426 检验医学 2013 年 5 月第 28 卷第 5 期分据报道,CD44 与 HA 结合, 可介导细胞与细胞外基质黏附淋巴细胞归巢等多种生理和病理过程 [3 4] 许多肿瘤细胞表面 CD44 高度表达, 其在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用目前, 已有许多学者以 CD44 为靶点分子

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尝倚谈
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1 425 文章编号 : (2013) 中图分类号 :R446.6 文献标志码 :A DOI: /j.isn 正常与乳腺肿瘤细胞表面黏附分子 CD44 活化状态差异分析侯利丹, 刘雯, 何怡青, 杨翠霞, 杜艳, 高锋 ( 上海交通大学附属第六人民医院中心实验室, 上海 ) 摘要 : 目的检测黏附分子 CD44 在正常和乳腺肿瘤细胞表面的表达, 并分析其活化状态差异, 为以 CD44 为靶点的肿瘤靶向治疗提供新的理论依据方法采用流式细胞术检测 20 名正常人外周血单个核细胞 (PBMCs) 正常小鼠胚细胞 NIH3T3 及人乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549 表面 CD44 表达水平 ; 使用荧光标记透明质酸 (FL HA), 通过流式细胞术分析 CD44 的活化状态 ; 再运用细胞免疫荧光的方法观察 HA 与不同活化状态 CD44 的靶向结合情况结果正常人 PBMCs NIH3T3 与乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549 表面均高表达 CD44, 阳性表达率 >95% PBMCs NIH3T3 的 CD44 与 FL HA 结合活性相对较低, 分别为 (3.61±2.65)% 和 (14.33± 1.35)%, 而乳腺肿瘤细胞表面 CD44 与 FL HA 结合活性高 (>90%) 细胞免疫荧光显示 NIH3T3 细胞表面基本无荧光,HA 不靶向结合 CD44, 而 Hs578T 和 BT 549 细胞表面呈现强荧光,HA 靶向结合 CD44 结论正常细胞 PBMCs NIH3T3 表面虽然高表达 CD44, 但与其天然配体 HA 结合活性较低, 而乳腺肿瘤细胞表面高表达 CD44 且与其配体 HA 结合活性很高提示 CD44 分子在正常和肿瘤细胞表面存在相对静止与活化 2 种状态, 前者与 HA 结合活性较低, 后者与 HA 结合活性高提示以 HA 为靶向分子 CD44 为靶点的抗肿瘤药物, 能够选择性杀伤高表达 CD44 的肿瘤细胞而不影响正常细胞关键词 :CD44; 活化状态 ; 乳腺肿瘤 ; 外周血单个核细胞 AnalysisonthediferencesofsurfaceadhesionmoleculeCD44activationstatesinnormalcelsandbreast tumorcels HOU Lidan,LIU Yiwen,HE Yiqing,YANG Cuixia,DU Yan,GAO Feng. (DepartmentofCentral Laboratory,ShanghaiSixthPeople shospital,shanghaijiaotonguniversity,shanghai200233,china) Abstract:Objective TodetecttheexpresionsofsurfaceadhesionmoleculeCD44innormalcelsandbreast tumorcels,andanalyzethediferencesofcd44activationstatesinordertoprovideanewtheoreticalreferencefor CD44targetedcancertherapy.Methods TheexpresionsofCD44innormalperipheralbloodmononuclearcels (PBMCs),normalmousefibroblastNIH3T3celsandhumanbreasttumorcelHs578TandBT 549weredeterminedby