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1 复旦学报 医学版!, <% ; 对非小细胞肺癌患者化疗后免疫功能的影响 郑惠如 金美玲 任 涛 张 镭 储以微 复旦大学附属中山医院呼吸科 上海 同济大学附属东方医院呼吸科 上海 复旦大学上海医学院免疫学系 < 分子医学国家教育部重点实验室 上海 摘要 目的 测定非小细胞肺癌 # $ & "-" 患者化疗前后外周血单个核细胞 % % : ## ## > " 经胞嘧啶 磷酸 鸟嘌呤寡脱氧核苷酸 '#$ % #$% ##' #' & # &# #7 #' $"% 3 刺激后 "3 A "3 / & ) & 细胞及 5 5- 的变化 评价不同时间点 "% 3 的干预效果 方法 选取 "-" 患者 例 分别抽取患者化疗前 化疗后第天 及第, 天, 外周血 - 分离 > " 每份 > " 均分为实验组及对照组 实验组给予 "% 3 * 刺激 对照组 不做干预 经培养 后收集细胞以流式细胞仪检测 "3 A "3 / & ) & 细胞百分比 并取上清液检测 5 和 5- %& - 结果 实验组 "3 A "3 / & ) & 细胞百分比在, 分别为 ( B (** ( +B ( 和 (!B ( 较对照组均有明显下降 ( / 实验组 5 在, 分别为 (* B /(+ (/,B/(! 和 /( B (,!%& - 和, 时较对照组显著增加 ( / 时变化不明显 ( / 实验组 5- 在, 分别为 ( B*(*/+( B,( 和 /(,/B ( *%& - 和 时较对照组明显增加 ( / 而, 时变化不明显 ( / 动态观察对照组 时 "3 A "3 / & ) & 细胞比例下降至最低点 而后逐渐回升 实验组在, 时 "3 A "3 / & ) & 细胞比例仍持续下降 实验组的 5 值呈现升高趋势, 和 相比明显升高 ( / 而实验组 5- 值在化疗前后无明显变化 即化疗前 与化疗后, 比较 以及 与, 比较 差异均不明显 值均 ( / 肺癌患者化疗次数及外周血淋巴细胞的数目与 "% 3 对 "3 A "3 / & ) & 细胞比例及 5 5- 的分泌作用无显著相关性 ( / 结论 "% 3 能有效下调 "3 A "3 / & ) & 细胞 刺激 5 的分泌 优化肺癌患者抗肿瘤的免疫微环境 有利于机体的抗肿瘤免疫 肺癌患者即使化疗后外周血淋巴细胞的数目明显减少 "% 3 仍能下调 "3 A "3 / & ) & 细胞和刺激 5 的分泌 发挥抗肿瘤作用 关键词 非小细胞肺癌 化疗 "% 3 调节性 ) 细胞 白介素 < 干扰素 中图分类号., ( 文献标志码 0 (+*+1($$(*, *,( ( ( - <% ;"" "! &. )# 40 - "4 8 ($"' "#$ % & ' ($"' " 0 % & ' ' ' +" $"+ + ' $ $" ' + " "#$ % & ' $#! %#& )# 7 ' & $#9"3 A "3 / & ) & 5 5- '#$ % #$% ##' #' & # &# #7 #' $ "% 3 $' ' % % : ## ## > "#9%' '$8' # & "-"9' #' % '##:$ ' & $#9"3 A "3 / & ) & '#; '9 '' %#'$$#$'# ' ' ' '# 9 '$#9"% 3 (')8 ' "-"%' '$8 # ' % % : ##$ % $ 上海市重点学科建设项目 / 上海市自然科学基金项目. + "# $%#&' # 1! ##( # (

