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墩恋终
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1 第 33 卷第 2 期大连海洋大学学报 Vol. 33 No 年 4 月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr DOI: / j.cnki.dlhyxb 文章编号 : (2018) 鲤 HSP90 作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究金晔 1 ꎬ 袁海延 1 ꎬ 王好 1 ꎬ 周井祥 1 ꎬ 刘艳辉 2 ꎬ 李改娟 2 2 ꎬ 祖岫杰 (1 吉林农业大学动物科学技术学院 ꎬ 吉林长春 ꎻ 2 吉林省水产科学研究院 ꎬ 吉林长春 ) 摘要 : 为研究鲤热休克蛋白 90 (HSP90) 的免疫效果 ꎬ 根据鲤 HSP90 mrna 的基因序列 (GenBank)ꎬ 构建真核表达质粒 pegfp-c1-hsp90ꎬ 并将 pegfp-c1-hsp90 转染至鲤脑细胞 (CCB) 中 ꎬ 荧光倒置显微镜下观察显示 ꎬ 重组质粒 pegfp-c1-hsp90 在 CCB 中成功表达 ꎻ 以不同免疫剂量的重组表达质粒与 pires- ORF81 联合免疫鲤 ꎬ 通过间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测免疫前后抗体水平 ꎮ 结果表明 : 注射重组质粒的血清中能够检测到 KHV 特异性抗体 ꎬ 其抗体水平随着免疫次数的增加而增加 ꎬ 第三次免疫后两周 ꎬ 抗体水平达到最高 ꎻ 联合免疫与单独免疫核酸疫苗 pires-orf81 相比 ꎬ 抗体水平明显增加 ꎬ 但无显著性差异 (P>0 05)ꎮ 研究表明 ꎬ 鲤 HSP90 作为锦鲤疱疹病毒的免疫佐剂具有一定的目标效果 ꎮ 关键词 : 鲤热休克蛋白 90 (CHSP 90)ꎻ pires-orf81ꎻ 免疫试验中图分类号 : Q954 4 文献标志码 : A 锦鲤疱疹病毒病 ( Koi Herpesvirus Dieaseꎬ KHVD) 是由锦鲤疱疹病毒 ( Koi Herpesvirusꎬ KHV) 引起的一种高致病性和高死亡率的病毒性疾病 ꎬ 死亡率高达 80%ꎮ KHVD 是世界动物卫生组织 (OIE) 必报疾病之一 [1] ꎬ 给中国及世界多个国家鲤和锦鲤养殖业造成了严重的经济损失 ꎮ 目前 ꎬ 没有可供使用的特效药物来治疗该种疾病 ꎬ 接种疫苗一直被认为是有效的治疗病毒性疾病的手段 ꎬ 但免疫效果一直未能达到良好的目标效果 [2] ꎮ 热休克蛋白 ( Heat shock proteinꎬ HSP) 是细胞或生物体在各种不利条件 ( 包括缺氧盐度重金属自由基病毒感染 ) 刺激下产生的与抗逆性相关的一类应激蛋白 [3-5] ꎮ 根据分子量和等电点的不同 ꎬ 划分为七大家族 : 小 HSP HSP40 HSP60 HSP70 HSP90 HSP1 和泛素 [6] ꎮ 在免疫过程中 ꎬ 热休克蛋白可以作为佐剂抗原抗原载体 ꎬ 能提高专一性免疫效果 [7] ꎮ 研究人员通过构建重组 HSP- 肽段复合体进行抗肿瘤免疫试验发现 ꎬ HSP 既具有增强免疫的功能 ꎬ 又具有免疫佐剂的一系列特征 ꎻ 在抗原呈递中通过 HSP 将内源性和外源性抗原呈递给 MHC Ⅰ 分子 ꎬ 专一启动 CD8 + T 细胞 ꎬ 激活 CTLs 免疫应答 [8-11] ꎮ 与其他 HSP 家族相比 ꎬ HSP90 家族含量丰富 ꎬ 具有非常高的保守性 [12] ꎮ HSP90 可与细胞中多种不同功能的蛋白结合形成复合物 ꎬ 调节细胞的活性 ꎬ 增强结构稳定性 [13] ꎮ 当受到有害物质胁迫时 ꎬ HSP90 表达水平提高 ꎬ 产生热耐受作为分子伴侣来帮助细胞 ꎬ 维持机体稳态 [14-15] ꎮ 近年来 ꎬ HSP 所具有的免疫增强作用在核酸疫苗中应用广泛 ꎮ 焦 [14] 凤平等将重组质粒 PC-P6-gBCTL-HSP70 与单纯疱疹病毒 Ⅱ 型 ( HSV - 2) 疫苗联合免疫发现 ꎬ 其具有同时增强体液免疫与细胞免疫的功能 ꎻ 李淑 [15] 君研究发现 ꎬ 加入佐剂 HSP65 后与 DNA 质粒联合 ꎬ 比单一灭活苗或单一 DNA 质粒诱导细胞免疫 [16] 水平均高 ꎻ Bolhassani 等研究发现 ꎬ HSPgp96 作为佐剂与人体乳头瘤 E7 ( HPV E7 蛋白 ) 联合免疫显示 ꎬ 其具有特异性细胞免疫应答 ꎮ 因此 ꎬ 加入相关热休克蛋白佐剂以提高核酸疫苗免疫效果是必不可少的 ꎮ 目前 ꎬ HSP90 在作为水产动物免疫佐剂方面的应用还不常见 ꎮ 本研究中通过构建 pegfp -C1- HSP90 真核表达载体 ꎬ 探究 pegfp-c1-hsp90 作收稿日期 : 基金项目 : 国家大宗淡水鱼产业技术体系建设项目 ( CARS-45-35)ꎻ 国家公益性行业科研专项 ( ) 作者简介 : 金晔 (1992)ꎬ 女 ꎬ 硕士研究生 ꎮ @ qq com 通信作者 : 祖岫杰 (1964)ꎬ 男 ꎬ 研究员 ꎬ zuxiujie@ 163 comꎻ 周井祥 (1965)ꎬ 男 ꎬ 教授 ꎬ zhjxnd@ 126 com

