第 48 卷第 4 期查正其, 等 : 虫草多糖 CPS A 对血管紧张素 Ⅱ 诱导肝 L02 细胞损伤的保护作用 491 虫草是特殊的复型真菌, 隶属于麦角菌科虫草属 [1] 多糖是虫草的主要活性成分之一, 结构复杂多样目前许多研究已经发现, 虫草多糖具有抗肿瘤抗氧化免疫调节抗炎降血

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昔钟纪
5 years ago
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1 490 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2017,48(4): 虫草多糖 CPS A 对血管紧张素 Ⅱ 诱导肝 L02 细胞损伤的保护作用查正其, 陈秋利, 王玉峰, 祝慧, 王莹, 尹鸿萍, 乐龙 ( 1 中国药科大学生命科学与技术学院, 南京 ; 2 南京中医药大学药学院, 南京 ; 3 威海人生集团股份有限公司, 威海 ; 4 中国药科大学工学院, 南京 ) 摘要探讨虫草多糖 CPS A 对 AngⅡ 诱导的人肝 L02 细胞损伤的保护作用 MTT 法考察 AngⅡ CPS A 对 L02 细胞增殖的影响,AngⅡ 刺激 L02 细胞后, 考察 CPS A 对 L02 细胞的损伤保护作用 ;PCR Real TimePCR 和 Westernblot 法检测 IL 6 IL 1β AT1R AT2R NF κbp65 TNFα 等因子 mrna 和蛋白质的表达水平结果表明 :AngⅡ CPS A 有效抑制 L02 细胞增殖的浓度分别为 mol/l 和 200μg/mL,PCR Real TimePCR 和 Westernblot 结果显示,CPS A 可以显著下调 IL 6 IL 1β TNF α NF κb 和 AT 1 R 的表达 CPS A 对 AngⅡ 诱导的 L02 细胞损伤具有很好的保护作用关键词虫草多糖 ;L02 细胞 ; 血管紧张素 Ⅱ; 炎症中图分类号 R285 5 文献标志码 A 文章编号 (2017) doi: /j.isn 引用本文查正其, 陈秋利, 王玉峰, 等虫草多糖 CPS A 对血管紧张素 Ⅱ 诱导肝 L02 细胞损伤的保护作用 [J]. 中国药科大学学报, 2017,48(4): Citethisarticleas:ZHAZhengqi,CHENQiuli,WANGYufeng,etal ProtectiveefectsofCordycepssinensispolysaccharideCPS Aonangiotensin I inducedinjuryofliverl02cels[j].jchinapharmuniv,2017,48(4): ProtectiveefectsofCordycepssinensispolysaccharideCPS Aonangioten sin I inducedinjuryofliverl02cels ZHAZhengqi 1 牞 CHENQiuli 2 牞 WANGYufeng 3 牞 ZHUHui 1 牞 WANGYing 1 牞 YINHongping 1 牞 YUELong 4 1 SchoolofLifeScienceandTechnology 牞 ChinaPharmaceuticalUniversity 牞 Nanjing 牷 2 ColegeofPharmacy 牞 NanjingUniversity ofchinesemedicine 牞 Nanjing 牷 3 WeihaiRenshengGroupCo 牞 Lt.d 牞 Weihai 牷 4 SchoolofEnginering 牞 ChinaPharmaceu ticaluniversity 牞 Nanjing 牞 China Abstract Thisstudyaimedatthemolecularmechanism ofcordycepssinensispolysaccharide A 牗 CPS A 牘 on angiotensin 牗 AngI 牘 inducedinjuryofl02cels.theefectofangiandcps AontheproliferationofL02cels wasanalyzedbymttasay.pcr 牞 Real TimePCRandWesternblotwerealsoemployedtodeterminetheexpres sionofil 1β 牞 AT1R 牞 AT2R 牞 NF κbp65 牞 TNFαandotherinflammatoryfactorsatmRNAandproteinlevels.The resultsshowedthatangⅡ andcps AcouldinhibittheproliferationofL02celsby mol/land200μg/ ml 牞 respectively.pcr 牞 Real TimePCRandWesternblotshowedthatCPS Acouldsignificantlydown regulateil 1β 牞 TNF α 牞 NF κbandat1r.cps AhasagoodprotectiveefectonAngI inducedl02celinjury. Keywords Cordycepssinensispolysaccharide A 牗 CPS A 牘牷 L02cels 牷 angiotensin I 牷 inflammation ThisstudywassupportedbyJiangsuScienceandTechnologyResearchProject 牗 No S 牘收稿日期通信作者 Tel: E mail:yinhongping63@hotmail com Tel: E mail: @qq com 基金项目江苏省科技攻关项目资助 (No.S152001)