flowcytometry.theactivationstatesofcd44wereanalyzedbyflowcytometry,usingfluorescence labeledhyaluronic acid(fl HA),andthenthetargetedbindingabilityofHA CD44wasobservedbycelimmunofluorescence.Results CD44wasabundantlyexpresedinnormalPBMCs,NIH3T3andbreasttumorcelHs578TandBT 549(thepositive expresionratewas>95%).thebindingabilityofthebreasttumorcelsurfacecd44withfl HA(>90%)was muchstrongerthanthoseofpbmcs[(3.61±2.65)%]andnih3t3[(14.33±1.35)%].nih3t3celshowed almostnofluorescence(ha targetedbindingwithoutcd44),whilehs578tandbt 549showedstrongfluorescence (HAtargetedbindingwithCD44)accordingtocelimmunofluorescence.Conclusions NormalcelPBMCsand NIH3T3havehighexpresionsofCD44andlowbindingabilitywithHA,whilebreasttumorcelHs578TandBT 549 havehighexpresionsofcd44andhighbindingabilitywithotherha.cd44innormalcelsandbreasttumorcels shows2diferentactivationstates:inactiveandactive.theanti tumordrugswithhaastargetedmononuclearandcd44 astargetcanselecthigh expresioncd44kilertumorcelsandhavenoinfluenceonnormalcels. Keywords:CD44;Activationstate;Breasttumor;Peripheralbloodmononuclearcel CD44 是一种广泛分布于细胞表面的跨膜糖蛋白受体 [1 2] 其配体透明质酸(HA) 是一种由 D N 乙酰氨基葡萄糖和 D 葡萄糖醛酸为结构单元的高分子黏多糖, 是细胞外基质的主要组成部资助项目 : 国家自然科学基金 (No ); 上海市科委重点项目 (No ); 上海市优秀学术带头人计划 (No.11XD ) 作者简介 : 侯利丹, 女,1988 年生, 硕士, 主要从事肿瘤靶向治疗研究通讯作者 : 高锋, 联系电话 :

2 426 检验医学 2013 年 5 月第 28 卷第 5 期分据报道,CD44 与 HA 结合, 可介导细胞与细胞外基质黏附淋巴细胞归巢等多种生理和病理过程 [3 4] 许多肿瘤细胞表面 CD44 高度表达, 其在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用目前, 已有许多学者以 CD44 为靶点分子, 通过阻断 CD44 HA 结合从而降低肿瘤转移, 进行肿瘤的靶 [5] 向治疗 Zawadzki 等运用 CD44s 受体蛋白 CD44v10 受体蛋白和 CD44 单克隆抗体阻断小鼠 B16F10 黑色素瘤 CD44 与其配体 HA 结合, 发现在不进行任何其他处理的情况下,CD44s 受体蛋白和 CD44v10 受体蛋白可使肿瘤在肺部的转移量分别降低 70% 和 60%,CD44 单克隆抗体也取得了基本相同的效果近年来, 随着纳米载药系统研究的兴起, 纳米颗粒连接靶向分子 HA, 针对肿瘤细胞表面 CD44 进行肿瘤靶向治疗取得很大 [6] 进展 Auzenne 等发现 HA PTX 纳米颗粒对 CD44 阳性人卵巢癌细胞 SKOV 3ip 和 NMP 1 的杀伤活性明显大于单纯 PTX, 加入过量游离的 HA 能够阻断这种增强的杀伤活性, 提示 HA PTX 通过靶向细胞表面 CD44, 