2 176 大连海洋大学学报第 33 卷为免疫佐剂与 pires-orf81 核酸疫苗 ( 吉林农业大学动物科学技术学院重点实验室基于 KHV 主要保护性抗原囊膜蛋白 ORF81 研制的 KHV 核酸疫苗 ꎬ 保护率达 80% 以上 ꎬ 专利号为 CN A) [17-19] 联合免疫的免疫效果 ꎬ 旨在为锦鲤疱疹病毒病的治疗提供新思路 ꎮ 1 材料与方法 1 1 材料试验鱼试验鱼购自长春市某养鱼场 ꎬ 选取体质量为 200 ~ 300 g 的健康鲤 150 尾 ꎬ 在实验室 25 水族箱中饲养 2 周以上 ꎮ 质粒细胞病毒重组质粒 pires - ORF81 KHV 阳性血清和鲤脑细胞 ( CCB) 由吉林农业大学动物科学技术学院保存和冻存 [20] ꎮ 试验试剂 DNA Marker ( DL2000 DL5000) 及反转录酶限制性内切酶 T4DNA 连接酶均为 TaKaRa 产品 ꎻ 凝胶回收试剂盒卡那霉素氨苄青霉素购自 AxyGen 公司 ꎻ 焦磷酸二乙酯 (DEPC) 购自北京鼎国公司 ꎻ EndoFectin TM-Max 转染试剂购自长春维尔特科技有限公司 ꎻ 抗鲤 IgM 单克隆抗体购自 AQUATIC Diagnostic Ltdꎻ 羊抗鼠酶标二抗购自三箭生物科技有限公司 ꎻ 其他试剂均为国产分析纯级别 ꎮ 1 2 方法 HSP90 基因的引物设计与合成根据 Gen Bank 上登录的鲤 HSP90 基因序列 ( 登录号 : L )ꎬ 使用 Primer Premiers 5 0 软件设计引物 ꎮ 上下游引物分别为 F1: 5 CTCGAGATGCTTGACGGATCCCACC3 ꎬ R2: 5 GAATTCGATGAGGACCAGCTACATGAAG3 ꎮ 其中画线部分依次引入 XhoⅠ 和 EcoRⅠ 限制性酶切位点 ꎬ 由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成 ꎮ HSP90 基因的克隆与鉴定将健康试验鲤用体积分数为 75% 的乙醇消毒 ꎬ 在超净工作台上解剖鱼体 ꎬ 取其头肾组织 ꎮ 采用 TRizol ( Invitro gen) 提取总 RNAꎬ 并反转录为 cdnaꎬ 建立 0 μl 反转录体系 ꎮ PCR 反应程序 : 95 下预变性 5 minꎻ 94 下变性 30 sꎬ 63 5 下退火 30 sꎬ 共进行 35 个循环 ꎻ 在 72 下延伸 1 minꎬ 于 4 下保存 ꎬ 用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 ꎮ 将回收纯化的 HSP90 目的基因连接至 pmd - 19T 克隆载体 ꎬ 连接产物转化至 DH5α 大肠杆菌感受态细胞中 ꎬ 经双酶切和 PCR 鉴定均为阳性的重组克隆质粒保种 ꎬ 由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司测序 ꎬ 将测序结果与 GenBank 登陆的基因序列进行 BLAST 比对 ꎮ pegfp-c1-hsp90 重组质粒的构建回收用 T4DNA 连接酶将 pmd19 -T -HSP9 目的基因与 pegfp-c1 酶切回收的大片段连接后 ꎬ 转入至大肠杆菌感受态细胞 DH5α 中 ꎬ 用含有卡那霉素液体的 LB 培养基进行筛选后 ꎬ 经 PCR 和双酶切进行验证 ꎮ 选取阳性质粒命名为 pegfp -C1-HSP90 并由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司进行测序 ꎮ 重组质粒 pegfp-c1-hsp90 的细胞表达将纯化重组表达质粒 pegfp-c1-hsp90 及 pires- ORF81 菌液划线培养 ꎮ 挑取单一乳白色菌落接种到液体 LB 培养基 (Kan 抗性 ) 中 ꎬ 培养至对数生长期后进行扩摇 ꎬ 收集菌体进行重组质粒的大量提取 ꎮ 使用 Nanodrop 2000 超微量分光光度计测定重组表达质粒在 260 nm 波长时的吸光值 ꎬ 并计算重组表达质粒浓度 (μg / μl)ꎬ 其计算公式为质粒浓度 = OD 260 nm 稀释倍数 50ꎮ 用 L - 15 培养基分别稀释重组表达质粒 pegfp- C1 - HSP90 和转染试剂 EndoFectionTM