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1 131 论著 DOI: /j 高强度聚焦超声治疗小鼠皮下瘤后 IL 6 和 IL 10 表达的变化 杨敏 1, 李欢 1, 袁世梅 1, 唐祖川 1, 陈楚 1, 宋琪玲 1, 施琼 1, 周兰 1, 罗进勇 1, 何通川 1, 李发琪 2, 王智彪 2, 1 翁亚光 (00016 重庆, 重庆医科大学 : 检验医学院, 临床检验诊断学教育部重点实验室 1, 生物医学工程学院, 省部共建超声医学工程国家重点实验室 2 ) [ 摘要 ] 目的探讨高强度聚焦超声 (HIFU) 治疗小鼠结直肠癌皮下瘤的有效性和治疗前后 IL 6 和 IL 10 表达的变化情况 方法采用结直肠癌细胞系, 建立 BABL/c 小鼠皮下瘤模型, 数量 60 只 ; 采用 JC 200 肿瘤治疗系统, 分为 6 组 : 对照组 ( 荷瘤假照组 ), 治疗后 d 及 1d 组, 眼球取血, 收集肿瘤组织, 石蜡包埋后 HE 染色观察组织病理变化, 并检测残余肿瘤组织和血清中 IL 6 和 IL 10 的表达水平 结果 HIFU 能有效地消融肿瘤组织, 靶区组织随时间的变化出现以水肿 出血 炎症细胞浸润 坏死 纤维增生为主的病理学变化 HIFU 消融后肿瘤组织及外周血 IL 6 和 IL 10 的表达均表现为上升后下降的趋势 HIFU 后 d 血清中 IL 6 的浓度均显著高于对照组 (P<0.05),1d 检测,IL 6 的表达则明显下降 (P>0.05); 血清中 IL 10 的浓度与对照组相比在 1 3d 明显升高 (P>0.05),1d 后达到最高峰, 而血清 IL 10 的浓度在 5 7 1d 组与对照组相比, 无明显差异 (P>0.05) 结论 HIFU 能有效治疗结直肠癌, 且肿瘤残余组织和血清中 IL 6 和 IL 10 的表达早期升高, 后期 IL 6 明显降低, 而 IL 10 无明显变化 [ 关键词 ] 高强度聚焦超声 ; 结直肠癌 ; 白细胞介素 6; 白细胞介素 10 [ 中图法分类号 ] R392.32;R5.3;R [ 文献标志码 ] A ExpresionofIL 6 and 10 in subcutaneouslytransplanted tumorofcolorectal cancerinmiceafterhighintensityfocusedultrasoundtreatment YangMin 1,LiHuan 1,YuanShimei 1,TangZuchuan 1,ChenChu 1,SongQiling 1,ShiQiong 1,ZhouLan 1,Luo Jinyong 1,HeTongchuan 1,LiFaqi 2,WangZhibiao 2,WengYaguang 1 ( 1 KeyLaboratoryofClinicalLaboratory DiagnosticsofMinistryofEducation,ColegeofClinicalLaboratoryDiagnostics; 2 StateKeyLaboratoryofUltrasound EngineeringinMedicineCo foundedbychongqingandministryofscienceandtechnology,colegeofbiomedical Engineering,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing,00016,China) [Abstract] Objective Toinvestigatetheeficacyofhighintensityfocusedultrasound(HIFU) treatmentforthesubcutaneouslytransplantedtumorofcolorectalcancerinmiceanditsfolowinginfluenceon theexpresionlevelsofindicativemarkersil 6andIL 10.Methods SixtyBALB/C miceundergoing subcutaneousinjectionofcolorectalcancercelswereemployedtoserveassubcutaneoustumormicemodel.the micewererandomlydividedinto6groups,controlgroup,andgroupsin1,3,5,7and1daftertreatment. Themiceofthelater5groupsweretreatedbytypeJC 200focusedultrasoundtumortherapysystem.themice weresacrificedinthecorespondingtimepointsfortheireyebals,tumortisuesandbloodsamples.hestaining