2 第 48 卷第 4 期查正其, 等 : 虫草多糖 CPS A 对血管紧张素 Ⅱ 诱导肝 L02 细胞损伤的保护作用 491 虫草是特殊的复型真菌, 隶属于麦角菌科虫草属 [1] 多糖是虫草的主要活性成分之一, 结构复杂多样目前许多研究已经发现, 虫草多糖具有抗肿瘤抗氧化免疫调节抗炎降血糖等多种生物活性 [2-3] 免疫药理学研究结果表明, 虫草多糖能引起 T 细胞 NK 细胞单核细胞和巨噬细胞的活化增殖, 并分泌各种淋巴因子 [4-5] 肾素血管紧张素系统 (renin angiotensinsystem,ras) 是机体重要的体液调节系统, 国内外学者发现, 在心肌血管平滑肌肾肝脏等多种器官组织中均有肾素及血管紧张素原的基因表达, 共同参与对靶器官的调节 [6-10] RAS 的主要成分为血管紧张素 Ⅱ(angio tensin I,AngⅡ),AngⅡ 是重要的致炎因子, 介导炎性介质的分泌, 参与组织炎症过程 [11] AngⅡ 受体有两个亚型, 即 AT1 受体和 AT2 受体 [12] 血管紧张素 Ⅱ 1 型受体 (angiotensin Itype1recep tor,at 1 R) 可以介导吞噬细胞中的血管内皮生长因子 (VEGF) 白介素 1β(1L 1β) 肿瘤坏死因子 α (TNF α) 纤溶酶原激活物抑制因子 1(PAI 1) 及肾上腺髓质激素的生成 AT 1 R 的激活可以诱导肿瘤转化生长因子 β(tgf β) 的表达, 引起机体免疫抑制作用 [13] 核转录因子 NF κb 是一种参与基因转录的多显性转录因子, 可以将信息从胞浆传至细胞核内诱导免疫炎症相关基因的表达研究表明, 多糖能够作用于细胞膜上的 TLR 样受体, 通过激活 NF κb 进而调节 TNF α IL 1β 等炎症因子的表达, 产生炎症反应或免疫调节活性 [2] 本研究在提取分离纯化以及结构鉴定得到虫草多糖 CPS A 的基础上, 进一步考察 CPS A 作用于 Ang Ⅱ 诱导的人肝细胞 HL 7702(L02) 损伤模型, 观察 CPS A 抑制细胞增殖及其 AngⅡ 所致损伤的保护作用材料 1 1 试剂虫草多糖 (CPS A): 由虫草头孢菌粉 ( 江苏神华药业 ) 采取酸醇法提取分离纯化所得 [1] ; 血管紧张素 Ⅱ(AngⅡ, 美国 Aladdin 公司 );DMEM 高糖培养基 ( 美国 Hyclone 公司 ); 胎牛血清 ( 杭州四季青生物工程材料有限公司 ); 四甲基偶氮唑盐 (MTT) 溶液二甲亚砜溶液 (DMSO, 美国 Amresco 公司 );TRIzol 试剂盒 ( 美国 Invitrogen 公司 );BU Superscript 逆转录试剂盒 ( 美国 Biouniquer 公司 ); 2 TaqMasterMix( 南京诺唯赞生物科技有限公司 );Prestained50bp IDNALadder( 上海捷瑞生物工程有限公司 );2 UltraSYBRMixture( 江苏康为世纪生物科技有限公司 );QuantiNova TM SYBR GreenPCR( 德国 KitQiagen 公司 ); 蛋白预染 Marker ( 美国 Thermo 公司 ); 细胞核和胞质蛋白提取试剂盒牛血清白蛋白 (BSA, 上海生工生物工程有限公司 );BCA 试剂盒 ECL 试剂盒 ( 碧云天生物技术研究所 );AT 1 R IL 6,IL 1β TNF α NF κb 抗体 ( 美国 CelSignaling 公司 ); 山羊抗兔 IgG HRP 二抗 ( 武汉博士德生物工程有限公司 ) 1 2 仪器琼脂糖凝胶电泳仪 ( 美国 Bio Rad 公司 );AH 2 型显微镜 ( 日本 Olympus 公司 );Epoch 酶标仪 ( 美国 BioTek 公司 );LXJ2I 型离心机 ( 上海医用分析仪器厂 ); 定量 PCR 扩增仪 ( 美国 AppliedBiosys tems 公司 ) 1 3 细胞人肝细胞 HL 7702(L02) 购买自复旦 IBS 细胞资源中心方法 2 1 细胞培养 L02 细胞采用 DMEM 高糖培养基培养 ( 含 10% 胎牛血清,1mL 青霉素 / 链霉素混合液 ), 放置于含 5% 浓度的 CO 2 培养箱中 37 恒温恒湿培养 2 2 MTT 法考察 CPS A 及 AngⅡ 对 L02 细胞增殖的影响分别考察 CPS A AngⅡ 对 L02 细胞生长, CPS A 对 AngⅡ 诱导的 L02 细胞损伤的影响 L02 细胞经复苏培养后传代至新的平皿中, 继续培养 12h 至细胞汇合度长至 80% 左右, 稍倾斜吸弃旧培养基, 加入胰酶 1mL 消化细胞, 轻柔荡洗细胞表面, 将死细胞及细胞代谢物吸去加入胰酶 2mL,37 消化 2min, 加入新鲜培养基 3mL 终止消化, 轻轻吹下细胞, 转移至离心管中,1000r/min 离心 5min, 弃去上清液, 加培养基 5mL 重悬在显微镜下使用血球计数板对细胞计数, 加入适量培养基稀释至每毫升个,96 孔板铺板,37 培养过夜贴壁后加入不同药物刺激 24 和 48h

3 492 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2017,48(4): 第 48 卷后显微镜下观察细胞形态后每孔加入 MTT (5mg/mL)20μL, 继续培养 4h 将板倾斜, 用 1mL 注射器吸弃上清液, 注意不要扰动细胞每孔加 DMSO150μL, 振摇 5min,570nm 处读取吸收度 2 3 PCR 检测相关因子 mrna 的表达情况取浓度为每毫升个细胞铺 6 孔板, 37 培养待细胞汇合度长至 80% 左右时, 分组给予 CPS A 刺激继续培养 12h 后, 除空白组外, AngⅡ 模型组 CPS A 给药组分别加入终浓度为 mol/l 的 AngⅡ,37 孵育 24h TRIzol 试剂盒提取细胞总 RNA, 并将 mrna 逆转录为 cdna 普通 PCR 按照 94 预变性 3min;94 变性 30s,56 退火 30s,72 延伸 1min, 循环 30 次 ;72 延伸 5min 的反应条件, 琼脂糖凝胶电泳检测 NF κbp65 IL 6 IL 1β AT 2 R 以及 AT 1 R 的 mrna 的表达情况 2 4 Westernblot 检测相关因子蛋白质表达细胞经胰酶消化后, 收集细胞悬液,1000r/min 离心 5min RIPA 蛋裂解液裂解细胞,4 振荡 30min 后 14000r/min 离心 10min; 将上清液吸入预冷的干净 EP 管中,BCA 法测定蛋白质浓度所提取的蛋白质经 SDS PAGE 凝胶电泳后, 湿法 100V,4 转膜 1 5h, 将蛋白质转移至 PVDF 膜上,5% 的脱脂奶粉 (TBST 配制 ) 室温封闭 1h PBST 洗涤 3 次, 每次 10min, 后加入一抗 ( 小鼠抗人 IL 6 IL 1β AT 1 R NF κb p65 TNFα 抗体, PBST 稀释 ), 室温振摇孵育 2h, 反应结束后, 弃抗体,PBST 清洗 3 次, 每次 10min 加入二抗 (HRP 标记山羊抗小鼠抗体,1 5000PBST 稀释 ), 常温孵育 1h PBST 清洗 3 次, 每次 10min 增强化学发光法 (ECL) 将两种显色底物 1 1 等体积混匀, 将 PVDF 膜用滤纸擦干, 将显色液均匀滴在膜上, 在凝胶成像仪下曝光, 拍照 2 5 Real TimePCR 检测相关基因的表达量利用表 1 所示 7 对引物组合, 采用实时定量 PCR 扩增仪检测相关基因的表达量扩增程序为 95 预变性 10min,95 预变性 15s,60 退火 / 延伸 30s,50 个热循环, 溶解曲线测定为从 60 到 95 每个试验设置 3 个重复复孔, 数据用 Stepone 软件进行分析, 基因相对定量按照 2 -ΔΔCt 方法计算 Table1 SequencesofprimersusedforReal TimePCR Gene Forwardprimer5 3 Reverseprimer5 3 GAPDH ATGGTGGTGAAGACGCCAGT GCACCGTCAAGGCTGAGAAC IL6 GTGAAAGCAGCAAAGAGGC CATTTGTGGTTGGGTCAGG IL 1β ATGGCTTATTACAGTGGCA GTAGTGGTGGTCGGAGATT NF κb CCTCCCTCCAGCTAGATTC AGGCTTCACAGGACCAGAC TNF α GGGGATTATGGCTCAGGGTC CGAGGCTCCAGTGAATTCGG AT 1 R TCCTCGCCAATGATTCCAGC TCAAATATCAAACCCGCGCC AT 2 R GCTCGCCGGGCCAACATGC GGCTTGCACACCACGTCTGA 2 6 数据分析所有数据由 GraphPadPrism5 0 软件计算完成多组均数间的比较采用单因素方差分析 (One WayANOVA)Turkey 法进行比较,P<0 05 表示差异有统计学意义结果 3 1 CPS A 及 AngⅡ 对 L02 细胞增殖的影响如图 1 A 所示,AngⅡ 对 L02 细胞生长有一定的抑制作用当 AngⅡ 浓度为 mol/l 时, 能够显著性抑制 L02 细胞增殖 (P<0 05),AngⅡ 浓度为 mol/l 时, 能够极显著性抑制 L02 细胞活力 (P<0 01), 故本实验选用 mol/l 作为 AngⅡ 的刺激浓度从损伤作用时间来看, 48 与 24h 损伤差异程度不大, 选用损伤作用时间为 24h 给予虫草多糖 CPS A 作用后, 如图 1 B 所示, 质量浓度低于 100μg/mL 的 CPS A 对 L02 的生长没有抑制作用, 当其质量浓度达到 200μg/mL, 孵育 48h 时, 对 L02 生长有显著性抑制作用, 故而本实验选择 μg/mL 作为 CPS A 给药的低中高浓度, 根据实验室前期研究, 选择预保护的给药方式, 预保护时间 12h 图 1 C 结果显示, CPS A 对 AngⅡ 诱导的 L02 细胞损伤具有保护作用 mol/l 的 AngⅡ 对 L02 有极显著的抑制增殖作用 (P<0 01), 在给予 CPS A 预保护 12h 之后,50μg/mL 的 CPS A 能够起到显著性的保护