Maxꎬ 并置于室温 ꎮ 用 125 μl L-15 培养基分别稀释重组表达质粒 pegfp -C1 -HSP90 (2 5 μg) 和不同剂量 ( μg) 的转染试剂 End ofectiontm Maxꎬ 并将两者充分混匀 ꎬ 静置 ~ 20 minꎬ 形成 DNA-EndoFectionTM 混合物 ꎬ 并将混合物逐滴加入到每个细胞培养孔中 ꎬ 在 26 培养箱中孵育转染细胞 ꎬ 24 h 后在荧光倒置显微镜下观察细胞转染情况并采集图片 ꎮ 重组质粒 pegfp - C1 - HSP90 与 pires - ORF81 联合免疫随机选取尾鲤头肾组织样品进行 PCR 检测 ꎬ 鉴定结果显示均未感染 KHVꎮ 将试验鱼平均分为 6 组 ꎬ 每组尾 ꎬ 将表 1 试剂按组分配 ꎬ 每组配制成 2000 μlꎬ 给每尾鲤肌肉注射 ꎬ 剂量均为 200 μlꎮ 每周免疫 1 次 ꎬ 共免疫 3 次 ꎮ 重组表达质粒 pegfp-c1-hsp90 诱导鲤的免疫效果检测采用尾静脉取血方法 ꎬ 免疫前采血一次 ꎬ 共进行 3 次免疫 ꎬ 第一次和第二次免疫一周后采血一次 ꎬ 第三次免疫后第一周第二周第三周分别采血一次 ꎮ 制备血清后进行间接 ELISA 检测 ꎬ 结果通过酶标仪 OD 450 nm 测定 ꎮ

3 第 2 期金晔 ꎬ 等 : 鲤 HSP90 作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究 177 表 1 鲤免疫分组及注射量 Tab 1 Immune groups and injection volumes in common carp 组别 group pires-orf81 / μg pegfp-c1-hsp90 / μg PBS / ml 定 ꎮ 结果显示 ꎬ 在 687 bp 处有明显条带 ꎬ 另一条带在 5000 bp 左右 ( 图 4)ꎬ 与预期结果相符 ꎮ 表明成功构建了重组质粒 pegfp-c1-hsp90ꎮ 结果与分析 2 1 HSP90 基因的 PCR 扩增将鲤头肾组织所提取的 RNA 进行反转录 ꎬ 获得 cdna 模板 ꎬ 以 HSP90-F1 R2 为引物进行 PCR 扩增 ꎬ 获得与预期片段大小相符的 687 bp 基因 ꎬ 结果如图 1 所示 ꎮ 注 : M 为 DL2000 DNA Markerꎻ 1 为 pmd19-t-hsp90 的双酶切产物 Note: Mꎬ DL2000 DNA Markerꎻ 1ꎬ the double digested product of pmd19-t-hsp90 图 2 pmd19-t-hsp90 的双酶切 Fig 2 Identification of double restriction enzyme diges tion for pmd19-t-hsp 重组质粒 pegfp-c1-hsp90 的细胞表达注 : M 为 DL2000 DNA Markerꎻ 1 为 PCR 产物 Note: Mꎬ DL2000 DNA Markerꎻ 1ꎬ PCR product of HSP90 图 1 鲤 HSP90 基因的 PCR 扩增 Fig 1 The PCR amplification product of HSP90 in common carp 2 2 克隆质粒 pmd19-t-hsp90 的双酶切鉴定使用 XhoⅠ 和 EcoRⅠ 两种内切酶对重组质粒 pmd19-t-hsp90 进行双酶切鉴定 ꎮ 结果显示 ꎬ 符合预期结果大小 ꎬ 在 687 bp 处有明显条带 ( 图 2)ꎬ 表明成功构建了重组质粒 pmd19-t-hsp90ꎮ 2 3 测序结果的 BLAST 比对将 HSP90 的测序结果在 GenBank 中进行 BLAST 比对 ꎬ 结果见图 3ꎬ 所克隆的 HSP90 基因与 GenBank 中登入的鲤 HSP90 基因序列匹配度相同 ꎮ 2 4 重组表达质粒 pegfp-c1-hsp90 的双酶切鉴定将重组质粒 pegfp -C1-HSP90 进行双酶切鉴重组表达质粒浓度根据浓度公式计算出 pegfp-c1 -HSP90 pires -ORF81 重组表达质粒的浓度分别为 μg / μlꎮ 重组表达质粒的转染将重组质粒 pegfp- C1-HSP90 (2 5 μg) 分别与 3 种不同剂量 ( μg) 的转染试剂 EndoFectionTM Max 混合后转染至鲤脑细胞中 ꎬ 转染 24 h 后在荧光倒置显微镜下观察转染情况并成像 ꎮ 结果显示 ꎬ 转染试剂 EndoFectionTM Max 剂量为 5 0 μg 时转染效果最佳 ꎬ 重组质粒在鲤脑细胞中的转染荧光图见图 5ꎮ 2 6 对试验动物的 PCR 检测随机选取尾试验鲤 ꎬ 对其头肾组织样品基因组进行 PCR 扩增 ꎬ 以 KHV 病毒作为阳性对照 ꎮ 结果显示 ꎬ 所选尾试验鲤均为 KHV 阴性 ( 图 6)ꎬ 未携带 KHV 病毒 ꎬ 可以进行免疫试验 ꎮ 2 7 抗体水平 ELISA 检测通过间接 ELISA 方法检测抗体水平 ꎬ 在 450 nm 处吸光值平均数和标准差的计算结果如表 2 所示 ꎮ 从表 2 可见 ꎬ 空白对照组与 PBS 对照组均没有特异性抗体产生 ꎬ 而重组质粒单独免疫或联合免疫均可以获得较高的抗体水平 ꎬ 免疫次数增加的同