2 ! 复旦学报 医学版 年 月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目前肺癌的发病率及病死率在各种恶性肿瘤中居于首位 非小细胞肺癌 # $ & "-" 占所有肺癌的约! 大部分非小细胞肺癌在发现时已失去手术机会 以化疗为主的放化疗综合治疗是目前非小细胞肺癌治疗的主要方法 目前非小细胞肺癌传统治疗的效果已达到平台期 新的治疗方法势在必行 肿瘤生物学治疗是除了手术 化疗 放疗外重要的治疗模式 其中 "% 3 近年来在抗肿瘤方面有令人瞩目的潜力 "% 3 通过与 )-.+ 特异性的结合启动一系列有利于抗肿瘤的免疫活性 其作为抗肿瘤疫苗的佐 + 剂 还可增加疫苗的免疫刺激活性 基于以上研究结果 本研究检测了 例肺癌患者化疗前后不同时间点外周血单个核细胞 % % : ## ## > " 经 "% 3 刺激后 "3 A "3 / & 调节性 ) 细胞 & '# ) ) & 和 < 干扰素 ' 9 #& 5 白介素 ' ; 5- 的变化 探讨 "% 3 对肺癌患者化疗后的免疫功能的影响 资料和方法 临床资料 收集, 年 + 月至 月入住复旦大学附属中山医院呼吸科 "-" 患者 例 其中 男性 例 女性, 例 年龄 *! 平均 //(,+ 岁 经组织学或细胞学诊断为 "-" 其中鳞癌 * 例 腺癌 例 ) 分期为 期! 例 期 例 例有吸烟史, 例无吸烟史 均未接受过手术治疗 放射治疗 选用 "-" 一线化疗方案进行化疗 铂类 A 紫杉醇 长春瑞滨或吉西他滨 的患者 > 评分为 分 标本采集 所有入选肺癌患者均在化疗前 化疗后第天 及第, 天, 各抽取晨起空腹静脉血标本 - 以枸橼酸钠抗凝 外周血单个核细胞分离 培养及干预 每次抽取的血标本均分为 组 一组为对照组 另一组为实验组 两组细胞均用外周抗凝血和 稀释后 用淋巴细胞分离液 07$ ># 公司 常规分离 > " 调整细胞浓度 (/ E * - 每管加入 - 含有 小牛血清的.> 5* 将调整好的单细胞悬液接种至 培养皿 每份样本接种两皿 对照组与实验组 每皿 - 在设定为, / " 的培养箱培养至 于实验组中加入 "% 3 * 全硫代修饰骨架 / )" ) " )))) )"" )))) )" )) 由上海生工公司合成 溶液刺激 并调整其终浓度为 # - 对照组不予任何干预 后收获细胞 进行流式细胞仪检测

3 郑惠如 等 ("% 3 对非小细胞肺癌患者化疗后免疫功能的影响 + 流式细胞仪检测 离心收获培养后的 > " 分别加入 > 抗人 "3 > <" / 抗人 "3 及 5)" 抗人 "3 / 均为. C 3 公司 避光孵育 / > 洗涤 次 / 水平离心 / 后弃上清 加入 > - 重悬细胞后使用 0" " : 流式仪检测 检测 ; 及 9 ) 按照试剂盒说明要求采用双抗夹心法检测培养上清液中的 5 及 5- 统计学处理 本实验使用 > (/ 软件对结果进行分析 应用方差分析对各组数据进行方差齐性分析 符合参数统计的数值变量采用成组 检验 > % ) ' $' 对不同组别进行分析 并对不同数据的相关性进行 > $# 相关系数检验 结果以 ( / 为差异有统计学意义 ( 为差异有显著统计学意义 结 果 肺癌患者 ' 经 < % ; 刺激后, ) -! 细胞的变化及化疗前后的动态改变 实验组化疗前 "3 A "3 / & ) & 细胞比例 为 ( B (** 化疗后, 分别为 ( +B ( 和 (!B (! 对照组化疗前 "3 A "3 / & ) & 细胞比例 为 (,*B (/ 化疗后, 分别为 (/ B (/, 和 (, B ( + 实验组的 "3 A "3 / & ) & 细胞比例在化疗前后各时间点均小于对照组 ( / 表 动态观察两组化疗前后的变化 对照组 "3 A "3 / & ) & 细胞下降至最低点而后逐渐回升 实验组经 "% 3 刺激后在, 仍持续下降 图 实验组各不同时间点 和 相比 和, 相比 和, 相比 "3 A "3 / & ) & 的变化无显著差异 各组 值均 ( / 表 实验组和对照组各时间点, ) -! 细胞的比较 - #!, ) -! # 3!!"!" "3 A "3 / & ) &%#%#'# "#'# &#% 7% '&#% (,*B (/ ( B (** ( (/ B (/, ( +B ( (, (, B ( + (!B (! ( #'# &#% ( / ( ( 肺癌患者 ' 经 <% ; 刺激后细胞因子 ; 的变化及动态改变 实验组 5 %& - 在, 分别为 (* B/(+ (/,B/(! /( B (,! 