Molecularstructureandorganizationofcrustaceanhyperglycemichormonegenesof 犘犲狀犪犲狌狊犿狅狀狅犱狅狀 [J]. JournalofBiochemistryandMolecularBiology,2004,37(2): [13] GuPeili,YuKeili,ChanSM.Molecularcharacterizationofanadditionalshrimphyperglycemichormone:cDNAcloning,geneorganization,expres sionandbiologicalassayofrecombinantproteins[j].febsleters,2000,472(1): [14] ChoiCY,ZhengJunying,WatsonRD.MolecularcloningofacDNAencodingacrustaceanhyperglycemichormonefromeyestalkgangliaofthe bluecrab, 犆犪犾犻狀犲犮狋犲狊狊犪狆犻犱狌狊 [J].GeneralandComparativeEndocrinology,2006,148(3): [15] 王春琳, 母昌考, 丁爱侠, 等. 口虾蛄 ( 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 ) 同工酶的组织特异性及生化遗传分析 [J]. 海洋与湖沼,2004,35(3): WangChunlin,MuChangkao,DingAixia,etal.Tissuespecificityandbiochemicalgeneticanalysisofisozymeoncrustacean 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 [J].OceanologiaetLimnologiaSinica,2004,35(3): [16] 宋微微, 王春琳, 母昌考. 用同工酶和 RAPD 技术分析黑斑口虾蛄的遗传多样性 [J]. 水产科学,2006,25(4): SongWeiwei,WangChunlin,MuChangkao.Geneticdiversityinmantisshrimp 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪犽犲犿狆犻 byisozymeandrapdanalysis[j].fisheries Science,2006,25(4): [17] 黄映萍, 王莹, 苗素英. 粤东海域口虾蛄遗传多样性 [J]. 动物学杂志,2011,46(2): HuangYingping,WangYing,MiaoSuying.Geneticdiversityanalysisofmantisshrimps( 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 )fromtheeasterncoastofguang
11 108 海洋学报 38 卷 dongprovince[j].chinesejournalofzoology,2011,46(2): [18] 刘海映, 刘连为, 姜玉声, 等. 口虾蛄 propo 基因全长 cdna 的克隆与组织表达 [J]. 生态学报,2013,33(6): LiuHaiying,LiuLianwei,JiangYusheng,etal.FullengthcDNAcloningandtissueexpressionofprophenoloxidasefrom 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 [J].ActaEcologicaSinica,2013,33(6): [19] TamuraK,DudleyJ,NeiM,etal.MEGA4:molecularevolutionarygeneticsanalysis(MEGA)softwareversion4.0[J].MolecularBiologyand Evolution,2007,24(8): [20] ThompsonJD,GibsonTJ,PlewniakF,etal.TheCLUSTAL_Xwindowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedby qualityanalysistools[j].nucleicacidsresearch,1997,25(24): [21] DaveyM,DuveH,ThorpeA,etal.Characterisationofthehelicostatinpeptideprecursorgenefrom 犎犲犾犻犮狅狏犲狉狆犪犪狉犿犻犵犲狉犪 (Lepidoptera:Noctu idae)[j].insectbiochemistryandmolecularbiology,1999,29(12): [22] B ckingd,dircksenh,kelerr.thecrustaceanneuropeptidesofthechh/mih/gihfamily:structuresandbiologicalactivities[m]//wiese K.TheCrustaceanNervousSystem.BerlinHeidelberg:Springer,2002: [23] LeeKJ,DoranR M,MyklesDL.Crustaceanhyperglycemichormonefromthetropicallandcrab, 