达到增强杀伤细胞的效果虽然许多学者成功以 CD44 为靶点,HA 为靶向分子, 靶向杀伤肿瘤, 提高药物疗效 [7 8] 但是, 关于以 CD44 为靶点靶向杀伤肿瘤细胞的同时, 是否会靶向杀伤高表达 CD44 的正常细胞这一问题, 少有报道研究显示 CD44 与 HA 的结合并不完全是自发的, 不同活化状态的 CD44 与 HA 的结合活性不同, 与 CD44 糖基化 [9] 细胞类 [10] [11] 型和 HA 自身状态等因素相关许多肿瘤细胞如乳腺癌细胞肺癌细胞表面 CD44 处于活化状态, 不需要任何刺激因素即能自发结合 HA [12] 正常细胞表面 CD44 处于何种状态, 是否存在上述调控, 目前仍未阐明我们通过检测 CD44 与其天然配体 HA 的结合活性, 探讨正常细胞和乳腺肿瘤细胞表面 CD44 的活化状态是否存在差异, 旨在深入分析以 HA 为靶向分子,CD44 为靶点进行肿瘤靶向治疗的可行性, 明确 HA 是否选择性靶向肿瘤细胞表面 CD44, 而不靶向同样高表达 CD44 的正常细胞材料和方法一细胞乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549, 正常小鼠胚细胞 NIH3T3 均购自中国科学院典型培养物保藏中心 ; 分离 20 名正常人肝素钠抗凝血获取其外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcels, PBMCs) 二主要试剂 RPMI1640 培养液 DMEM 培养液均购自 GIBCO 公司, 淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司,PE 标记的鼠抗人 CD44 单克隆抗体,PE 标记的鼠抗人 CD44 同型对照抗体均购自 ebioscience 公司,PE/Cy5 标记的鼠 CD44 单克隆抗体购自 Abcam 公司, 荧光标记的透明质酸 (FL HA) 购自 Calbiochem 公司三细胞培养将 Hs578T 细胞在 DMEM 培养液 ( 含 10% 胎牛血清 0.01mg/mL 牛胰岛素 ) 中常规培养 ; BT 549 细胞在 RPMI1640 培养液 ( 含 10% 胎牛血清 0.023U/mL 牛胰岛素 ) 中常规培养 ;NIH3T3 细胞在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中培养培养条件均为 5%CO 2 37, 饱和湿度所有实验细胞均取自对数生长期四 Ficol 法分离人外周血单个核细胞取正常人肝素钠抗凝血 4mL, 加入等体积磷酸盐缓冲液 (PBS) 充分混匀, 将其缓慢加入适量淋巴细胞分离液中,800 g 水平离心 15min, 小心吸取白膜层, 用 PBS400 g 离心 10min 洗涤 2 遍, 即获取人外周 PBMCs 五流式细胞术鉴定细胞表面 CD44 的表达分别取肝素钠抗凝血 100μL, 加入 2 个流式专用管中, 实验组加入适量 CD44 PE 单克隆抗体, 阴性对照加入等体积 CD44 PE 同型对照抗体, 轻轻混匀, 室温避光孵育 15~30min 后, 在 QPREP 免疫学样品制备仪 (COULTER 公司生产 ) 上处理血标本, 流式细胞仪分析结果 0.25% 胰酶分别消化处于对数生长期的 NIH3T3 细胞 Hs578T 细胞和 BT 549 细胞, 显微镜下观察细胞呈单细胞悬液时用含血清的培养液终止消化, 200 g 离心 5min, 弃上清, 再用适量 PBS 洗涤 2 遍计数, 所有细胞均按每管约 10 6 个细胞的比例, 收集至 2 个 Eppendorf 管中 NIH3T3 细胞实验组加入适量鼠 CD44 单克隆抗体, 乳腺肿瘤细胞实验组加入适量鼠抗人 CD44 单克隆抗体, 对照组加入等体积 CD44 同型对照抗体, 室温避光放置 15~30min,PBS 洗涤 2 遍,500μLPBS 重悬, 移至流式管中上机检测, 收集个细胞, 荧光强度以对数放大, 结果用 CD44 细胞的阳性率表