对照组在, 分别为 *(!,B /(+ ( /B/( +(,B*(, 实验组 5 在 和, 时较对照组明显增加 ( / 时实验组 5 较对照组变化不明显 ( / 动态观察对照组各时间点 5 值的变化并不明显, 与 相比, 与 相比 与, 相比 值均 ( / 实验组的 5 值则呈现升高趋势, 和 相比 5 明显增加 (, 和 相比 5 也有增加 ( / 与 相比 变化不明显 ( / 表 表 ) 实验组和对照组各时间点 ; 的比较 - #) ; # 3!"!" %& - "#'# &#% 5 7% '&#% *(!,B/(+ (* B/(+ ( /B/( (/,B/(!, +(,B*(, /( B (,! #'# &#%'' $ ' %#' ( / ( #'# &#%'9 '' %#', (, ( /( 肺癌患者 ' 经 <% ; 刺激后细胞因子 9 ) 的变化及动态改变 实验组 5- %& - 在, 分别为 ( B*(*/+( B,( /(,/B ( * 对照组在, 分别为 /(/ B/(, /( B (!,!(* B*( 实验组 5- 在 和 时较对照组明显增加 ( / 在, 时较对照组变化不明显 ( / 对照组和实验组 5- 值在化疗前后的变化并不明显 化疗前 与化疗后, 比较 以及 与, 比较 各组 值均 ( / 表 表 * 实验组和对照组各时间点 9 ) 的比较 - #*9 )# 3!"!" %& - "#'# &#% 5 7% '&#% /(/ B/(, ( B*(*/ /( B (!, +( B,(,!(* B*( /(,/B ( * #'# &#%'' $ ' %#' ( /( 实验组 -! 细胞和细胞因子 ; 9 ) 与外周血淋巴细胞相关性分析 对实验组 "3 A "3 / & ) & 细胞比例和 5 5- 的变化与外周血淋巴细胞的相关性进行分析发现 不论是 或是, 实验组 "3 A "3 / & ) & 细胞比例和 5 5- 的变化与血淋巴细胞数均无明显相关性 ( / 表 实验组 -! 细胞和细胞因子 ; 9 ) 与化疗次数的相关性分析 分析化疗次数是否会影响

4 / 复旦学报 医学版 年 月! "% 对 "3 A "3 / & ) & 细胞比例和 5 5- 的作用 经相关性检验发现 "3 A "3 / & ) & 细胞比例和 5 5- 的变化与是否为初次化疗无明显相关性 ( / 表 / 表, 实验组各时间点, ) -! 细胞和 ; 9 ) 与外周血淋巴细胞的相关性分析 值 - #,!! # ', ) %#' ) -! ; 9 )3!!" " "# '# 9 ' "3 A "3 / & ) & 5 5- ( * ( /+ (/ ( (/ (/*, (* ( / (, 表 实验组不同时间点, ) -! 细胞和 ; 和 9 ) 与化疗次数的相关性分析 值 - #!! #, ) -! ; 9 )3!!" " ) %#' "# '# 9 ' "3 A "3 / & ) & 5 5- ( ( ( ( ( (, ( ( ( 讨 论 "3 A "3 / & ) & 细胞属于抑制免疫功能的负调节细胞 许多研究揭示在肿瘤患者外周血中及肿瘤组织周围存在着大量的 "3 A "3 / & ) & 细 胞 "3 A "3 / & ) & 细胞抑制机体免疫细胞的活性 削弱免疫系统对肿瘤组织的杀伤作用 有助于肿瘤细胞的生长与转移 目前抗肿瘤免疫研究正积极寻找有效清除或抑制 "3 A "3 / & ) & 细胞的方法 研究发现 "% 3 具有免疫调节功能 能增强机体的抗肿瘤免疫作用 有文献指出它还能直接下调 ) & 细胞 能有效增强自身抗肿瘤的免疫 能力 本实验选择肺癌患者化疗前后个时间点采集外周血 分离出 > " 予 "% 3 刺激后测定 "3 A "3 / & ) & 细胞的变化 结果显示化疗前后实验组 "% 3 刺激组 "3 A "3 / & ) & 细胞的平均值均小于对照组 ( / 提示 "% 3 刺激肺癌患者 > " 能有效下调 "3 A "3 / & ) & 细胞比例 在化疗后使用 "% 3 的干预措施还能持续下调 "3 A "3 / & ) & 细胞 有利于机体自身抗肿瘤免疫的运作 另一方面持续低表达 "3 A "3 / & ) & 细胞 