1 期方萍, 吴晓明, 周筠, 等.CpG ODNs 对慢性哮喘小鼠气道重塑的影响及机制 59 支气管哮喘是一种 Th1/Th2 免疫反应失衡性疾病, 反复发作可导致气道重塑, 主要表现为上皮下胶原沉积 气道平滑肌增殖 黏液腺增生以及血管再生 [1 2] 等改变 Th2 细胞因子 IL 4 IL 5

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1 第 34 卷第 1 期 2013 年 1 月 西安交通大学学报 ( 医学版 ) 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犡犻 犪狀犑犻犪狅狋狅狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔 ( 犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊 ) 犞狅犾.34 犖狅.1 犑犪狀.2013 犆狆犌 犗犇犖狊对慢性哮喘小鼠气道重塑的影响及机制 方萍 1, 吴晓明 2, 周筠 3, 李满祥 1, 史红阳 1, 张永红 1, 卢家美 1, 张明 1 (1. 西安交通大学医学院第二附属医院呼吸内科, 陕西西安 ;2. 西安交通大学生命科学学院, 陕西西安 ;3. 西安交通大学医学院药理学系, 陕西西安 ) 摘要 : 目的探讨疫苗佐剂 CpG ODNs 对慢性哮喘气道重塑的影响及机制 方法采用卵蛋白 (OVA) 致敏并激发制备哮喘小鼠气道重塑动物模型, 给予 CpG ODNs GpC ODNs 干预, 与生理盐水对照组 哮喘气道重塑模型组比较, 观察其对哮喘气道重塑病理 肺泡灌洗液白细胞分类计数 细胞因子以及外周血免疫球蛋白的影响 结果模型组小鼠可见气道壁炎症细胞浸润 上皮下胶原沉着 平滑肌增殖和杯状细胞增生等慢性哮喘气道重塑的病理改变, 血清 OVA 特异性 IgE 上升明显 ( 犘 <0.01), 支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中嗜酸粒细胞及 IL 4 升高 ( 犘 <0.01),CpG ODNs 部分抑制了上述病理过程 ( 犘 <0.05), 同时轻度升高 IFN γ 及 IL 10 GpC ODNs 对上述过程无明显影响 结论 CpG ODNs 能够通过上调 Th1/Th2 比例以及诱导调节性 T 细胞 (Treg 细胞 ) 介导的免疫耐受, 发挥对慢性哮喘气道重塑的防治作用 关键词 :CpG ODNs; 哮喘 ; 气道重塑 ; 免疫耐受 ;Th1/Th2 中图分类号 :R593.1 文献标志码 :A 文章编号 : (2013) 犕犲犮犺犪狀犻狊犿狊狅犳犆狆犌 犗犇犖狊犻狀犺犻犫犻狋犻狀犵狋犺犲犪犻狉狑犪狔狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵狅犳犮犺狉狅狀犻犮犪狊狋犺犿犪犻狀犿犻犮犲 FANGPing 1,WU Xiao ming 2,ZHOUJun 3,LIMan xiang 1, SHIHong yang 1,ZHANG Yong hong 1,LUJia mei 1,ZHANG Ming 1 (1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAfiliatedHospital,MedicalSchoolof Xi