3 427 示, 数据用软件进行分析六流式细胞术检测细胞表面 CD44 的活化状态用 Ficol 法分离获取 2 管人外周 PBMCs, 每管细胞数量约在 10 6 左右 0.25% 胰酶分别消化处于对数生长期的小鼠胚细胞 NIH3T3 和乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549, 显微镜下观察细胞呈单细胞悬液时用含血清的培养液终止消化, 200 g, 离心 5min, 弃上清, 再用适量 PBS 洗涤 2 遍,PBS 重悬后计数, 所有细胞均按比例收集于 2 个 Eppendorf 管中, 每管约 10 6 个细胞每种细胞均分为实验管和对照管, 实验管加入 40μg/mL FL HA100μL 重悬, 对照管加入 100μL 培养液, 37 避光孵育 2h 然后用 PBS 洗涤 2 遍, 移至流式管中, 上机检测七细胞免疫荧光法观察 FL HA 与细胞表面 CD44 的靶向结合作用分别收集对数生长期的小鼠胚细胞 NIH3T3 和人乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549, 消化至单细胞呈单个悬液, 接种到 24 孔培养板中, 培养 24~ 48h, 随机分为实验组和对照组, 每组设双复孔, 实验组加入 40μg/mLFL HA200μL, 对照组加入 200μL 培养液,37 避光孵育 1h,PBS 洗涤 2 遍, 荧光显微镜下观察八统计学方法采用 SPSS13.0 软件对数据进行统计分析, 结果用 x±s 珋表示, 采用单因素方差分析 (One way ANOVA) 进行各组间均数比较 P<0.05 表示差异有统计学意义 2.65)% (14.33±1.35)% (93.4±6.40)% 和 (94.70±0.15)%,PBMCs NIH3T3 细胞与乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549 表面 CD44 活化差异有统计学意义 (P<0.05), 提示上述正常细胞表面 CD44 处于相对静止状态, 乳腺肿瘤细胞表面 CD44 处于活化状态注 :A 为 Hs578T 细胞 ;B 为 BT 549 细胞 ;C 为 NIH3T3 细胞 ; D 为正常人 PBMCs 图 1 流式细胞术检测细胞表面 CD44 的表达结果一正常细胞与肿瘤细胞表面 CD44 的表达正常人 PBMCs NIH3T3 细胞及 Hs578T 细胞 BT 549 细胞均高表达 CD44, 见图 1 CD44 细胞的阳性率分别为 (99.57±0.31)% (99.26± 0.81)% (99.85 ±0.21)% 和 (99.99 ± 0.10)%, 各组间 CD44 表达差异无统计学意义 (P>0.05) 二正常细胞与肿瘤细胞表面 CD44 的活化状态正常人 PBMCs NIH3T3 细胞表面 CD44 与 HA 结合活性较低 ; 乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549 表面 CD44 与 HA 结合活性较高,CD44 处于活化状态, 见图 2 CD44 活化阳性率分别为 (3.61± 注 :Hs578T(A) 和 BT 549(B) 细胞实验组荧光强度较对照组明显增强 ;NIH3T3 细胞 (C) 和正常人 PBMCs(D) 之间无明显变化图 2 流式细胞术检测细胞表面 CD44 的活化三 FL HA 与细胞表面 CD44 的靶向结合在荧光显微镜下观察可见, 与 FL HA 孵育后, NIH3T3 细胞与对照组荧光强度无明显差异, 表明 FL HA 基本不与细胞表面 CD44 结合, 无靶向作用,CD44 处于相对静止状态 ; 而乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549 与对照组相比, 细胞表面发呈现出强绿色荧光, 提示 FL HA 与肿瘤细胞表面 CD44 高度靶向结合,CD44 处于活化状态, 见图 3

428 检验医学 2013 年 5 月第 28 卷第 5 期注 :Hs578T 和 BT 549 细胞呈现强绿色荧光,NIH3T3 细胞基本无绿色荧光图 3 细胞免疫荧光观察 FL HA 与细胞表面 CD44 结合活性讨论近年研究发现, 黏附分子 CD44 在许多恶性肿瘤细胞表面高度表达, 如乳腺癌结肠癌等其与肿瘤的侵袭和转移密切相关, 特别是与天然配体 HA