可能还有利于提高肿瘤疫苗的免疫作用 在机体抗肿瘤的免疫效应机制中 ) 细胞的应答反应对抑制抗原性肿瘤细胞的生长非常重要 高表达的 "3 A "3 / & ) & 细胞会抑制 ) 细胞对疫苗的反应 / 性 故在下调 ) & 细胞的同时给予疫苗也许能 * 更有效地诱生抗肿瘤应答 若我们能有效解除 "3 A "3 / & ) & 细胞对免疫系统的抑制 将其维持在低水平状态 并适时给予肿瘤疫苗活化少数残存在外周血能特异性识别肿瘤抗原的 ) 细胞 刺激机体对肿瘤的排异反应 将能有效起到抗肿瘤的作用 但 "% 3 是否能直接下调 "3 A "3 / & ) & 细胞 还是存在其他路径进行调节目前尚有争议 需要进一步的研究证实 3" 是在免疫起始状态中最有潜力的 0>"$ 也是唯一能激活幼稚 ) 细胞的 0>"$ 故 3" 细胞是天然免疫和获得性免疫之间的桥梁 促使 3" 成熟更, 有助于抗肿瘤免疫 "% 3 能激活 3" 细胞 使之活化 成熟 成熟的 3" 细胞分泌大量 5- 和 5 辅助 ) 和 = 细胞增殖活化 并生成大量的 5 产生特异性细胞免疫 另一方面 "% 3 在 5- 协同下能直接激活 = 细胞 细胞杀伤活性 并分泌 5 而 5 反过来又能进一步 + 促进单核细胞 巨噬细胞和树突细胞的激活 本实验发现 "% 3 干预能有效刺激 5- 和 5 的分泌 除此之外 5 还能下调 "3 A "3 / & ) & 细胞 更有利于抗肿瘤免疫的运作 故使用 "% 3 刺激 > " 分泌细胞因子 5 5- 能起到抗肿瘤免疫的连锁效应 本实验结果显示使用 "% 3 后 "3 A "3 / & ) & 细胞及细胞因子 5 5- 的变化和外周血淋巴细胞的数量没有显著相关 说明即使化疗药物具有免疫抑制的不良反应 也不会影响 "% 3 下调 "3 A "3 / & ) & 细胞和增加 5 5- 分泌的作用 这为 "% 3 和化疗药物 的联用提供了有利的依据 & 等长期追踪反复使用 5- 高分子微球治疗的效果发现 随着瘤内抑制性 ) 细胞的快速填充 每次治疗效果呈下降趋势 而利用低剂量的化疗药物清除瘤内的抑制性 ) 细胞能显著增强并增长治疗效果 由此可见 化疗药物和其他肿瘤免疫治疗的相互影响尚有很大 + 的研究空间 另有学者提出反复多次予以低剂量化疗药物能有效减少 "3 A "3 / & ) & 细胞的数量 故推论多次化疗的肺癌患者因化疗药物的协同作用 其使用 "% 3 下调 "3 A "3 / & ) & 细胞的效果较初次化疗的患者为佳 而化疗本身具有免疫抑制的不良反应 故化疗可能会影响免疫细胞分泌细胞因子的作用 从本实验的动态分析可观察出实验组在, 时 5 显著上升 提示随着机

5 郑惠如 等 ("% 3 对非小细胞肺癌患者化疗后免疫功能的影响 / 体在化疗后免疫状态的恢复 两组 5 的分泌量也逐渐升高 但对 "3 A "3 / & ) & 细胞比例 细胞因子的变化与化疗次数进行相关性分析的检验并无明显差异 ( / 可能因样本数不大 导致统计分析不易 但动态观察上述因素有明显的趋势 故增加病例数及加测观察的时间点也许更能看出各因素和 "% 3 下调 "3 A "3 / & ) & 细胞及增加 5 5- 分泌的相关性 这些都需要进一步的实验加以佐证 虽然化疗药物的使用会有骨髓抑制 免疫细胞数量的减少等不良反应 但本实验提示化疗后使用 "% 3 对 5 和 5- 的分泌量影响并不大 目前对在什么时机使用 "% 3 的研究尚未定论 在化疗前 化疗后或是与化疗药物联合使用 "% 3 的效果是否存在差异也尚有争议 综合本实验结果 推论可能在化疗后使用 "% 3 效果较化疗前更为显著 还需要进一步的临床试验佐证 而目前尚缺乏大型临床数据分析各种因素的影响 但随着人们对 "% 3 治疗肿瘤效果的愈加肯定 开展临床相关因素对 "% 3 治疗肿瘤的影响的研究已是势在必行 参 考 文 献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收稿日期 < < 编辑 沈玲

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