犌犲犮犪狉犮犻狀狌狊犾犪狋犲狉犪犾犻狊 :Cloning,isoforms,andtis sueexpression[j].generalandcomparativeendocrinology,2007,154(1/3): [24] KegelG,ReichweinB,TensenCP,etal.Aminoacidsequenceofcrustaceanhyperglycemichormone(CHH)fromthecrayfish, 犗狉犮狅狀犲犮狋犲狊犾犻犿狅狌 狊狌狊 :emergenceofanovelneuropeptidefamily[j].peptides,1991,12(5): [25] KatayamaH,OhiraT,NagataS,etal.Structure activityrelationshipofcrustaceanmolt inhibitinghormonefromthekurumaprawn 犕犪狉狊狌狆犲狀犪犲 狌狊犼犪狆狅狀犻犮狌狊 [J].Biochemistry,2004,43(30): [26] 刘瑞玉. 现生甲壳动物 (CRUSTACEAN) 最新分类系统 简介 [C]// 中国甲壳动物学会. 甲壳动物学论文集 ( 第四辑 ). 北京 : 科学出版社, 2003: LiuRuiyu.Introductionof AnupdatedclassificationoftherecentCRUSTACEAN [C]//TheChineseSocietyofCrustaceans.Transactionsof thechinesecrustaceansociety(Ⅳ).beijing:sciencepress,2003: [27] SithigorngulP,PanchanN,VilaivanT,etal.Immunochemicalanalysisandimmunocytochemicallocalizationofcrustaceanhyperglycemichormone fromtheeyestalkof 犕犪犮狉狅犫狉犪犮犺犻狌犿狉狅狊犲狀犫犲狉犵犻 [J].ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartB:BiochemistryandMolecularBiology,1999, 124(1): [28] 舒妙安, 张龙韬, 周宇芳, 等. 拟穴青蟹 ( 犛犮狔犾犪狆犪狉犪犿犪犿狅狊犪犻狀 ) 两种 Ⅰ 型高血糖激素基因全长 cdna 的克隆及组织表达分析 [J]. 海洋与湖沼,2012,43(4): ShuMiaoan,ZhangLongtao,ZhouYufang,etal.CloningandexpressionoftwogenesencodingtypeⅠcrustaceanhyperglycemichormonefamily fromthemudcrab 犛犮狔犾犪狆犪狉犪犿犪犿狅狊犪犻狀 [J].OceanologiaetLimnologiaSinica,2012,43(4): [29] 汤洁, 朱冬发, 崔晓雨, 等. 日本鑚高血糖激素基因的克隆与表达分析 [J]. 生物学杂志,2014,31(4): TangJie,ZhuDongfa,CuiXiaoyu,etal.Cloningandexpressionanalysisofcrustaceanhyperglycemichormone(CHH)in 犆犺犪狉狔犫犱犻狊犼犪狆狅狀犻犮犪 [J]. JournalofBiology,2014,31(4): [30] 杨济芬. 三疣梭子蟹 ( 犘狅狉狋狌狀狌狊狋狉犻狋狌犫犲狉犮狌犾犪狋狌狊 ) 高血糖激素基因的克隆与分析 [D]. 宁波 : 宁波大学,2010. YangJifen.MolecularcloningandexpressionanalysisofCrustacean HyperglycemicHormonefromswimmingcrab ( 犘狅狉狋狌狀狌狊狋狉犻狋狌犫犲狉犮狌犾犪狋狌狊 ) [D].Ningbo:NingboUniversity,2010. [31] ChenSH,LinCY,KuoC M.Cloningoftwocrustaceanhyperglycemichormoneisoformsinfreshwatergiantprawn( 犕犪犮狉狅犫狉犪犮犺犻狌犿狉狅狊犲狀犫犲狉 犵犻 ):evidenceofalternativesplicing[j].marinebiotechnology,2004,6(1): 犕狅犾犲犮狌犾犪狉犮犾狅狀犻狀犵犪狀犱犲狓狆狉犲狊犻狅狀狅犳犪犳狌犾犾犲狀犵狋犺犮犇犖犃狅犳犲狀犮狅犱犻狀犵犮狉狌狊狋犪犮犲犪狀犺狔狆犲狉犵犾狔犮犲犿犻犮犺狅狉犿狅狀犲 ( 犆犎犎 ) 犻狀犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 LiuHaiying 1,ZhangXiuqin 1,SuiYouzhen 1,LiHongjun 2,XingKun 1,JiangYusheng 3, YangGuifu 1,ChenLei 1,ZhangNa 1 (1. 犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犕犪狉犻狀犲犅犻狅 狉犲狊狅狌狉犮犲狊犚犲狊狋狅狉犪狋犻狅狀犪狀犱犎犪犫犻狋犪狋犚犲狆犪狉犪狋犻狅狀犻狀犔犻犪狅狀犻狀犵犘狉狅狏犻狀犮犲, 犇犪犾犻犪狀犗犮犲犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犇犪犾犻犪狀 , 犆犺犻狀犪 ;2. 