anjiaotonguniversity,xi an710004;2.keylaboratoryofbiomedicalinformationengineeringof MinistryofEducation,SchoolofLifeScienceandTechnology,Xi anjiaotonguniversity,xi an710043; 3.DepartmentofPharmacology,MedicalSchoolofXi anjiaotonguniversity,xi an710061,china) 犃犅犛犜犚犃犆犜 :Objective 犜狅犻狀狏犲狊狋犻犵犪狋犲狋犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犆狆犌 狅犾犻犵狅犱犲狅狓狔狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊 ( 犆狆犌 犗犇犖狊 ) 狅狀犪犻狉狑犪狔狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵犻狀狅狏犪犾犫狌犿犻狀 ( 犗犞犃 ) 狊犲狀狊犻狋犻狕犲犱犮犺狉狅狀犻犮犪狊狋犺犿犪狋犻犮犿狅犱犲犾犻狀犿犻犮犲犪狀犱狋犺犲犪犮狋犻狅狀犿犲犮犺犪狀犻狊犿狊. Methods 犉狅狉狋狔犳犲犿犪犾犲犅犪犾犫 / 犮犿犻犮犲狑犲狉犲狉犪狀犱狅犿犾狔犱犻狏犻犱犲犱犻狀狋狅狊犪犾犻狀犲犵狉狅狌狆, 犗犞犃犵狉狅狌狆, 犗犞犃 + 犆狆犌 犗犇犖狊犵狉狅狌狆, 犪狀犱犗犞犃 + 犌狆犆 犗犇犖狊犵狉狅狌狆, 狑犻狋犺 10 犻狀犲犪犮犺. 犃狋狋犺犲犲狀犱狅犳犗犞犃犲狓狆狅狊狌狉犲, 犿犻犮犲狑犲狉犲犲狏犪犾狌犪狋犲犱犳狅狉狋犺犲犱犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋狅犳犪犻狉狑犪狔狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵. 犅犾狅狅犱犪狀犱犫狉狅狀犮犺狅犪犾狏犲狅犾犪狉犾犪狏犪犵犲犳犾狌犻犱 ( 犅犃犔 ) 狑犲狉犲犮狅犾犲犮狋犲犱犳狅狉狋犺犲犿犲犪狊狌狉犲犿犲狀狋狅犳犗犞犃狊狆犲犮犻犳犻犮犐犵犈, 犻狀狋犲狉犾犲狌犽犻狀 4 ( 犐犔 4), 犻狀狋犲狉犳犲狉狅狀 γ ( 犐犉犖 γ), 犻狀狋犲狉犾犲狌犽犻狀 10 ( 犐犔 10) 犪狀犱犾犲狌犽狅犮狔狋犲狊犮狅狌狀狋.Results 犕犻犮犲犲狓狆狅狊犲犱狋狅狉犲犮狌狉狉犲狀狋犪犻狉狑犪狔犗犞犃犮犺犪犾犲狀犵犲犺犪犱犮犺狉狅狀犻犮犻狀犳犾犪犿犿犪狋犻狅狀犪狀犱犪犻狉狑犪狔狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵, 犻狀犮犾狌犱犻狀犵犻狀犳犾犪犿犿犪狋狅狉狔犮犲犾犻狀犳犻犾狋狉犪狋犻狅狀, 狊狌犫犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮狅犾犪犵犲狀犱犲狆狅狊犻狋犻狅狀, 犵狅犫犾犲狋犮犲犾犺狔狆犲狉狆犾犪狊犻犪 犿犲狋犪 狆犾犪狊犻犪犪狀犱狆狉狅犾犻犳犲狉犪狋犻狅狀狅犳犪犻狉狑犪狔狊犿狅狅狋犺犿狌狊犮犾犲犮犲犾狊. 犜犺犲犲狅狊犻狀狅狆犺犻犾狆犲狉犮犲狀狋犪犵犲犪狀犱犐犔 4 犻狀犅犃犔, 犗犞犃狊狆犲犮犻犳犻犮犐犵犈犻狀狊犲狉狌犿犻狀犗犞犃犵狉狅狌狆狑犲狉犲犪犾犻狀犮狉犲犪狊犲犱狅犫狏犻狅狌狊犾狔犮狅犿狆犪狉犲犱狑犻狋犺狋犺狅狊犲犻狀狊犪犾犻狀犲犵狉狅狌狆 ( 犘 <0.01). 