１７８大连海洋大学学报图３Ｆｉｇ３第３３卷鲤ＨＳＰ９０基因的ＢＬＡＳＴ比对ＴｈｅＢＬＡＳＴｃｏｎｔｒａｓｔｏｆＨＳＰ９０ｇｅｎｅｉｎｃｏｍｍｏｎｃａｒｐ图５

注: Ｍ为ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ １为ｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０的双酶切产物Ｎｏｔｅ: Ｍꎬ ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ １ꎬ ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐｅｇｆｐＣ１

时抗体水平也随之增加ꎮ 与单独用ｐｉｒｅｓＯＲＦ８１核酸免疫相比ꎬ ｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０作为佐剂联合免疫抗体水平相对升高ꎬ 其中第６组即ｐｉｒｅｓＯＲＦ８１ (１０

4 １７８大连海洋大学学报图３Ｆｉｇ３第３３卷鲤ＨＳＰ９０基因的ＢＬＡＳＴ比对ＴｈｅＢＬＡＳＴｃｏｎｔｒａｓｔｏｆＨＳＰ９０ｇｅｎｅｉｎｃｏｍｍｏｎｃａｒｐ图５Ｆｉｇ５ｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０在鲤脑细胞中的表达 (５ μｇ) Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｏｍｍｏｎｃａｒｐｂｒａｉｎ ( ＣＣＢ) ｃｅｌｌｓｏｆｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０ (５ μｇ) 注: Ｍ为ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ １为ｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０的双酶切产物Ｎｏｔｅ: Ｍꎬ ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ １ꎬ ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０图４Ｆｉｇ４ｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０的双酶切鉴定ＴｈｅＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０时抗体水平也随之增加ꎮ 与单独用ｐｉｒｅｓＯＲＦ８１核酸免疫相比ꎬ ｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０作为佐剂联合免疫抗体水平相对升高ꎬ 其中第６组即ｐｉｒｅｓＯＲＦ８１ (１０ μｇ) ｐｅｇｆｐＣ１ＨＳＰ９０ ( ２０ μｇ) 在各免疫剂量组中相对较好ꎬ 第三次免疫后两周ꎬ 抗体水平达到最高 (１３１６９) ꎬ 但与其他组无显著性差异 ( Ｐ>００５) ꎮ 后续为验证重组质粒的安全性ꎬ

第 2 期金晔 ꎬ 等 : 鲤 HSP90 作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究 179 Tab 2 表 2 ELISA 检测抗体水平 (OD 450 nm ) Antibody detection (OD 450 nm ) by ELISA 组别 group 免疫前 before 第一次免疫后一周 one week after first 第二次免疫后一周 one week after