wasusedtoobservethepathologicalchangesofthetumortisues.elisaandrt PCRwereemployedtodetect thelevelsofil 6andIL 10intheserumandtumortisuerespectively.Results HIFUnotonlyefectively ablatedthetumorisue,butalsoexerteditsefectontargetzoneovertimeexhibitingvariouspathological [ 基金项目 ] 国家重点基础研究发展计划 (973 计划,2011CB707906) [ 通信作者 ] 翁亚光,E mail:yaguangweng@126.com [ 优先出版 ] htp:// )

2 1315 changessuchasedema,hemorhage,inflammatorycelinfiltration,necrosis,andfibrosis.afterhifuablation treatment,thelevelsofil 6andIL 10wereelevatedintheperipheralbloodandtumortisueintheearlystage, whiletendedtodecreaseovertime.theserumlevelofil 6wasincreasedsignificantlyin1,3,5and7dafter thetreatmentwhencomparedwiththatofcontrolgroup(p<0.05),butthatwasreducedenormouslyinday1 (P<0.05).TheserumlevelofIL 10wasobviouslyhigherinthedays1and3thanthecontrol(P<0.05), andreacheditspeakatday1,butnosignificantdiferencewasseeninthedays5,7and1whencompared withcontrolgroup.conclusion HIFU treatmenthasefectiveimpactontumortisuethroughitsfocused ablationefect,andcausestheearlyup regulationofil 6andIL 10intheresidualtumortisueandserum,but inlater,thetreatmentleadsthedecreaseoftheformer,whilehasnoefectonthelater. [Keywords] highintensityfocusedultrasound;colorectalcancer;il 6;IL 10 SupportedbytheNationalBasicResearchProgram(973Program,2011CB707906).Corespondingauthor:WengYaguang,E 高强度聚焦超声 (highintensityfocusedultrasound, HIFU) 是局部非入侵性治疗中晚期癌症的方法 [1] HIFU 将超声波汇聚于靶区组织, 引起靶区瞬态温升 (>65 ) 和空化效应, 使靶区蛋白质变性, 组织凝固性坏死, 而对周围正常组织无损伤, 具有微创 靶向特点 [2-3] 目前国内外关于 HIFU 的研究集中于生物学焦域 影像学变化, 而关于 HIFU 治疗后引起的炎症反应和血清中炎症因子变化情况研究较少 IL 6 和 IL 10 主要由 2 型辅助性 T 淋巴细胞 (Th2) 产生,IL 6 能够促进肺癌 结肠癌 肝癌等的生长与转移 [-5] ;IL 10 是一个著名的免疫调节和抗炎细胞因子, 抑制肿瘤的进展, 而缺乏 IL 10 可以抑制抗肿瘤免疫力, 有利于肿瘤生长 [6] 本研究采用 HIFU 治疗小鼠结直肠癌皮下瘤, 观察肿瘤组织病理学变化, 检测肿瘤组织和血清中促炎因子 IL 6 抑炎因子 IL 10 的表达变化, 为 HIFU 临床应用提供更多实验依据 1 材料与方法 1.1 主要仪器及试剂 RPMI160 完全培养基 (HyClone 公司 ) 10 特级胎牛血清 (hyclone 公司 ) 1 青链霉素 (HyClone 公 司 ) TRIzol(Invitrogen 公司, 美国 ) RT PCR 反应试剂 (TaKaRa 公司 ) PCR 显影仪 (Bio Rad, 美国 ) 鼠源 ELISA 试剂盒 IL 6 IL 10( 北京四正柏生物技术公司 ) 无毒环保苏木精 伊红 (H E) 染液 ( 南京建成生物工程研究所 ) 普通正置光学显微镜 ( 尼康 ) 组织切片机 ( 德国徕卡 RM2235) 病理组织漂烘处理仪 (PHY Ⅲ 型, 国产 ) 海扶 JC200 