犖犪狋犻狅狀犪犾犕犪狉犻狀犲犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犪犾犕狅狀犻狋狅狉犻狀犵犆犲狀狋犲狉, 犇犪犾犻犪狀 , 犆犺犻狀犪 ;3. 犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犕犪狉犻犮狌犾 狋狌狉犲牔犛狋狅犮犽犈狀犺犪狀犮犲犿犲狀狋犻狀犖狅狉狋犺犆犺犻狀犪 狊犛犲犪, 犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲, 犇犪犾犻犪狀犗犮犲犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犇犪犾犻犪狀 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :TotalRNAineyestalkof 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 wasextractedandcdnasequenceofcrustaceanhypergly cemichormone(chh)wereobtainedbyraceforthefirsttime.theresultshowedthatthefullengthofthe
12 6 期刘海映等 : 口虾蛄高血糖激素基因全长 cdna 的克隆及表达分析 109 CHHgeneis2421bp,containingan180bp5 untranslatedregion(utr),and1821bp3 UTR,and420bpopen readingflame(orf)whichencoded139aminoacids.predictionofproteinstructurewascomposedof23.74% α helix,23.02%extensionchain,53.24%randomcoil,anditsmolecularmassis15470daltonswithanestimated 狆犐 of7.049.thematurepeptidecontainedsixconservedcysresiduesinchhfamily.thec terminusmaturepeptide wasgkwhichhasthesamecharacteristicswithes CHH.Basedonproteinsimilaritycomparison,theseparated CHHgenewasclassifiedintothetypeICHHfamilyofpeptides.PhylogeneticanalysisshowedthatCHH of 犗. 狅狉犪狋狅狉犻犪 andchhofdecapodspeciesformedtwosubgroupsonthesamebranchofthetree.therelativeex pressionofchhgeneindiferentorganizationswastestedbyrealtimefluorescentquantitativepcr,theexpres sionwashighestintheintestine,andthentheeyestalk,antennaandbrain,theexpressionisnegligibleinmuscleand ovary,andnoexpressionintestis. 犓犲狔狑狅狉犱狊 : 犗狉犪狋狅狊狇狌犻犾犪狅狉犪狋狅狉犻犪 ;crustaceanhyperglycemichormone;molecularcloning;rt PCR;expression analysis
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西班牙文学简史
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26 (130) 27 (133) 28 (136) 29 (140) (143) 30 (143) 31 (147) 32 (152) 33 (159) 34 (164) 35 (167) 36 (170) 37 (176) 2005 ( ) (181) (183)
(001) (003) 1 (003) 2 (007) 3 (012) 4 (017) 5 (021) 6 (026) 7 (031) (037) 8 (037) 9 (044) 10 (053) 11 (059) 12 (065) 13 (068) (073) 14 (073) 15 (078) 16 (084) 17 (090) 18 (095) (099) 19 (099) 20 (103)
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中学第二教材：高中语文：选修：语言规范与创新：配套江苏版教材
(1 ) (1 ) (18) : (18) (28) (28) (40) (40) (52) (52) (63) (63) (63) (72) (72) (77) (77) (85) (85) (92) (92) (101) 1 ,,,,,,,400,, 1300,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 1., : :,,,,,,,,, :(1),,,, (2),, (3) (4), :,, 2.