4 428 检验医学 2013 年 5 月第 28 卷第 5 期注 :Hs578T 和 BT 549 细胞呈现强绿色荧光,NIH3T3 细胞基本无绿色荧光图 3 细胞免疫荧光观察 FL HA 与细胞表面 CD44 结合活性讨论近年研究发现, 黏附分子 CD44 在许多恶性肿瘤细胞表面高度表达, 如乳腺癌结肠癌等其与肿瘤的侵袭和转移密切相关, 特别是与天然配体 HA 的结合在肿瘤恶性进展中的作用受到广泛关注 [13] 目前已有学者运用 HA CD44 单克隆抗体 CD44 受体蛋白等阻断 CD44 与 HA 的结合, 有效减小肿瘤体积, 抑制肿瘤转移 ; 以 HA 为靶向分子制作的药物通过结合靶点 CD44 有效地提高了药物在肿瘤部位的聚集, 增加药物的生物利用度, 达到靶向治疗肿瘤的效果尽管许多学者已将肿瘤细胞表面高表达的 CD44 作为靶点进行肿瘤靶向治疗研究, 但在 HA 化疗药靶向结合肿瘤细胞表面 CD44, 提高药物对肿瘤细胞的杀伤效果的同时, 机体许多正常细胞同样高表达 CD44, 是否能够免受靶向药物的杀伤, 及其如何免受其杀伤的机制, 目前少有研究本研究分析了正常人 PBMCs NIH3T3 细胞和乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549 表面的 CD44 表达及其活化状态即其与 HA 的结合活性首先采用流式细胞术检测上述正常和肿瘤细胞表面 CD44 的表达水平, 结果显示正常人 PBMCs NIH3T3 细胞和乳腺肿瘤细胞 Hs578T BT 549 均高表达 CD44, 阳性率在 95% 以上, 验证了在正常细胞和肿瘤细胞表面 CD44 均存在高表达的现象在此基础上, 应用 FL HA 通过流式细胞术检测 CD44 与 HA 的结合活性结果显示正常人 PBMCs NIH3T3 细胞表面 CD44 与 HA 结合的活性较低, 分别为 (3.61±2.65)% 和 (14.33± 1.35)%; 乳腺肿瘤细胞表面 CD44 与 HA 的结合活性远远高于正常人 PBMCs 和 NIH3T3 细胞, 均高于 90% 正常与肿瘤细胞表面 CD44 与 HA 的结合活性存在相对差异本研究进一步阐明了正常细胞和肿瘤细胞表面 CD44 的活化状态差异影响 HA 与其靶向结合的能力 NIH3T3 细胞中加入 FL HA 孵育后, 荧光显微镜下观察显示 NIH3T3 基本无荧光, 提示 CD44 处于相对静止状态,FL HA 与其靶向结合很弱而肿瘤细胞表面呈现强绿色荧光, 提示乳腺肿瘤细胞表面 CD44 处于活化状态,FL HA 与其有很强的靶向结合活性这一现象说明以 HA 为靶向分子, 以 CD44 为靶点制备抗肿瘤药物, 药物能够选择性靶向高表达 CD44 的肿瘤细胞, 有效提高药物对肿瘤的杀伤作用, 但同样高表达 CD44 的正常细胞, 由于 CD44 处于相对静止状态, 与 HA 结合活性较低, 药物对其无靶向及杀伤作用这一结果提示,HA 在靶向杀伤高表达 CD44 的肿瘤细胞时, 机体高表达 CD44 的正常组织可以免受其杀伤综上所述, 本研究初步发现了 CD44 分布于正常和肿瘤细胞上的活化状态不同以 HA 为靶向分子 CD44 为靶点进行肿瘤靶向治疗时, 能够特异杀伤肿瘤细胞, 有效避免靶向杀伤高表达 CD44 的正常细胞, 为以 CD44 为靶点进行的肿瘤靶向治疗研究提供了新的依据但本研究对 CD44 活化状态的研究尚处于初级阶段, 所用细胞局限为乳腺肿瘤细胞, 其他肿瘤尚未涉及, 有待进一步探索另外, 有关正常与肿瘤细胞表面不同活化状态 CD44 的产生机制及其生物学意义, 仍需进一步深入研究参考文献 [1] Orian RousseauV.CD44,atherapeutictarget formetastasisingtumours[j].eurjcancer,2010, 46(7): [2] TooleBP,SlomianyMG.Hyaluronan,CD44and Emmprin:partnersin cancercelchemoresistance [J].DrugResistUpdat,2008,11(3): [3] CoussensLM,WerbZ.Inflammatorycelsand cancer:thinkdiferent[j].jexpmed,2001,193

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12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot