第 4 期钟晓敬, 等. 肿瘤相关巨噬细胞肝 X 受体的激活对抗瘤应答的影响 303 erxreceptors,lxrs) 亦称为肝脏核受体, 属于编码转录因子的核受体超基因家族成员, 不仅参与机体代谢调节, 还可以调节巨噬细胞参与的炎症反应, 人工合成的 LXRs 激动剂可以抑制炎症的发生 LX

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纲闻人
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1 第 22 卷第 4 期 2012 年 7 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.22 No.4 Jul.2012 肿瘤相关巨噬细胞肝 X 受体的激活对抗瘤应答的影响钟晓敬 1,2, 王秀珍 3 2, 盛宏光 (1. 江苏大学临床医学院, 江苏镇江 ;2. 上海市徐汇区中心医院内分泌科, 上海 ;3. 郑州市第一人民医院检验科, 河南郑州 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究肿瘤微环境肝 X 受体 (liverxreceptors,lxrs) 与肿瘤相关巨噬细胞 (tumor asociatedmac rophage,tam) 的形成及其功能之间的关系方法 : 提取肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞, 同时提取腹腔巨噬细胞作为对照在体外实验中巨噬细胞与肿瘤细胞共培养或者使用肿瘤上清处理巨噬细胞, 实时 PCR 检测巨噬细胞 LXRs IL 10 IL 12 的 mrna 水平 ; 分别激活 LXR 和阻断 LXR 信号通路, 观察其对 TAM 形成的影响结果 : 肿瘤微环境可诱导巨噬细胞 LXRs 受体高表达, 并表现为 M2 型巨噬细胞的表型, 激活 LXRs 可以促进巨噬细胞向 TAM 转变, 而阻断 LXR 信号通路则抑制 TAM 的形成结论 : 肿瘤微环境能激活 LXRs, 从而诱导 TAM 的形成, 并促进肿瘤生长转移和免疫逃逸 [ 关键词 ] 肝 X 受体 ; 肿瘤相关巨噬细胞 ; 免疫逃逸 [ 中图分类号 ] R730.3 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2012) Tumor asociatedmacrophageimpactsanti tumorresponsesthrough activationofliverxreceptors ZHONGXiao jing 1,2,WANGXiu zhen 3,SHENGHong guang 2 (1.SchoolofClinicalMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212001;2.DepartmentofEndocrine,XuhuiDistrictCentralHospi tal,shanghai200031;3.departmentofclinicallaboratory,thefirstpeople shospitalofzhengzhou,zhengzhouhenan450004,china) [Abstract] Objective:ToinvestigatetheconnectionbetweentumormicroenvironmentandliverXre ceptors(lxrs),andtheirfunctiononthedevelopmentoftumor asociatedmacrophage.methods:mac rophagesweresortedfromtumortisueandperitoneallavagefluid,theexpresionleveloflxrs,il10 andil12weredeterminedbyreal timepcr.theinternalrelationsamongmicroenvironment,lxrre ceptorsandtam wereexploredinseperatedexperimentsasfolows:macrophagescellineraw264.7 wereco culturedwithtumorcellinetc 1,ortreatedwithtumorsupernatantorLXRagonists,orthe LXRsignalingpathwayinmacrophageswereblocked,thenthephenotypesandfunctionsofmacrophages weredetermined.results:tumormicroenvironmentcouldpromotetheexpresionoflxrreceptors,and inducethem2subsetphenotypeofmacrophages.theactivationoflxrreceptorscouldalsoinducethe M2phenotype,andtheefectcouldbereversedwhentheLXRsignalingpathwayinmacrophageswere blocked.conclusion:lxrcouldbeactivatedbytumormicroenvironment,theninducetheaccumulation oftam,andactivatetheirfunctiononpromotethegrowth,metastasis,andimmuneevasionoftumor. [Keywords] liverxreceptors;tumor asociatedmacrophage;immuneevasion 巨噬细胞是先天性免疫和获得性免疫应答的重要组成部分, 在抵御病原体的入侵, 保护机体健康方面发挥着重要作用然而, 在肿瘤微环境中, 巨噬细胞所能发挥的正面作用却极其有限, 与在抗感染免疫中所发挥的作用相反, 肿瘤组织中有大量的巨噬细胞聚集, 它们具有促进肿瘤生长转移以及肿瘤免疫逃逸的作用 [1], 被称为肿瘤相关巨噬细胞 (tumor asoci atedmacrophage,tam) 虽然在抗感染免疫中, 巨噬细胞的功能基本阐明, 但人们对其在肿瘤微环境中所起的作用及机制的认识, 还非常有限肝 X 受体 (liv [ 作者简介 ] 钟晓敬 (1982 ), 女, 硕士研究生 ; 盛宏光 ( 通讯作者 ), 教授, 主任医师, 硕士生导师,E mail:shenghg1953@gmail.com

2 第 4 期钟晓敬, 等. 肿瘤相关巨噬细胞肝 X 受体的激活对抗瘤应答的影响 303 erxreceptors,lxrs) 亦称为肝脏核受体, 属于编码转录因子的核受体超基因家族成员, 不仅参与机体代谢调节, 还可以调节巨噬细胞参与的炎症反应, 人工合成的 LXRs 激动剂可以抑制炎症的发生 LXRs 激动剂的这种作用类似于巨噬细胞 M2 效应, 因而我们考虑, 肿瘤微环境中巨噬细胞的聚集, 进而向 M2 转化, 即形成 TAM, 可能是由 LXRs 介导本文通过小鼠体内实验与体外实验, 研究了肿瘤微环境肝 X 受体 TAM 之间的关系, 以阐述肿瘤生长转移免疫逃逸的新机制 1 材料与方法 1.1 材料雄性 C57BL/6 小鼠 10 只 (SPF 级,8 周龄 ), 由中科院营养所实验动物中心提供及代养小鼠睾丸间质细胞瘤细胞 (TC 1) 小鼠肺癌细胞 (LLC) 和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞 (RAW264.7) 购自中科院细胞库小鼠 IL 10 试剂盒为 R&DSystems 公司产品 PercpCy5.5 F4/80 流式抗体为 ebioscience 公司产品, 中科院营养所提供流式检测和细胞分选服务 (BectonDickinson,FACSAria) Trizol 为 In vitrogen 公司产品逆转录和实时 PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司引物为上海生工公司合成 GW3965 购自 Sigma 公司 1.2 方法动物模型制备雄性 C57BL/6 小鼠 10 只, 右侧背部皮下注射 LLC 肿瘤细胞 / 只,3 周后, 肿瘤直径 2cm 左右, 进行样本采集标本采集将肿瘤小鼠处死, 使用 5mlPBS 腹腔灌洗, 抽出腹腔灌洗液 r/min 离心 5min, 弃上清, 沉淀中细胞重悬, 取大约细胞做 PercpCy5.5 F4/80 染色, 流式分选 F4/80 阳性细胞, 即腹腔巨噬细胞 (peritonealmacrophage,pm) 取肿瘤组织, 尽可能剪碎, 加 2mg/ml 的胶原酶 Ⅳ 至组织完全覆盖,37 消化 1h, 将组织研磨, 过 70μm 细胞筛, 滤过的单细胞悬液 1000r/min 离心 5min, 弃上清, 沉淀加红细胞裂解液 5ml, 重悬细胞,5min 后加 PBS45ml,1000r/min 离心 5min, 弃上清,5ml PBS 重悬细胞, 计数细胞, 取大约细胞加 20 ml 含 5%FBS 的 RPMI1640 培养基, 于培养箱培养 1h, 此时巨噬细胞贴壁而肿瘤细胞仍处于悬浮状态, 弃培养基, 收集贴壁细胞, 做 PercpCy5.5 F4/80 染色, 流式分选 F4/80 阳性细胞, 即 TAM 细胞另一部分肿瘤细胞, 按照每的细胞, 加 1ml 含 10% FBS 和 1% 青链双抗的 RPMI1640 培养基, 于细胞培养箱中培养 24h, 收集上清备用实时 PCR 检测 mrna 表达水平使用 Tr izol 抽提 PM 和 TAM 的总 RNA, 逆转录为 cdna, 实时 PCR 检测相应基因的表达水平小鼠 LXRα 上游引物 :ATGATGCTGAGTTTGCTCTGC, 下游引物 : TATGTGTGTTGCAGCCTCTCT;IL 10 上游引物 : CCAGTCGGCCAGAGCCACAT, 下游引物 :AAG GAGTCGGTTAGCAGTA;IL 12 上游引物 :TGCCCTC CTAAACCACCT, 下游引物 :TCTGGCCGTCTTCAC CATG;LXRβ 上游引物 :GCAAGGACGACTTCCAC CG, 下游引物 :GGCGATAAGCAAGGCATACTCT 统计学分析实验结果以 x±s 表示, 采用 SPSS13.0 进行统计学分析, 组间比较采用 t 检验, 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 流式分选 TAM 和 PM 结果为了分析 TAM 的表型及其功能, 通过流式细胞术分选出肿瘤组织中的巨噬细胞, 同时分选出腹腔灌洗液中的巨噬细胞, 见图 1 图 1 流式细胞术分选巨噬细胞结果 Fig1 Macrophagesweresortedbyflowcytometer 2.2 TAM 中肝 X 受体 IL 10 和 IL 12 的表达与 PM 相比,TAM 高表达 LXRs, 并且符合 M2 型巨噬细胞的表型, 表现出高表达 IL 10 低表达 IL 12 的特征 ( 表 1) 相关性分析结果显示,LXRα 表达水平与 IL 10 呈正相关, 而与 IL 12 呈负相关 ( 图 2)

3 304 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷表 1 LXRα LXRβ IL 10 IL 12mRNA 的相对表达 Tab1 ExpresionofLXRα LXRβ IL 10 andil 12mRNA LXRα LXRβ IL 10 IL 12 PM 1.2± ± ± ±0.02 TAM 3.0± ± ± ±0.01 t P 图 2 LXRα 与 IL 10 IL 12 的相关性 Fig2 CorrelationalanalysesbetweenLXRαandIL 10,IL 肿瘤微环境对 RAW264.7 细胞 LXRs 和 IL 10 IL 12 表达的影响为进一步验证肿瘤微环境与 TAM 表型的关系, 在 Transwel 体系, 我们将癌细胞系 TC 1 与 RAW264.7 共培养, 发现 RAW264.7 细胞 LXRs 的表达水平升高, 并且表现出 TAM 表型, 即高表达 IL 10, 低表达 IL 12( 表 2) 在 RAW264.7 单独培养条件下, 往培养基里添加 20% 的 LLC 肿瘤上清, 得到了与共培养相一致的结果 ( 表 3) 这说明, 肿瘤微环境能诱导巨噬细胞表现为 M2 表型, 这与 TAM 中表型相一致 2.4 LXRs 的激活能够诱导 RAW264.7 表现出 TAM 表型在 RAW264.7 单独培养的条件下, 加入 LXRs 的激动剂 GW3965, 结果显示,RAW264.7 同样表现出了 TAM 的表型 ( 表 4) 表 2 RAW264.7 与 TC 1 共培养 96h 后 LXRα LXRβ IL 10 IL 12mRNA 的表达 Tab2 ExpresionofLXRα LXRβ IL 10andIL 12mRNAofRAW264.7co culturedwithtc 1celfor96h 细胞 LXRα LXRβ IL 10 IL 12 RAW ± ± ± ±0.02 RAW264.7+TC ± ± ± ±0.02 t P 表 3 RAW264.7 与 LLC 肿瘤上清共培养后 LXRα LXRβ IL 10 IL 12mRNA 的表达 Tab3 ExpresionofLXRα LXRβ IL 10andIL 12mRNAafterculturingintumorsupernatants 细胞 LXRα LXRβ IL 10 IL 12 RAW ± ± ± ±0.02 RAW264.7+LLC 2.69± ± ± ±0.02 t P 表 4 RAW264.7 在 GW3965 刺激 48h 后 IL 10 IL 12mRNA 的表达 Tab4 ExpresionofIL 10andIL 12mRNAofRAW264.7 stimulatedbygw3965for48h 细胞 IL 10 IL 12 RAW ± ±0.01 RAW264.7+GW ± ±0.02 t P 抑制 LXRs 信号通路后 RAW264.7 的 LXRs 和 IL 10 表达为进一步证实 LXRs 与巨噬细胞 TAM 表型化之间的关系, 在 Transwel 体系, 将 RAW264.7 与癌细胞系 TC 1 共培养 48h 后, 加入 zaragozic acid 共培养 48h 结果表明,RAW264.7 的 LXRs mrna 水平显著下降, 且 IL 10 的表达也显著下降 ( 表 5)

4 第 4 期钟晓敬, 等. 肿瘤相关巨噬细胞肝 X 受体的激活对抗瘤应答的影响 305 表 5 加入 zaragozicacid 后 RAW264.7+TC 1 中 LXRα LXRβ 和 IL 10mRNA 水平 Tab5 ExpresionofLXRα LXRβ IL 10mRNAofRAW264.7+TC 1afteraddingthezaragozicacid 细胞 LXRα LXRβ IL 10 RAW264.7+TC ± ± ±0.01 RAW264.7+TC 1+zara 0.21± ± ±0.01 t P 讨论肿瘤细胞能够利用巨噬细胞的功能可塑性, 对巨噬细胞的分化和激活进行重塑, 从而逃脱巨噬细胞的免疫监视, 并且使得重塑后的巨噬细胞, 即 TAM, 具有促进肿瘤生长转移促进肿瘤免疫逃逸的作用巨噬细胞主要有 M1 和 M2 两个亚型,M1 型巨噬细胞具有高抗原递呈能力, 高表达 IL 12 和 IL 23 [2], 低表达 IL 10, 能激活 Th1 型免疫应答 ;M2 巨噬细胞高表达 IL 10, 而 IL 12 低表达 [3] IL 10 IL 12 表达水平的不同也成为区分 M1 M2 型巨噬细胞的主要标记 [4] 研究表明,TAM 在表型和功能上更类似于 M2 型巨噬细胞在表型上,TAM 与 M1 型巨噬细胞相反, 几乎不能分泌或很少分泌 IL 10 IL 23; 和 M2 型巨噬细胞的表型类似,TAM 高表达 IL 10 在功能上,TAM 能够促进肿瘤的生长转移, 促进血管发生, 促进组织的重塑与修复, 抑制获得性免疫反应等 [3,5-6] 肿瘤微环境通过作用于免疫应答的不同阶段和免疫系统的不同细胞而产生肿瘤的免疫逃逸, 其中 TAM 发挥了重大的作用 TAM 不仅能够直接作用肿瘤细胞, 促进肿瘤细胞的生长转移等, 也能抑制其他免疫细胞对肿瘤细胞的免疫应答如果特异性清除 TAM, 消除其促肿瘤生长转移促血管形成抑制获得性免疫等作用, 或者诱导 TAM 由 M2 型表型向 M1 型转化, 将对肿瘤的治疗大有裨益,TAM 可能是肿瘤生物治疗的一个新的潜在靶点 LXRs 属于编码转录因子的核受体超基因家族成员, 对脂类代谢基因有重要的转录调控作用 LXRs 有 α 和 β 两个亚型,LXRα 主要分布于肝脏肾脏小肠脂肪组织巨噬细胞肺和脾脏, 肝脏分布量最多而 LXRβ 在全身各个组织和器官都有分布 LXRs 不仅参与机体胆固醇的代谢, 还参与脂肪糖类代谢, 对于维持机体的代谢平衡发挥着重要作用 [7-8] 近几年的研究显示,LXRs 还可以参与巨噬细胞免疫与炎症反应, 人工合成的 LXRs 激动剂 (GW3965,T ) 可以抑制炎症的发生 [8] 研究发现 VEGF 是 LXRs 的一个靶点 [9], 而 VEGF 对于血管的发生具有重要作用因此,LXRs 也成为连接代谢和免疫的纽带和桥梁近期研究发现 [10], 肿瘤微环境可激活树突状细胞 LXRs 表达, 而 LXRs 的激活将会抑制树突状细胞 CCR7 的表达 CCR7 和树突状细胞的抗原递呈作用是密不可分的, 因此,LXRs 的激活可能会帮助肿瘤逃脱免疫监视, 从而抑制机体的抗肿瘤应答我们猜测,LXRs 可能与 TAM 的促肿瘤作用具有一定的联系本研究结果表明,LXR 表达水平与 IL 10 呈正相关, 而与 IL 12 呈负相关在体外情况下, 我们将癌细胞系 TC 1 与 RAW264.7 共培养, 发现 RAW264.7 细胞 LXR 的表达水平升高并且表现出 TAM 型 ;LXRs 的激动剂 GW3965 可以促进 RAW264.7 细胞表现出 TAM 的表型我们推测, 在肿瘤微环境中存在能够激活 LXRs 的物质并且 LXRs 的激活使得 TAM 高表达 IL 10, 低表达 IL 12, 呈现出 M2 型表型, 这与文献报道的推测相一致 [10] 为进一步证实 LXRs 与巨噬细胞 TAM 表型化之间的关系, 我们在体外将 RAW264.7 与癌细胞系 TC 1 共培养 48h 后, 加入 zaragozicacid 再刺激共培养 48h, 结果表明 RAW264.7 细胞 LXRsmRNA 水平下降, 并且 IL 10 表达水平也显著下降 zara gozicacid 的加入, 抑制了癌细胞产生氧化甾醇的能力, 从而限制 TAM LXRs 配体的生成, 因此, 从源头上切断或限制了 LXRs 信号通路从以上的实验我们可以得出 : 肿瘤微环境可诱导巨噬细胞肝 X 受体高表达, 并表现为 M2 型巨噬细胞的表型, 激活肝 X 受体可以促进巨噬细胞向 TAM 转变, 而阻断 LXR 信号通路则抑制 TAM 的形成肿瘤微环境能激活肝 X 受体, 从而诱导 TAM 的形成, 并促进肿瘤生长转移和免疫逃逸, 而 LXRs 也可能成为治疗肿瘤的一个新的切入点 [ 参考文献 ] [1]BalkwilF.Cancerandthechemokinenetwork[J].Nat

5 306 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷 RevCancer,2004,4(7): [2]VereckFA,deBoerT,LangenbergDM,etal.Human IL 23 producingtype1macrophagespromotebutil 10 producingtype2macrophagessubvertimmunityto(my co)bacteria[j].procnatlacadsciusa,2004,101 (13): [3]MantovaniA,SicaA,LocatiM,etal.Macrophagepolari zationcomesofage[j].immunity,2005,23(4): [4]SicaA,SchioppaT,MantovaniA.Tumour asociated macrophagesareadistinctm2polarisedpopulationpromo tingtumourprogresion:potentialtargetsofanti cancer therapy[j].eurjcancer,2006,42(6): [5]AlavenaP,SicaA,SolinasG,etal.Theinflammatory micro environmentintumorprogresion:theroleoftumor asociatedmacrophages[j].critrevoncolhematol, 2008,66(1):1-9. [6]MantovaniA,SozaniS,LocatiM,etal.Macrophagepo larization:tumor asociatedmacrophagesasaparadigm forpolarizedm2mononuclearphagocytes[j].trendsim munol,2002,23(11): [7]BensingerSJ,TontonozP.Integrationofmetabolism and inflammationbylipid activatednuclearreceptors[j]. Nature,2008,454(7203): [8]ZelcerN,TontonozP.LiverXreceptorsasintegratorsof metabolicandinflammatorysignaling[j].jclininvest, 2006,116(3): [9]WalczakR,JosephSB,LafiteBA,etal.Transcriptionof thevascularendothelialgrowthfactorgeneinmacrophages isregulatedbyliverx receptors[j].jbiolchem, 2004,279(11): [10]VilablancaEJ,RaccostaL,ZhouD,etal.Tumor media tedliverx receptor alphaactivationinhibitsccchemo kinereceptor 7expresionondendriticcelsanddampens antitumorresponses[j].natmed,2010,16(1): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志 ( 上接第 301 页 ) [3]MigitaK,KogaT,TorigoshiT,etal.Serum amyloida proteinstimulatesccl20productioninrheumatoidsyno viocytes[j].rheumatology(oxford),2009,48(7): [4]ReavenGM.Bantinglecture1988.Roleofinsulinresist anceinhumandisease[j].diabetes,1988,37(12): [5]LakkaHM,LaaksonenDE,LakkaTA,etal.Themeta bolicsyndromeandtotalandcardiovasculardiseasemor talityinmiddle agedmen[j].jama,2002,288(21): [6]Py r lak.relationshipofglucosetoleranceandplasma insulintotheincidenceofcoronaryheartdisease:results from twopopulation studiesin Finland[J]. Diabetes Care,1979,2(2): [7]NinomiyaJK,L ItalienG,CriquiMH,etal.Asociation ofthemetabolicsyndromewithhistoryofmyocardialin farctionandstrokeinthethirdnationalhealthandnutri tionexaminationsurvey[j].circulation,2004,109(1): [8]FestaA,D AgostinoRJr,HowardG,etal.Chronicsub clinicalinflammationaspartoftheinsulinresistancesyn drome: the Insulin Resistance Atherosclerosis Study (IRAS)[J].Circulation,2000,102(1): [9]HotamisligilGS,ShargilNS,SpiegelmanBM.Adipose expresionoftumornecrosisfactor alpha:directroleino besity linkedinsulinresistance[j].science,1993,259 (5091): [10]NishimuraS,ManabeI,NagasakiM,etal.CD8+efec tortcelscontributetomacrophagerecruitmentandadi posetisueinflammationinobesity[j].natmed,2009, 15(8): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志