型聚焦超声肿瘤治疗系统 ( 图 1) 由重庆医科大学超声工程研究所自行设计研制, 重庆海扶公司生产, 该系统由 5 部分组成 : 海扶超声聚焦刀, 由主机 运动系统 控制台统 功率源及水处理系统几部分组成, 治疗头 1.0MHz 1.2 动物及细胞株 BABL/c 雌性小鼠 60 只,6~8 周龄, 质量 16.5~ 18g, 购自重庆医科大学实验动物中心 [ 实验动物等级 :SPF 级, 合格证号 SCXK( 渝 )], 标准饲料喂养, 自由饮水 CT 26 肿瘤细胞株 (BABL/c 小鼠来源的结直肠癌细胞, 由本实验室保存 ) 1.3 方法 细胞培养小鼠 CT 26 结直肠癌细胞在含 10 胎牛血清 160 培养基, 置于 37 5 CO 2 孵箱中培养 A: 治疗探头 ;B:B 超监测治疗 ;C: 治疗示意图 图 1 高强度聚焦超声 (HIFU) 治疗系统

3 BABL/c 小鼠结直肠癌移植瘤模型的建立 分组及治疗方式用 0.25 胰蛋白酶消化呈单个的 CT 26 细胞, 调整细胞数至 /ml, 在 60 只小鼠右侧后部皮下接种细胞悬液 0.1mL 待小鼠皮下瘤直径为 0.8~1.2cm 时, 使用 JC 200 肿瘤治疗系统, 输入治疗参数 ( 治疗频率 1.0MHz, 功率为 80W, 总计时间 6s) 对照组不给予任何处理 对照组 HIFU 治疗后 d 各取 10 只小鼠, 眼球取血后, 断颈法处死小鼠, 剥离肿瘤组织,PBS 冲洗, 置于 多聚甲醛溶液固定 HE 染色观察各组肿瘤组织的病理变化标本置于 多聚甲醛溶液固定 8h 后, 给予常规脱水, 透明浸蜡和包埋 石蜡切片, 厚约 5μm 每组标本取 5 片 HE 染色, 光镜下观察 1.3. RT PCR 检测肿瘤组织 IL 6 IL 10mRNA 的表达取新鲜的残余肿瘤组织约 50mg,PBS 冲洗, 置于液氮中, 然后碾磨成粉末, 加入 800μLTRIzol 试剂裂解细胞, 按常规方法提取组织中的 RNA 逆转录参照大连宝生物公司提供的 25μL 反转录体系 聚合酶链反应体系 10μL,PCR 反应条件 9 预变性 2min, 扩增 9 1min 退火 56 15s 72 度延伸 60s 总计 33 循环 72 延伸 5min; 扩增产物于 TBE 缓冲液电泳 120V,15min,PCR 成像仪显影 引物序列鼠源 IL 6: 上游 5 TGCTGGTGACAACCACGGC 3, 下游 5 GTAC TCCAGAAGACCAGAGG 3 ; 产物长度 308bp 鼠源 IL 10: 上游 5 CCCTTTGCTATGGTGTCCTT 3, 下游 5 TGGTTTCTCTTCCCAAGACC 3 ; 产物长度 97bp 鼠源 GAPDH: 上游 5 GGCTGCCCAGAACATCT 3, 下游 5 CGGACACATTGGGGGTAG 3, 产物长度 122bp 细胞因子检测采用 ELISA 试剂盒检测血清中 IL 6 IL 10 水平, 具体步骤按照北京四正柏生物技术公司说明书操作 1. 统计学分析采用 SPSS18.0 统计软件进行分析, 计量资料均用 x±s 珋表示, 采用单因素方差分析, 组间有差异进一步比较采用 SNK q 检验 2 结果 2.1 移植瘤治疗后的肉眼改变 HIFU 照射 1d 治疗区为灰白色无光泽凝固性坏死区, 呈椭圆形, 周围有明显出血带, 边界清楚 ;5d 后呈境界清晰的红黑色凝固性坏死灶, 周围肿瘤组织水 肿出血减少 ;1d 坏死灶周围形成纤维索, 病变开始缩小 ( 图 2) A:HIFU 治疗 1d 箭头示灰白色是凝固性死, 出现出血和水肿 ;B:HIFU 治疗 5d 消融区由红黑色坏死, 周围区出血水肿逐渐消退 ;C:HIFU 治疗后 1d 箭头示消融区的变化图 2 肉眼观察 HIFU 治疗后肿瘤的变化 2.2 HE 染色观察 HIFU 治疗移植瘤后病理变化显微镜下观察显示, 对照组各细胞体积形态均一, 胞浆无明显空泡 ( 图 3A);HIFU 治疗 1d 后, 治疗中央区瘤细胞发生凝固性坏死, 坏死区内肿瘤细胞体积变小, 肿瘤细胞外形结构尚存, 见少量空泡样结构零星散布于胞浆内, 消融区可见散在的炎性细胞 ( 图 3B);3d 靶区肿瘤组织内形成境界明显的坏死区, 细胞间隙增大, 其内仍可见大量核固缩的肿瘤细胞并见明显的细胞碎片, 可见大量红细胞, 并且出现炎性细胞的浸润 ( 图 3C);5d 核碎裂明显增多, 坏死靶区内可见核碎片被组织溶解吸收 ( 图 3D);7d 细胞核碎屑也被组织溶解吸收溶解而消失 ( 图 3E);1d 有纤维包裹及炎症细胞浸润 ( 图 3F) 2.3 RT PCR 检测 HIFU 治疗前后残存肿瘤组织 IL 6 和 IL 10 的表达情况与对照组相比,HIFU 治疗组 IL 6 IL 10 的表达分别于 3d 5d 达到最高 (P<0.05, 图 ), 之后逐渐下降, 随时间变化表现为先上升后下降的趋势 HIFU 治疗后 1d 后与对照组相比,IL 6 的表达有明显的下降, 而 IL 10 的基本没有变化 2. ELISA 检测 HIFU 治疗前后外周血不同时间 IL 6 和 IL 10 的含量如图 5 所示, 血清中细胞因子 IL 6 和 IL 10 均表现为先增高, 后降低的趋势 与对照组相比,HIFU 治疗后检测 dIL 6 的表达均明显升高 (P<0.05); 而在 HIFU 治疗后 1d 检测,IL 6 的表达水平较对照组明显下降 (P<0.05) HIFU 治疗后 1 3dIL 10 的浓度较对照组显著升高 (P<0.05), 而在 5 7 1dIL 10 的浓度与对照组相比差异无统计学意义 (P>0.05)