犆狆犌 犗犇犖狊犮狅狌犾犱狆犪狉狋犻犪犾狔狉犲犾犻犲狏犲狋犺犲犪犫狅狏犲犮犺犪狀犵犲狊犻狀犗犞犃犵狉狅狌狆 ( 犘 <0.05). 犉狌狉狋犺犲狉犿狅狉犲, 犿犻犮犲狋狉犲犪狋犲犱狑犻狋犺犆狆犌 犗犇犖狊犺犪犱狊犾犻犵犺狋犾狔犻狀犮狉犲犪狊犲犱犐犉犖 γ 犪狀犱犐犔 10 犻狀犅犃犔, 狊狌犵犵犲狊狋犻狀犵狋犺犪狋犜犺 1 犪狀犱犜狉犲犵犮狔狋狅犽犻狀犲狊犿犻犵犺狋犫犲狉犲狊狆狅狀狊犻犫犾犲犳狅狉狋犺犲狆狉狅狋犲犮狋犻狏犲狉狅犾犲狅犳犆狆犌 犗犇犖狊. 犎狅狑犲狏犲狉, 犌狆犆 犗犇犖狊犱犻犱狀狅狋犪犳犳犲犮狋犗犞犃 犻狀犱狌犮犲犱狆犪狋犺狅犾狅犵犻犮犪犾狅狉犻犿犿狌狀狅 犾狅犵犻犮犪犾犮犺犪狀犵犲狊 ( 犘 >0.05).Conclusion 犗狌狉狉犲狊狌犾狋狊犻狀犱犻犮犪狋犲狋犺犪狋犆狆犌 犗犇犖狊犺犪狏犲狋犺犲狉犪狆犲狌狋犻犮犲犳犳犲犮狋狊狅狀犮犺狉狅狀犻犮犪狊狋犺犿犪狋犻犮犪犻狉狑犪狔狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵犫狔犻狀犱狌犮犻狀犵犻犿犿狌狀狅 狉犲狊犻狊狋犪狀犮犲犿犲犱犻犪狋犲犱犫狔犜犮犲犾狊犪狀犱犲犾犲狏犪狋犻狀犵犜犺 1 狋狅 犜狉犲犵犮狔狋狅 犽犻狀犲狊. 犓犈犢犠犗犚犇犛 : 犆狆犌 狅犾犻犵狅犱犲狅狓狔狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊 ( 犆狆犌 犗犇犖狊 ); 犪狊狋犺犿犪 ; 犪犻狉狑犪狔狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵 ; 犻犿犿狌狀狅 狉犲狊犻狊狋犪狀犮犲 ; 犜犺 1/ 犜犺 2 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 中央高校基本科研业务费 (No ); 国家自然科学基金 (No ); 陕西省卫生厅科研基金 (No.08D33) SupportedbytheFundamentalResearchFundsfortheCentralUniversities(No ),theNationalNaturalScienceFoundationof China(No ),andtheScienceandTechnologyFoundationofShaanxiProvincialHealthDepartment(No.08D33) 作者简介 : 方萍 (1976 ), 女 ( 汉族 ), 医学博士, 副主任医师. 研究方向 : 支气管哮喘的防治.E mail:pingf7613@sina.com 网络出版时间 : 网络出版地址 :htp://

2 1 期方萍, 吴晓明, 周筠, 等.CpG ODNs 对慢性哮喘小鼠气道重塑的影响及机制 59 支气管哮喘是一种 Th1/Th2 免疫反应失衡性疾病, 反复发作可导致气道重塑, 主要表现为上皮下胶原沉积 气道平滑肌增殖 黏液腺增生以及血管再生 [1 2] 等改变 Th2 细胞因子 IL 4 IL 5 IL 9 IL 13 能够引发变应原所致气道特征性炎性改变,Th1 细胞因子 IFN γ IL 12 IL 2 TNF α 则有助于控制哮喘 Th 细胞在外界环境影响下可向 Th1 或 Th2 方向分 [3] 化 胞嘧啶 磷酸 鸟嘌呤寡脱氧核苷酸 (CpG ODNs) 是一种非特异性 