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前 言 本标准的附录 A 为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准由中华人民共和国上海出入境检验检疫局负责起草 本标准主要起草人 : 倪昕路 韩丽 周瑶 郭德华 朱坚 本标准系首次发布的检验检疫行业标准 Ⅰ
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖 / 犜 2326 2009 食品及油脂中反式脂肪酸含量的检测傅立叶变换红外光谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犳犪狋狔犪犮犻犱狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犪狀犱狅犻犾狊 犉犜犐犚犿犲狋犺狅犱 2009 07 07 发布 2010 01 16 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前 言 本标准的附录 A 为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口
JournalofSoiland WaterConservation Vol.31No.6 Dec.,2017 * * /b-; ]^ $ - 1,. / 2,0 1 1, 3, 2 (1.2_8 1 G ; ]" # : X, ; 2.?, ;
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316 201712 JournalofSoiland WaterConservation Vol.31No.6 Dec.,2017 * * /b-; ]^ $ - 1,. / 2,0 1 1, 3, 2 (1.2_8 1 G ; ]" # : X,17 210098; 2.?, - 213300;3.F GD! 9, - F 225007) 01: #$ Q 3 ' ; 45 \, PT ` Q
前 言 本标准的附录 A 附录 B 和附录 C 为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位 : 中华人民共和国山西出入境检验检疫局 本标准主要起草人 : 薛平 连庚寅 宋欢 苑利 杜利君 潘雅丽 宋洁 康杰 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准 Ⅰ
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖 / 犜 2115 2008 进出口食品和饲料中总氮及粗蛋白的检测方法杜马斯燃烧法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲狋狅狋犪犾狀犻狋狉狅犵犲狀犮狅狀狋犲狀狋犪狀犱犮犪犾犮狌犾犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犮狉狌犱犲狆狉狅狋犲犻狀犮狅狀狋犲狀狋犻狀犳狅狅犱犪狀犱犳犲犲犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋 犆狅犿犫狌狊狋犻狅狀犪犮犮狅狉犱犻狀犵狋狅狋犺犲犇狌犿犪狊狆狉犻狀犮犻狆犾犲
前 言 本标准的附录 A 附录 B 和附录 C 为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位 : 中华人民共和国山西出入境检验检疫局 本标准主要起草人 : 薛平 连庚寅 宋欢 苑利 杜利君 潘雅丽 宋洁 康杰 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准 Ⅰ
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖 / 犜 2115 2008 进出口食品和饲料中总氮及粗蛋白的检测方法杜马斯燃烧法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲狋狅狋犪犾狀犻狋狉狅犵犲狀犮狅狀狋犲狀狋犪狀犱犮犪犾犮狌犾犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犮狉狌犱犲狆狉狅狋犲犻狀犮狅狀狋犲狀狋犻狀犳狅狅犱犪狀犱犳犲犲犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋 犆狅犿犫狌狊狋犻狅狀犪犮犮狅狉犱犻狀犵狋狅狋犺犲犇狌犿犪狊狆狉犻狀犮犻狆犾犲
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325 201810 JournalofSoiland WaterConservation Vol.32No.5 Oct.,2018 3 ; *+4@ I Q *.,/01,,,, 2,! 3, 4,5 ( 3 ;, 611130) : 5\ _^J _IM L D a V, L.? K $ 9 a 9 R V _ I. >V 3 1 MD a \:(1)3 3 (>0.25mm), _` J _
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前 言 本标准按照 GB/T 给出的规则起草 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位 : 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 中华人民共和国陕西出入境检验检疫局 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局 本标准主要起草人 : 王建华 汤志旭 孙忠松 王艳丽 王松 李