第 48 卷第 4 期查正其, 等 : 虫草多糖 CPS A 对血管紧张素 Ⅱ 诱导肝 L02 细胞损伤的保护作用 493 作用 (P<0 05),100μg/mL 的 CPS A 能够起到极显著性的保护作用 (P<0 01) 结合图 1 A 和图 1 B 实验结果, 本实验选择 25 50 100μg/mL 作为 CPS A 给药的低中高浓度 Figure1

inducedl02proliferationasesedbymttasay( x±s,n= 珋 3) ## P<0 01vscontrolgroup; P<0 05, P<0 01vsmodelgroup 3 2 NF κbp65 IL 6 IL 1β AT 2 R 以及 AT 1 R 的 mrna 表达如图 2 所示,AT 2 R 受体的表达的基础水平较低,AngⅡ 刺激后调控效果不明显,

4 第 48 卷第 4 期查正其, 等 : 虫草多糖 CPS A 对血管紧张素 Ⅱ 诱导肝 L02 细胞损伤的保护作用 493 作用 (P<0 05),100μg/mL 的 CPS A 能够起到极显著性的保护作用 (P<0 01) 结合图 1 A 和图 1 B 实验结果, 本实验选择 μg/mL 作为 CPS A 给药的低中高浓度 Figure1 (A)Efectsofangiotensin I(Ang I)onL02proliferationasesedbyMTTasay;(B)EfectsofCordycepssinensispolysaccharide A (CPS A)onL02proliferationasesedbyMTTasay;(C)EfectsofCPS AonAng I inducedl02proliferationasesedbymttasay( x±s,n= 珋 3) ## P<0 01vscontrolgroup; P<0 05, P<0 01vsmodelgroup 3 2 NF κbp65 IL 6 IL 1β AT 2 R 以及 AT 1 R 的 mrna 表达如图 2 所示,AT 2 R 受体的表达的基础水平较低,AngⅡ 刺激后调控效果不明显, 故在之后的实验中不再进行研究相对于空白组,IL 6,AT 1 R 表达量有明显的增加, 经过 AngⅡ 的刺激之后的基因表达均有明显的差异,p65 和 IL 1β 因子的表达差异不明显给药组, 炎性因子蛋白表达量均得到显著的下调, 随着低中高浓度组给药剂量的增大, 炎性因子蛋白表达量下降显著实验结果表明,AngⅡ 可以造成相关炎性因子的蛋白表达量显著性升高, CPS A 可以抑制这种由 AngⅡ 引起的相关组分的高表达 3 4 IL 6,IL 1β,TNF α,at 1 R 和 NF κb 相关基因的表达如图 4 所示,IL 6,IL 1β,TNF α,at 1 R 和 NF κb 基因的 mrna 表达水平均有显著增加, 与空白组相比分别增加 33 6% 21 6% 25 5% 27 5% 和 74 5% 表明 AngⅡ 可以造成相关基因 mrna 表达量升高,CPS A 可以抑制由 AngⅡ 引起的相关基因 mrna 的高表达以上实验结果表明,CPS A 可以减少 L02 中 AngⅡ 造成的炎性因子的表达量, 表明 CPS A 对 L02 细胞具有保护损伤活性讨论 Figure2 mrna expresionsofcps A onang I inducedl02 The mrnaexpresionofil 6,IL 1β,AT 