5 第 2 期金晔 ꎬ 等 : 鲤 HSP90 作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究 179 Tab 2 表 2 ELISA 检测抗体水平 (OD 450 nm ) Antibody detection (OD 450 nm ) by ELISA 组别 group 免疫前 before 第一次免疫后一周 one week after first 第二次免疫后一周 one week after second 第三次免疫后一周 one week after third 第三次免疫后两周 two weeks after third 第三次免疫后三周 three weeks after third ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± HSP90 免疫佐剂研究情况注 : M 为 DL2000 DNA Markerꎻ 1 为阳性对照 ꎻ 2 ~ 11 分别为尾鲤组织样品 DNA 的 PCR 产物 Note: Mꎬ DL2000 DNA Markerꎻ 1ꎬ positive controlꎻ 2-11ꎬ the PCR products of common carp tissue DNA in random sampling Fig 6 图 6 试验鲤的 PCR 检测 The PCR detections of the test common carp 在结束试验后对试验鱼暂养一个月 ꎬ 未发现对鱼体健康存在不良影响 ꎬ 并随机筛选部分试验鱼进行了组织病理学观察 ꎬ 也未发现异常 ꎮ 3 讨论 3 1 KHV 相关疫苗研制情况自 20 世纪 90 年代末首次对 KHV 的描述以来 ꎬ 这种病毒已经在世界范围内流行 ꎬ 对鲤和锦鲤产业可持续健康发展造成极大危害 ꎮ KHV 也通过影响野生鲤种群进而对环境产生负面影响 ꎬ 其作为水生动物疫病病毒越来越被重视 ꎮ 但现有开发的核酸疫苗都或多或少存在一些问题 ꎮ 其中 ꎬ 弱毒苗虽然免疫效果较好 [21-22] ꎬ 但存在散毒和返强的危险 ꎬ 后 [23] 经 Yasumoto 等研发的用质体脂包裹甲醛灭活的 KHV 灭活疫苗与弱毒疫苗相比 ꎬ 具有安全性好不存在散布病毒和造成 KHV 新疫源的危险 ꎬ 但其产生的保护力不强 ꎬ 仅为 65%ꎬ 需要反复多次免疫 ꎬ 一直未能达到预期效果 ꎮ 因此 ꎬ 为了增强核酸疫苗的免疫原性 ꎬ 加入如佐剂的免疫刺激剂尤为重要 ꎮ 相关学者研究表明 ꎬ 病毒 HSP90 高度保守 ꎬ [24] 在生物体内发挥极其重要的功能 ꎮ 王婷婷等研究发现 ꎬ 菱鲆 Psetta maxima 胚胎细胞系在感染鳗弧菌 Vibrio anguillarum 6 h 后 ꎬ HSP90β 即可被检 [25] 测到且显著上调 ꎻ 冯俪等通过构建 PVAX - HSP90 重组质粒联合核酸疫苗显示出良好的免疫保护作用 ꎬ 都具有良好的免疫应答和抗原呈递作用 ꎮ 本试验中 ꎬ 为增强 pires-orf81 核酸疫苗的免疫活性 ꎬ 选择 HSP90 作为 KHV pires - ORF81 疫苗的佐剂 ꎮ 用 pires - ORF81 与重组表达质粒 pegfp-c1-hsp90 联合免疫患病鲤 ꎬ 采集鲤血清 ꎬ 通过间接 ELISA 检测抗体水平 ꎮ 研究结果表明 ꎬ 重组质粒单独免疫或联合免疫均可以获得较高的抗体水平 ꎬ 与单独用 pires-orf81 核酸免疫效果相比 ꎬ pegfp-c1-hsp90 与 pires-orf81 联合免疫后抗体水平相对升高 ꎮ 可以看出 ꎬ HSP90 可以提高专一性免疫效果 ꎬ 重组表达质粒 pegfp - C1 - HSP90 对 pires-orf81 的抗体水平起到了促进作用 ꎬ 与上述学者的研究结果相似 ꎮ 本研究结果可为后续水生动物热休克蛋白研究提供参考数据 ꎬ 还可为锦鲤疱疹病毒病的疫苗研制及用免疫佐剂联合免疫治疗提供新的思路 ꎮ 参考文献 : [1] Eide K EꎬMiller-Morgan TꎬHeidel J Rꎬet al. Investigation of koi herpesvirus latency in koi[ J].Journal of Virologyꎬ2011ꎬ85( ): [2] Waltzek T BꎬKelley G OꎬStone D Mꎬet al.koi herpesvirus repre sents a third cyprinid herpesvirus( CyHV-3) in the family Herpes viridae[ J ]. The Journal of General Virologyꎬ 2005ꎬ 86 ( Pt6 ): [3] Ritossa F.A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila[ J].Experientiaꎬ1962ꎬ18(12): [4] Basu NꎬTodgham A EꎬAckerman P Aꎬet al. Heat shock protein

6 180 大连海洋大学学报第 33 卷 genes and their functional significance in fish[ J].Geneꎬ2002ꎬ295 (2): [5] 刘玲玉 ꎬ 孟玉强 ꎬ 杨学冬. 热休克蛋白生物学作用的研究进展 [J]. 阴山学刊 ꎬ2007ꎬ21(1):61-64ꎬ76. [6] Krenek Sꎬ Schlegel Mꎬ Berendonk T U. Convergent evolution of heat-inducibility during subfunction analization of the Hsp70 gene family[ J].BMC Evolutionary Biologyꎬ2013ꎬ13:49. [7] Tutar Lꎬ Tutar Y. Heat shock proteins: an overview [ J]. Current Pharmaceutical Biotechnologyꎬ20ꎬ11(2): [8] Linderoth N AꎬPopowicz AꎬSastry S.Identification of the peptide- binding site in the heat shock chaperone / tumorrejection antigen Gp96( Grp94)[ J].The Journal of Biological Chemistryꎬ2000ꎬ275 (8): [9] Van Herwijnen M JꎬWieten LꎬVan Der Zee Rꎬet al.regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis[ J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americaꎬ 2012ꎬ9(35): [] Borges T JꎬWieten LꎬVanHerwijnen M Jꎬet al.the anti-inflam matory mechanisms of Hsp70[ J].Frontiers in Immunologyꎬ2012ꎬ 3:95. [11] Tobian A A RꎬCanaday D HꎬHarding C V. Bacterial heat shock proteins enhance class II MHC antigen processing and presenta tion of chaperoned peptides to CD4 + T cells[ J]. The Journal of Immunologyꎬ2004ꎬ173(8): [12] Mitsiades C SꎬMitsiades N SꎬMcMullan C Jꎬet al. Antimyeloma activity of heat shock protein-90 inhibition[ J].Bloodꎬ2006ꎬ7 (3): [13] Powers M VꎬWorkman P. Targeting of multiple signalling path ways by heat shock protein 90 molecular chaperone inhibitors[ J]. Endocrine-Related Cancerꎬ2006ꎬ13( S1):S125-S135. [14] 焦凤萍 ꎬ 王玉 ꎬ 于爱莲 ꎬ 等.HSV-2gD gbctl 表位及 Hsp70 融合 DNA 疫苗的免疫的效果观察 [ J]. 免疫学杂志 ꎬ2013ꎬ29 (11): [15] 李淑君. Hsp65 对 GPMV DNA 疫苗免疫作用的研究 [ D]. 长春 : 吉林农业大学 ꎬ2013. [16] Bolhassani AꎬRafati S.Heat-shock proteins as powerful weapons in vaccine development[ J]. Expert Review of Vaccinesꎬ2008ꎬ7 (8): [17] 李新伟. 锦鲤疱疹病毒 ORF25 ORF81 基因核酸疫苗的构建及免疫原性的研究 [D]. 长春 : 吉林农业大学 ꎬ2012. [18] 周井祥 ꎬ 李新伟 ꎬ 王好 ꎬ 等. 锦鲤疱疹病毒 -CJ 株 ORF81 基因的克隆及生物信息学分析 [ J]. 水产学报 ꎬ 2011ꎬ 35 ( 12): [19] 周井祥 ꎬ 王好 ꎬ 李新伟 ꎬ 等. 一种锦鲤疱疹病毒核酸疫苗 :CNꎬ CN A[ P] [20] 朱霞 ꎬ 李新伟 ꎬ 王好 ꎬ 等. 一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定 [ J]. 