4 第3 7卷第 3期 2 5年 7月 5日 第 Vo l 3 7 No 3 J u l 5 2 5 三 军 医 大 学 学 报 J Th i r d Mi l Me d Un i v 37 # " & A 对照组 B F 分别为 FU治疗后 3 5 7 4d 图 3 FU治疗后不同时间点肿瘤组织病理组织学变化 " # HE 4 & 3 讨论 '(&#)* +," 本研究所使用的 FU治疗系统由超声实施全程 监控 确保治疗区域覆盖瘤体 图 本研究证实 '()-. +," FU消融后靶区组织随时间的变化表现出水肿 出 /0123"" +," 血 坏死的过程 图 2 FU治疗后于第 3 5 7 4 天取材发现 HE染色观察发现 靶区组织有不同程度 对照组 2 治疗后 d 3 治疗后 3d 4 治疗后 5d 5 治 炎症细胞的浸润 成纤维细胞的增生 图 3 证实了 疗后 7d 6 治疗后 4d FU不仅能有效的摧毁靶区的肿瘤细胞 还出现了以 图 4 RT PCR检测治疗前后不同组残余组织 I 6和 I 的变化 ()*+,12/3*- """ # " 研究证实 热消融治疗肿瘤能够在体内摧毁肿瘤 细胞同时诱导机体产生炎症反应 而炎症却在肿瘤发 )*'+ )*, 展的各个阶段 包括启动 进展和转移起了很重要作 用 7 I 6和 I 主要由 Th 2型淋巴细胞产生 & 本研究证实 FU治疗 3后 血清 I L6和 I 水平达 ' "" ( 到升高峰 光镜下显示肿瘤组织区有不同程度的炎症 细胞浸润 这提示早期浸润的炎症细胞主要是 Th 2型 淋巴细胞 炎症细胞浸润为主的炎症反应 FU治疗可以诱导系统性 I 6水平升高 通过 "# ( &/0' - (. 体循环 I 6可以刺激存在于消融区域边缘或者离消 a P 5 与对照组 d 比较 融区域较远的区域有活性的肿瘤细胞进行增殖 那么 图 5 FU治疗前后各组血清中 I 6和 I 浓度变化 FU治疗后 可通过辅助疗法来降低 I 6的水平 在

5 1318 提高 IL 10 的表达水平, 同时影响这些基因的下游靶基因的水平 ( 如 STAT3), 从而有效减少局部复发及远处转移率 [11-15] IL 6 和 IL 10 是开发辅助疗法的两个较为有潜力的靶点, 而这种辅助疗法可以加强 HIFU 治疗肿瘤疗效 此外, 由于热消融引起血液和消融区域的淋巴细胞数目增加, 那么免疫治疗策略就是针对 Th2 淋巴细胞 ( 产生 IL 6) 向 Th1 淋巴细胞 ( 促进细胞诱导的肿瘤杀伤作用 ) 转变, 这对以后进一步研究较为有用 [16-18] 我们发现 HIFU 治疗后,IL 6 和 IL 10 的表达水平有不同程度的升高, 综上所述,HIFU 能有效地摧毁小鼠结直肠癌的皮下瘤 HIFU 治疗后早期残余肿瘤组织及外周血中 IL 6 和 IL 10 表达先明显上升, 而早期 IL 6 和 IL 10 表达量的变化影响到 HIFU 治疗后残余肿瘤组织的生长速度 因此,IL 6 和 IL 10 既可以作为 HIFU 治疗后早期辅助疗法的靶点, 也可作为监测 HIFU 治疗效果观察的指标 参考文献 : [1] ZhouYF.Highintensityfocusedultrasoundinclinicaltumor ablation[j].worldjclinoncol,2011,2(1):8-27. [2] 刘贤伟, 张建华, 杨阳, 等. 高强度聚焦超声在结直肠癌肝转移治疗中的研究现状 [J]. 肝胆外科杂志,201,22 (1):2-5. [3]YuW,TangL,LinF,etal.High intensityfocusedultra sound:noninvasivetreatmentforlocalunresectablerecur renceofosteosarcoma[j].surgoncol,201,2(1):9-15. []YaoZ,FenoglioS,GaoDC,etal.TGF betail 6axisme diatesselectiveandadaptivemechanismsofresistancetomo leculartargetedtherapyinlungcancer[j].procnatlacad SciUSA,2010,107(35): [5] 彭晔, 张旭刚, 郑运田, 等. 白细胞介素 6 与恶性肿瘤关系的临床研究进展 [J]. 