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖 / 犜 2646 2010 进出口食品中吡螨胺残留量检测方法气相色谱 质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋犲犫狌犳犲狀狆狔狉犪犱狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋 犌犆 犕犛犿犲狋犺狅犱 2010 11 01 发布 2011 05 01 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前 言 本标准按照 GB/T1.1
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前 言 本标准的附录 A 附录 B 和附录 C 均为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位 : 中华人民共和国湖南出入境检验检疫局 本标准主要起草人 : 颜鸿飞 张莹 孙菲 胡宇东 黄志强 付善良 李拥军 王美玲 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准 Ⅰ
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 动物源食品中乙氧喹啉残留量的测定方法高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犲狋犺狅狓狔狇狌犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀 犎犘犔犆犿犲狋犺狅犱 2010 03 02 发布 2010 09 16 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前 言 本标准的附录 A 附录 B 和附录 C 均为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口
犠狅狉犱狊犪狀犱犛犲狀狋犲狀犮犲狊词汇与句型注 : 带 部分为 三会 内容 ( 会听 会说 会认读 ), 其他为 四会 内容 ( 会听 会说 会认读 会默写 ); 句型中的画线部分为可替换的内容 犱狅犮狋狅狉医生犺犲犪狉狋心脏犺狅狊狆犻狋犪犾医院 犻犾生病的犿犲犱犻犮犻狀犲药狀狌狉狊犲护士 狊犺狅狋
Unit3 WHEN IGROW UP 乐学单元 亲爱的同学们, 每个人都有梦想, 每个人都对未来从事的职业有一种期待, 你梦想的职业是什么呢? 我们常听到的职业有医生 护士 消防员 警察 飞行员和宇航员 那么他们都做哪些具体的工作呢? 你了解吗? 在这个单元, 他们中的一些代表会走近你, 并告诉你他们的日常生活 让我们赶快一起去看看吧 还有, 当你了解他们的具体工作后, 你是否还坚持你的梦想职业,
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前 言 本标准的附录 A 和附录 B 均为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位 : 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局 中华人民共和国重庆出入境检验检疫局 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 本标准主要起草人 : 刘永 杨长志 王国民 康庆贺 林维宣 李贤良 吴
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的检测方法液相色谱 质谱 / 质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狌狉狅狋狉狅狆犻狀犲狉犲狊犻犱狌犲犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳狊狅犳 犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋 犔犆 犕犛 / 犕犛犿犲狋犺狅犱 2008 11 18 发布 2009 06 01 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前
前 言 本标准按照 GB/T 给出的规则起草 本标准代替 SN 出口肉及肉制品中甲萘威残留量检验方法 本标准与 SN 相比, 主要技术变化如下 : 样品净化方法采用全自动凝胶渗透色谱净化方法替代原有的液液分配法 ; 测定采用柱后衍生液相色谱 荧光检
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖 / 犜 0122 2011 代替 SN0122 1992 进出口肉及肉制品中甲萘威残留量检验方法液相色谱 柱后衍生荧光检测法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犪狉犫犪狉狔犾狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犲犪狋犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮狋狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱 犲狓狆狅狉狋 犎犘犔犆 犳犾狌狅狉犲狊犮犲犱犲狋犲犮狋狅狉狑犻狋犺狆狅狊狋犮狅犾狌犿狀犱犲狉犻狏犪狋犻狅狀
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前 言 本标准的附录 A 为规范性附录, 附录 B 和附录 C 为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准由中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 中华人民共和国浙江出入境检验检疫局 中国检验检疫科学研究院 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局负责起草 本标准主要起草人 : 林维
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 进出口动物源性食品中糖皮质激素类兽药残留量的检测方法液相色谱 质谱 / 质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犵犾狌犮狅犮狅狉狋犻犮狅狊狋犲狉狅犻犱狊狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳狊狅犳 犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋 犔犆 犕犛 / 犕犛犿犲狋犺狅犱 2008 11 18 发布 2009 06 01 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
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,2016,36(10):2094-2102 犃犮狋犪犅狅狋. 犅狅狉犲犪犾. 犗犮犮犻犱犲狀狋. 犛犻狀. :1000 4025(2016)10 2094 09 犱狅犻 :10.7606/j.issn.1000 4025.2016.10.2094 "#$%&' ( )*+,-./01 1, 2, 1, 2, 2, 2 (1 )=! >?, 518035;2 > @ A B C D, ( E E F,
批发零售业实用英语对话及词汇手册
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中考英语命题趋势与总复习策略 ( ),, (1), ; (2) ; (3) ; (4) ; (5),, ; (6), 2, (1) 120 ; (2) 120 ; (3), ; (4), 6~8, 80~90 ; (5), 1,2 1 ( ) 15% 18% 22% 30%
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标准分享网 免费下载 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 进出口动物源食品中 14 种 β 内酰 胺类抗生素残留量检测方法 液相色谱 质谱 / 质谱法 SN/T 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街 16 号 邮政编码 : 网址 www
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 进出口动物源食品中 14 种 β 内酰胺类抗生素残留量检测方法液相色谱 质谱 / 质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳 14 犫犲狋犪 犾犪犮狋犪犿犪狀狋犻犫犻狅狋犻犮狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犲狓狆狅狉狋犪狀犱犻犿狆狅狉狋 犔犆 犕犛 / 犕犛犿犲狋犺狅犱 2008 04 29 发布 2008 11 01 实施
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156 控制算法 ( 即模糊逻辑或神经网络 ) 这两种方式来研 [1] 究泊车. 犑犪犿犻犾设计出一种泊车辅助器 可帮助驾驶员方便安全地泊车 但在实现泊车的全自动方面有待改进. 文献 [2-3] 分别基于模糊逻辑控制进行泊车系统研究 逻辑控制依赖于人的操作知识 因此 [4] 需要大量的泊车实验. 刘
![156 控制算法 ( 即模糊逻辑或神经网络 ) 这两种方式来研 [1] 究泊车. 犑犪犿犻犾设计出一种泊车辅助器 可帮助驾驶员方便安全地泊车 但在实现泊车的全自动方面有待改进. 文献 [2-3] 分别基于模糊逻辑控制进行泊车系统研究 逻辑控制依赖于人的操作知识 因此 [4] 需要大量的泊车实验. 刘](/thumbs/52/29734531.jpg "156 控制算法 ( 即模糊逻辑或神经网络 ) 这两种方式来研 [1] 究泊车. 犑犪犿犻犾设计出一种泊车辅助器 可帮助驾驶员方便安全地泊车 但在实现泊车的全自动方面有待改进. 文献 [2-3] 分别基于模糊逻辑控制进行泊车系统研究 逻辑控制依赖于人的操作知识 因此 [4] 需要大量的泊车实验. 刘")
上海理工大学学报 第 37 卷 第 2 期 犑. 犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犺犪狀犵犺犪犻犳狅狉犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔 犞狅犾.37 犖狅.2 2015 文章编号 :1007-6735(2015)02-0155-04 犇犗犐 :10.13255/ 犼. 犮狀犽犻. 犼狌狊狊狋.2015.02.011 基于模糊算法垂直泊车转向控制策略的研究 王友楠 方祖华 孙鍴 王康 徐宏兵 ( 上海师范大学信息与机电工程学院
11 ', : VW 781 b cbco 9ST :); 1.1 V W +! " -. / 0,_ W 70%! " C -. / 0 =, BJ cfu/g :; D E < $ , F 5G,H:
38 11 Vol.38No.11 201711 ActaEcologiaeAnimalisDomastici Nov.2017!"#$ %&' () *+, 1, 1, 1, 1, 1, 1,! 2,"#$ 1,%&' 1 (1.!"#$%&', 350002; 2. ()*+,-./0, 351100) [-.] ()*+,-./01 23456789:;
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68 犫犲犪狀狑犻犾狋狏犻狉狌狊 (BBWV) 是危害蚕豆的主要病毒, 该病毒为豇豆花叶病毒科犆狅犿狅狏犻狉犻犱犪犲蚕豆病毒属 犉犪犫犪狏犻狉狌狊的典型种, 其基因组由 2 条单链 RNA 分子组成, 分别是 6.0kb 的 RNA1 和 3.6kb 的 RNA2 BBWV 有 2 种血清型, 依据
犘犾犪狀狋犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀 蚕豆萎蔫病毒 2 号安徽分离物全基因组序列测定与分析 严丹侃 1, 郑红英 2, 张海珊 1, 沈艳 1, 顾江涛 1, 章东方 1, 燕飞 2 摘要 (1. 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所, 合肥 230031; 2. 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所, 杭州 310021) 利用酶联免疫和 RT PCR 技术对采自安徽地区的蚕豆病株进行检测,
,2017,37(10): 犃犮狋犪犅狅狋. 犅狅狉犲犪犾. 犗犮犮犻犱犲狀狋. 犛犻狀. : (2017) 犱狅犻 : /j.issn "#$%&' ( )* "#+,-./0 1,2,
,2017,37(10):2087-2096 犃犮狋犪犅狅狋. 犅狅狉犲犪犾. 犗犮犮犻犱犲狀狋. 犛犻狀. :1000 4025(2017)10 2087 10 犱狅犻 :10.7606/j.issn.1000 4025.2017.10.2087 "#$%&' ( )* "#+,-./0 1,2, 1, 1, 1, 1,2, 1,2 (1 34567 89:,; 611130;2 34567 #$,;
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胱抑素 C 水平的测定在 2 型糖尿病肾功能评价中的应用 刘传勇, 古东海, 周丽华, 等 814 临床研究 综 16SrRNAPCR 基因测序鉴定临床标本军团菌 宣瑞红, 王娟, 胡朝晖, 等 816 核酸扩增检测技术在血液筛查中的应用 张健, 谢秀华, 黄呈辉, 等 818 胱抑素 C 测定评价
国际检验医学杂志 INTERNATIONALJOURNALOFLABORATORY MEDICINE 月刊 1980 年 1 月创刊第 31 卷第 8 期 2010 年 8 月 30 日出版 主 主 管 重庆市卫生局 办 重庆市卫生信息中心 ( 重庆市药品集中采购服务中心 ) 编辑 出版 总编 国际检验医学杂志编辑委员会 重庆市卫生信息中心 府伟灵 执行总编 徐永柱 编辑部主任 杨庆华 通讯地址 5
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第 6期王晓茜等 : 四川省德阳贫困农村糖尿病及代谢综合征的流行病学调查 157 糖尿病是一组以慢性血糖水平增高为主要特征的代谢性疾病, 可严重影响居民的生命健康和生存质量 为了推进中国糖尿病防治工作的进行 促进相关政策的落实 探讨适宜中国农村地区的糖尿病综合防治工作模式, 故对四川省经济相对不发达
实用临床医药杂志 156 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犆犾犻狀犻犮犪犾犕犲犱犻犮犻狀犲犻狀犘狉犪犮狋犻犮犲 2015 年第 19 卷第 6期 调查研究 四川省德阳贫困农村糖尿病及代谢综合征的流行病学调查 王晓茜 1, 鲁丹 1, 李胜勇 2, 周武强 3, 王森 1, 邓清容 1, 魏小燕 1, 刘娅 1 (1. 四川省德阳市人民医院内分泌科, 四川德阳,618000; 2. 四川省中江县人民医院医教科, 四川中江,618100;
中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 进出口食品中生物苄呋菊酯 氟丙菊酯 联苯菊酯等 28 种农药残留量的检测方法气相色谱 质谱法 SN/T 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街 16 号邮政编码 : 网址 电话 :
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖 / 犜 2151 2008 进出口食品中生物苄呋菊酯 氟丙菊酯 联苯菊酯等 28 种农药残留量的检测方法气相色谱 质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狆犲狊狋犻犮犻犱犲狊狉犲狊犻犱狌犲狅犳 28 犽犻狀犱狊狅犳犻狀犮犾狌犱犻狀犵犫犻狅狉犲狊犿犲狋犺狉犻狀 犪犮狉犻狀犪狋犺狉犻狀 犫犻犳犲狀狋犺狉犻狀犻狀犳狅狅犱犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋 犌犪狊犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔
670 西安交通大学学报 ( 医学版 ) 第 34 卷 胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤 我国胃癌每 [1] 年死亡人数居恶性肿瘤的首位 胃癌起病隐匿, 早期无明显特异症状, 一旦发现已属中晚期 目前胃癌的主要治疗手段仍为手术及化疗, 但很难得到根治, 且均存在较大副作用 因此, 寻找治疗胃癌新的药物和
![670 西安交通大学学报 ( 医学版 ) 第 34 卷 胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤 我国胃癌每 [1] 年死亡人数居恶性肿瘤的首位 胃癌起病隐匿, 早期无明显特异症状, 一旦发现已属中晚期 目前胃癌的主要治疗手段仍为手术及化疗, 但很难得到根治, 且均存在较大副作用 因此, 寻找治疗胃癌新的药物和](/thumbs/91/106824580.jpg "670 西安交通大学学报 ( 医学版 ) 第 34 卷 胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤 我国胃癌每 [1] 年死亡人数居恶性肿瘤的首位 胃癌起病隐匿, 早期无明显特异症状, 一旦发现已属中晚期 目前胃癌的主要治疗手段仍为手术及化疗, 但很难得到根治, 且均存在较大副作用 因此, 寻找治疗胃癌新的药物和")
第 34 卷第 5 期 2013 年 9 月 西安交通大学学报 ( 医学版 ) 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犡犻 犪狀犑犻犪狅狋狅狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔 ( 犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊 ) 犞狅犾.34 犖狅.5 犛犲狆.2013 散癖平胃方剂对人胃癌细胞株增殖和凋亡的影响 姜炅 1, 董蕾 1, 秦斌 1, 郭晓燕 1, 王新阳 2, 李红 1 ( 西安交通大学医学院 :1. 第二附属医院消化科, 陕西西安
2013(5) 谢景欣, 等 : 负压二级生物安全实验室设计关键控制点分析 39 物安全柜可靠性的考虑, 希望室内呈负压洁净状态 目前, 越来越多的单位建造了负压状态的二级生物安全实验室 但由于缺乏相关标准规范, 许多建设与设计单位对负压实验室的设计理念含混不 [12] 清, 致使工程缺陷较多 本文
![2013(5) 谢景欣, 等 : 负压二级生物安全实验室设计关键控制点分析 39 物安全柜可靠性的考虑, 希望室内呈负压洁净状态 目前, 越来越多的单位建造了负压状态的二级生物安全实验室 但由于缺乏相关标准规范, 许多建设与设计单位对负压实验室的设计理念含混不 [12] 清, 致使工程缺陷较多 本文](/thumbs/51/27347415.jpg "2013(5) 谢景欣, 等 : 负压二级生物安全实验室设计关键控制点分析 39 物安全柜可靠性的考虑, 希望室内呈负压洁净状态 目前, 越来越多的单位建造了负压状态的二级生物安全实验室 但由于缺乏相关标准规范, 许多建设与设计单位对负压实验室的设计理念含混不 [12] 清, 致使工程缺陷较多 本文")
38 暖通空调犎犞牔犃犆 2013 年第 43 卷第 5 期科学实验室环境控制 负压二级生物安全实验室设计关键控制点分析 江苏省疾病预防控制中心谢景欣 王欢王建锋杨杰 摘要以两个负压二级生物安全实验室为例, 分析了实验室的功能分区与平面布局 通风空调方式 气流组织 送排风系统等关键控制点的设计 建议核心工作间 ( 动物室 ) 划分相对清洁侧和相对污染侧 ; 设置缓冲间 更衣室和准备间 ; 通风空调采用全空气直流系统
宝鸡文理学院学报 ( 自然科学版 ) 征稿细则 (J.BaojiUniv.Arts& Sci.(Nat.Sci.Ed.)) 宝鸡文理学院学报 ( 自然科学版 ) (J.BaojiUniv.Arts & Sci.(Nat.Sci.Ed.)) 是由宝鸡文理学院主办的综合性自然科学学术季刊, 是中国高校特
BAOJIWENLIXUEYUAN XUEBAO ZIRAN KEXUEBAN ISSN10071261 CODENBWZKFL 宝鸡文理学院学报 犑犗犝犚犖犃犔犗犉犅犃犗犑犐犝犖犐犞犈犚犛犐犜犢犗犉犃犚犜犛犃犖犇犛犆犐犈犖犆犈犛 自然科学版 犖犪狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲犈犱犻狋犻狅狀 主管单位 主办单位 陕西省教育厅 宝鸡文理学院 中国高校特色科技期刊中国期刊方阵双效期刊中国核心期刊 ( 遴选 )
社会 狀狅狋狅狏犲狉狔犲狋. 犠犺犪狋犺犪狊犫犲犲狀犲犿狆犻狉犻犮犪犾狔犮狅狀犳犻狉犿犲犱犻狊狋犺犲狆狅狊犻狋犻狏犲犮狅狉狉犲犾犪狋犻狅狀犫犲狋狑犲犲狀犺犲犪犾狋犺犻狀狊狌狉犪狀犮犲犪狀犱犺犲犪犾狋犺犮犪狉犲狌狋犻犾犻狕犪狋犻狅狀犪犾狋犺狅狌犵犺犱犻狉犲犮狋犪狊狊狅犮犻犪狋犻狅狀狊犫犲
社会医疗保险对老年人健康水平的影响 社会 2014 2 CJS 第 34 卷 基于浙江省的实证研究 刘晓婷 摘要 : 本研究根据 2010 年浙江省城乡老年人口生活状况调查的数据认为, 对于老年人的社会医疗保险问题, 不仅要关注保险覆盖面的扩大, 更应关注不同保险项目参保老人之间的健康平等 在揭示医疗服务使用与健康水平负向关系这一主效应的基础上, 研究发现, 职工医保作为犿狅犱犲狉犪狋狅狉可以改善使用较多医疗服务老人的健康水平,
6Z., A D 6 J ; P A ; [9] Z. A \ A?7, J P MN F. Z.AJ J 6 675AB 8`.Z.J L 68 1, 5 Z. 1,N 5 Z. A [10 11] ;1 A,. Z.A G H 0 1 A,5 56P 3,U 5 6 Z.
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431 0141 ACTAPHOTONICASINICA Vol.43No.1 December014 犱狅犻 :10.3788/gzxb014431.100 ZemaxR 01A56Z.J + ( 8, 1003) :. EFW #'6EI % ;; ; T W # = > ' ^ % ; ;J*W #=>' S66E, 3