1 R,AT 2 RandNF κbp65inang I inducedl02,standardizedbygapdh 3 3 IL 6 IL 1β AT 1 R NF κbp65 TNFα 相关因子蛋白质的表达情况如图 3 所示, 给予 AngⅡ 刺激后 (Model 组 ), IL 6,IL 1β,TNF α,nf κb 和 AT 1 R 的蛋白表达水平均有极显著增加 (P<0 01), 而用低中高浓度的 CPS A 预保护细胞 12h 后再加入 AngⅡ 刺激的研究表明, 虫草多糖对肝脏具有保护作用, 主要保护化学性肝损伤免疫性肝损伤和肝纤维化等 [14] 目前多数认为虫草多糖对肝脏的保护作用主要是通过抗脂质过氧化改善人体细胞和体液免疫功能, 以及增强肝细胞的吞噬能力, 越来越多的研究表明在各种氧化应激引起的细胞损伤过程中, 虫草及其单体成分具有抗氧化活性, 能增强超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性, 增强氧利用率, 促进 ATP 形成, 能够增强活性氧消除能力等 [15]

494 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2017,48(4):490-495 第 48 卷 Figure3 EfectsofCPS AonAngI inducedapoptosisinl02cels (A)TheproteinexpresionofIL 6,IL 1β,TNF α,nf κbandat 1 RinAngI inducedl02

5 494 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2017,48(4): 第 48 卷 Figure3 EfectsofCPS AonAngI inducedapoptosisinl02cels (A)TheproteinexpresionofIL 6,IL 1β,TNF α,nf κbandat 1 RinAngI inducedl02 ColumnsoftheproteinexpresionlevelsofIL 6(B),IL 1β(C),TNF α(d),nf κb(e)andat 1 R(F)inL02cels,standardizedby β actin( 珋 x±s,n=3) P<0 01vscontrolgroup; # P<0 05, ## P<0 01vsmodelgroup Figure4 mrnaexpresionsofcps AonAng I inducedl02measuredbyreal TimePCR ColumnsofthemRNAexpresionlevelsofIL 6(A), IL 1β(B),TNF α(c),at 1 R(D)andNF κb(e)inl02cels,standardizedbygapdh( 珋 x±s,n=3) P<0 05, P<0 01vscontrolgroup; # P<0 05, ## P<0 01vsmodelgroup 本研究采用提取分离纯化得到的虫草多糖 CPS A 作用于 AngⅡ 诱导的 L02 细胞损伤模型研究表明, 在 AngⅡ 刺激 L02 细胞导致抑制其增殖的相关炎性因子及受体中表达方面,AT 2 R 的 mrna 水平表达不明显, 而 IL 6 IL 1β TNF α NF κb 和 AT 1 R 的蛋白表达水平均有极显著增加在