非抗原依赖性 Th1 反应增强剂, 具有较强的免疫原性, 与各类变应原具有协同作用, 可产生强大而持久的记忆性 Th1 反应 ; 同时还可通过非抗原依赖方式直接刺激机体产生 IL 12 TNF α 等细胞因子, 促使免疫反应向 Th1 型转化, 该作用已被用于白血病 恶性肿瘤的防治领域 但对哮 [4 5] 喘及其气道重塑的防治作用尚不清楚 本研究拟探讨 CpG ODNs 对哮喘及其气道重塑的影响及机制, 以寻求哮喘及气道重塑新的防治策略 1 材料与方法 1.1 动物和试剂 SPF 级 Balb/c 小鼠 40 只, 雌性, 7 周龄, 体重 (18±2)g, 购于西安交通大学医学院实验动物中心, 动物许可证号 :SCXK( 陕 ) 鸡卵清蛋白 (OVA,Sigma 公司,Ⅲ 级 ) 氢氧化铝 [Al (OH) 3 ] 凝胶由本实验室自制 CpG ODNs(5 TC CATGACGTTCCTGACGTT 3 ) 及 GpC ODNs(5 TCCATGAGCTTCCTGAGCTT 3 )( 北京赛百盛基因技术公司 ), 均进行全链硫代修饰, 并经检测无内毒素脂多糖污染 小鼠肺泡灌洗液 (BALF) 白细胞介素 4(IL 4) γ 干扰素 (IFN γ) 白介素 10(IL 10) 酶联免疫吸附反应检测 (ELISA) 试剂盒购于美国 RD 公司 血清总 IgE 和 OVA 特异性 IgE 检测试剂购自美国 BD 公司,OVA 特异性 IgE 检测采用 OVA 包被的 ELISA 检测专用 96 孔板 1.2 动物造模及分组将小鼠随机分为 4 组, 每组 10 只, 即 A 组 : 生理盐水对照组 ( 正常组 );B 组 : 哮喘气道重塑模型组 ;C 组 :CpG ODNs 干预组 ;D 组 : GpC ODNs 干预组 造模前适应性饲养 2 周, 采用 OVA 致敏和激发制备哮喘小鼠气道重塑模型 B 组分别于第 天给予 OVA 100μg 和 Al(OH) 32mg 混悬液皮下注射 ; 第 天每天超声雾化吸入 10g/LOVA 30 min; 以后每周雾化 3 次, 连续 8 周 A 组致敏和攻击均给予生理盐水, 给药方法相同 C 组和 D 组于雾化同时分别给予 CpG ODNs 和 GpC ODNs100μg 腹腔注射,1 次 /2 周 末次雾化结束 24h 后处死动物 1.3 血清 犅犃犔犉收集及细胞分类计数每只小鼠心脏取血约 0.7mL,4 放置过夜,13000r/min 离心 15min, 血清移至另一干净 Eppendorf 管,-20 保存待测 每组各取 5 只小鼠通过气管插管行支气管肺泡灌洗, 分 2 次缓慢注入 PBS 液, 每次 1.0mL, 缓慢收集, 回收率约为 80% BALF1500r/min 离心 8min, 收集上清液 -20 保存待测 细胞沉渣用 0.2mLPBS 液重悬, 并用血细胞计数板进行细胞分类计数 取 100 μl 细胞悬液进行离心甩片, 室温晾干后进行 Dif quick 染色, 光学显微镜下进行细胞分类, 数 200 个细胞, 求出各类白细胞百分比 1.4 气管肺组织病理学检查取各组未经支气管肺泡灌洗的 5 只小鼠支气管肺组织用甲醛固定 HE 染色观察气道炎症细胞浸润,PAS 染色观察气道壁杯状细胞增生,Masson s 染色观察气道壁胶原沉着, α actin 免疫组化染色观察气道平滑肌增殖 分别由 2 位研究者采用半定量评分 (0~3) 评价支气管周围炎症细胞浸润情况, 由 1 