临床荟萃,2012,27(1): [6] Acuner OzbabacanES,EnginBH,Guven MaiorovE,et al.thestructuralnetworkofinterleukin 10anditsimplica tionsininflammationandcancer[j].bmcgenomics,201, 15(Suppl):S2. [7]WahTM,ArelanoRS,GervaisDA,etal.Image guided percutaneousradiofrequencyablationandincidenceofpost ra diofrequencyablationsyndrome:prospectivesurvey[j].ra diology,2005,237(3): [8] BroughtonG2nd,JanisJE,AtingerCE.Woundhealing: anoverview[j].plastreconstrsurg,2006,117(7suppl): 1e S 32e S. [9]AhmadF,GravanteG,BhardwajN,etal.Changesininter leukin 1betaand6afterhepaticmicrowavetisueablation comparedwithradiofrequency,cryotherapyandsurgicalre sections[j].amjsurg,2010,200(): [10]MuangchantC,PopeJE.Thesignificanceofinterleukin 6 andc reactiveproteininsystemicsclerosis:asystematiclit eraturereview[j].clinexprheumatol,2013,31(2suppl 76): [11] GabrysovaL,HowesA,SaraivaM,etal.Theregulationof IL 10expresion[J].CurTopMicrobiolImmunol,201, 380: [12]GrivennikovS,KarinE,TerzicJ,etal.IL 6andStat3are requiredforsurvivalofintestinalepithelialcelsanddevelop mentofcolitis asociatedcancer[j].cancercel,2009,15 (2): [13]HsiaCY,HuoTI,ChiangSY,etal.Evaluationofinter leukin 6,interleukin 10andhumanhepatocytegrowthfactor astumormarkersforhepatocelularcarcinoma[j].eurj SurgOncol,2007,33(2): [1]Draskovic PavlovicB,VucevicD,BozicB,etal.Function alpropertiesofgranulocytesafterthermalinjury[j].immu nolres,2012,52(1/2): [15]ShaoDD,SureshR,VakilV,etal.PivotalAdvance:Th 1cytokinesinhibit,andTh 2cytokinespromotefibrocyte diferentiation[j].jleukocbiol,2008,83(6): [16] HofmannU,BeyersdorfN,WeiratherJ,etal.Activationof CD + Tlymphocytesimproveswoundhealingandsurvival afterexperimentalmyocardialinfarctioninmice[j].circu lation,2012,125(13): [17]WanS,ZhaoE,KryczekI,etal.Tumor asociatedmacro phagesproduceinterleukin6andsignalviastat3topro moteexpansionofhumanhepatocelularcarcinomastemcels [J].Gastroenterology,201,17(6): [18] WaitzR,SolomonSB,PetreEN,etal.Potentinduction oftumorimmunitybycombiningtumorcryoablationwithan ti CTLA therapy[j].cancerres,2012,72(2): ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑汪勤俭 )

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