6 第 48 卷第 4 期查正其, 等 : 虫草多糖 CPS A 对血管紧张素 Ⅱ 诱导肝 L02 细胞损伤的保护作用 495 给药浓度方面, 随着低中高剂量组给药量的增加, 炎性因子及受体蛋白表达量均得到显著的下调, 且呈剂量依赖性以上结果初步表明,CPS A 可以抑制由 AngⅡ 引起的相关炎性因子的高表达, 对于 AngⅡ 诱导的 L02 细胞损伤具有一定的保护作用以本研究为基础, 将 CPS A 开发为治疗炎症导致的肝损伤疾病具有潜在意义, 发挥保护作用的治疗机制有待更深入的研究参考文献 [1] TangH,WeiW,WangW,etal.Efectsofculturedcordycepsmil itaris,mycelia polysaccharide A on tumorneurosisfactor α inducedhepatocyteinjurywithmitochondrialabnormality[j]. CarbohydrPolym,2017,163:43-53 [2] LuoX,DuanY,YangW,etal.Structuralelucidationandimmu nostimulatoryactivityofpolysaccharideisolatedbysubcritical waterextractionfrom cordycepsmilitaris[j].carbohydrpolym, 2017,157: [3] ZhuZY,GuoMZ,LiuF,etal.Preparationandinhibitiononα d glucosidase of low molecular weight polysaccharide from cordycepsmilitaris[j].intjbiolmacromol,2016,93(3):27-33 [4] WangJ,NieS,KanL,etal.Comparisonofstructuralfeaturesand antioxidantactivityofpolysaccharidesfrom naturalandcultured cordycepsinensis[j].foodscibiotechnol,2017,26(1):55-62 [5] XiaoY,HuangQ,ZhengZ,etal.Constructionofacordyceps sinensisexopolysaccharide conjugatedseleniumnanoparticlesand enhancementoftheirantioxidantactivities[j].intjbiolmacro mol,2017,99(1): [6] Jr J,Ibrahim NE.Renin angiotensinsystem blockadeinheart failure:moretothepicturethanmeetstheeye[j].jam Col Cardiol,2017,69(7): [7] KarnikSS,KhuraijamD,TirupulaK,etal.SignificanceofAng (1 7)couplingwithMAS1andotherGPCRstotherenin angio tensinsystem:iupharreview X [J].BrJPharmacol,2017, 174(9): [8] WuJ,XieH,YaoS,etal.Macrophageandnerveinteractionin endometriosis[j].jneuroinflamm,2017,14(1):53 [9] CheungpasitpornW,ThongprayoonC,MaoMA,etal.Theefect ofrenin angiotensinsystem inhibitorsonkidneyalograftsurviv al:asystematicreviewandmeta analysis[j].noramejmed Sci,2016,8(7): [10] ZhangY,WangL,SongY,etal.Renininhibitoraliskirenexerts beneficialefectontrabecularbonebyregulatingskeletalrenin angiotensinsystemandkalikrein kininsysteminovariectomized mice[j].ostint,2016,27(3): [11] McmulanCJ,BorgiL,FisherN,etal.Efectofuricacidlowering onrenin angiotensinsystemactivationandambulatorybp:aran domizedcontroledtrial[j].clinjam SocNephrol,2017,12 (5):807 [12] Sancho BruP,GinèsP.Targetingtherenin angiotensinsystemin liverfibrosis[j].hepint,2016(5):1-3 [13] ZouX,ZhangXX,LiuXY,etal.Renalkalikreinactivationand renoprotectionafterdualblockadeofrenin angiotensinsystemin diet induceddiabeticnephropathy[j].jdiabetesres,2015: doi: /2015/ [14] KloetADD,WangL,LudinJA,etal.Reportermousestrainpro videsanovellookatangiotensintype 2receptordistributionin thecentralnervoussystem[j].brainstructfunct,2016,221 (2): [15] AhadA,MujeebM,AhsanH,etal.Nephroprotectivepotentialof quercusinfectoriagalsagainstexperimentalyinduceddiabetic nephropathyinratsthroughinhibitionofrenaloxidativestres andtgf β[j].animalcelssyst,2016,20(4):1-10

:TGF-β bfgf 23 KEY WORDS:transforminggrowthfactor-β ;basicfibroblastgrowthfactor; bonemarrow mesenchymalstemcels;eukaryoticexpressionvector; liposomet

:TGF-β bfgf 23 KEY WORDS:transforminggrowthfactor-β ;basicfibroblastgrowthfactor; bonemarrow mesenchymalstemcels;eukaryoticexpressionvector; liposomet 2 ( )208 58 JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)208,Vol.58No. TGF-β bfgf,, 2 (., 330006; 2., 5040) : -β (TGF-β ) (bfgf) (BMSCs), SD BMSCs Percol PCR TGF-β bfgf, pcdna3.(+), 3 BMSCs RT-PCR Westernblot