中国预防兽医学报 ꎬ2011ꎬ33(5): [21] Ronen AꎬPerelberg AꎬAbramowitz Jꎬet al. Efficient vaccine a gainst the virus causing a lethal disease in cultured Cyprinus carpio[ J].Vaccineꎬ2003ꎬ21(32): [22] Perelberg AꎬRonen Aꎬ Hutoran Mꎬ et al. Protection of cultured Cyprinus carpio against a lethal viral disease by an attenuated vi rus vaccine[ J].Vaccineꎬ2005ꎬ23(26): [23] Yasumoto Sꎬ Kuzuya Yꎬ Yasuda Mꎬ et al. Oral of common carp with aliposome vaccine fusing koi herpesvirus anti gen[ J].Fish Pathologyꎬ2006ꎬ41(4): [24] 王婷婷 ꎬ 陈松林 ꎬ 孟亮 ꎬ 等. 大菱鲆热休克蛋白 90 基因 cdna 的克隆及其表达特征 [J]. 渔业科学进展 ꎬ20ꎬ31(2): [25] 冯俪 ꎬ 聂思静 ꎬ 黄艺华 ꎬ 等. 鸡堆型艾美耳球虫 HSP90 克隆表达及其核酸疫苗的免疫保护作用 [J]. 中国兽医杂志 ꎬ2016ꎬ52 (1):-13. Immune effect of carp HSP90 as an adjuvant of koi herpesvirus nucleic acid vaccine JIN Ye 1 ꎬ YUAN Hai-yan 1 ꎬ WANG Hao 1 ꎬ ZHOU Jing-xiang 1 ꎬ LIU Yan-hui 2 ꎬ LI Gai-juan 2 ꎬ ZU Xiu-jie 2 ( 1. College of Animal Science and Technologyꎬ Jilin Agricultural Universityꎬ Changchun ꎬ Chinaꎻ 2. Jilin Province Fishery Science Instituteꎬ Changchun ꎬ China) Abstract: The eukaryotic recombinant plasmid pegfp-c1-hsp90 as an adjuvant was constructed on the basis of carp HPS90 mrna gene sequence GenBank loginꎬ and then transfected into brain cells of common carp Cyprinus carpio ( CCB) ꎬ being observed by fluorescent inverted microscopeꎬ in order to study the immune effect of HSP90. The antibody levels were detected in the common carp injected intramuscularly with the mixture of recombinant ex pression plasmid and pires - ORF81 at several immune doses by indirect enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA). The results showed that serum injection of recombinant plasmid KHV was detected in the specific anti body in the common carpꎬ with increase in the antibody level with the increase in frequencyꎬ the peak in third and two weeks after. There was higher antibody level in combined than that in pires-orf81 aloneꎬ without significant difference( P>0.05) ꎬ indicating that the recombinant plas mid pegfp-c1-hsp90 as adjuvant of koi herpes virus has certain immune effects. Key words: common carp heat shock protein 90( CHSP90) ꎻ pires-orf81ꎻ immune test

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