位研究者在未知本研究实验设计的情况下评价气道上皮细胞中 PAS 染色阳性细胞百分比 每毫米基底膜上胶原沉着区的面积比以及平滑肌厚度比 1.5 总犐犵犈和犗犞犃特异性犐犵犈的测定鼠血清标本做 1 0 和 1 00 倍稀释, 分别用 IgE 捕获抗体和 OVA 抗原包被酶标板 4 过夜, 洗板 3 次,30mL/L 小牛血清封闭 1h, 加入一抗室温孵育 2h, 洗板 3 次后加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的抗小鼠 IgE 二抗室温孵育 1h, 洗板 5 次, 加入底物工作液显色, 避光孵育 30min, 加入终止液 在 450nm 处测吸光度 犃值, 根据标准曲线计算待测指标浓度 1.6 犅犃犔犉中犐犔 4 犐犉犖 γ 及犐犔 10 浓度的测定按 ELISA 试剂盒说明书进行 依次进行捕获抗体包被 小牛血清 (BSA) 封闭, 标准品及待测样品 100μL 上样, 室温孵育 2h, 洗板 3 次 ; 加入探测抗体 100μL, 室温孵育 2h, 洗板 5 次 ; 加入 100μL 辣根过氧化物酶室温孵育 20 min, 洗板 7 次, 再加入底物工作液 100 μl, 室温暗处反应 20min; 加入 100μL 终止液终止反应 在 450nm 读取犃值, 绘制出犃 450nm 对应细胞因子浓度标准曲线, 根据待测样品犃 450nm 值, 计算出标本中 IL 4 IFN γ 以及 IL 10 的浓度 1.7 统计学分析实验结果采用均数 ± 标准误表示, 应用 SPSS15.0 软件统计分析, 多组比较采用单因素方差分析, 均数间的多重比较采用 LSD 法 犘 <0.05 为差异有统计学意义

3 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版 6 0 第 34 卷 管 血管黏膜下和 周 围 肺 组 织 有 明 显 的 炎 细 胞 浸 润 2 结 果 小支气管及血管壁 胶 原 沉 着 平 滑 肌 增 殖 气 道 壁 还 2 1 动物一般情况观察 正常组无明显异常反应 模 型组小鼠激发后出现烦躁不安 易激惹 呼吸急促 腹肌 可见上皮细胞脱落 杯 状 细 胞 增 多 管 腔 内 有 黏 液 栓 形成 CpG ODN组上 述 改 变 轻 微 而 GpC ODN 组上述改变程度 与 模 型 组 比 较 无 明 显 差 异 采 用 炎 大小便失禁等症状 GpC 抽搐 ODN组与模型组表现 相似 CpG 但程度较轻 ODN组也出现类似表现 症细胞浸润情况评分 发现模型组小鼠肺部的病理改 2 2 支气管 肺组织 病 理 学 检 查 正 常 组 小 鼠 上 皮 结构完整 未见明显气道壁炎性细胞浸润 管壁增厚 变程 度 明 显 高 于 正 常 对 照 组 犘 0 001 和 CpG ODN组 犘 0 01 而 GpC ODN组的病理改变 程 胶原沉着 平 滑 肌 增 殖 等 改 变 模 型 组 小 鼠 小 支 气 度与模型组比较无明显差异 犘 0 05 图 1 图 2 图 1 小鼠 犎犈 染色及气道炎症评分比较 F 1Comp ono fhe n ngndp b onch n f mm on c o 10 g A NC 生理盐水 组 B OVA 卵 清 蛋 白 组 C OVA CpG ODN 组 D OVA GpC ODN 组 与 NC 组 比 较 犘 0 001 与 OVA组比较 犘 0 01 图 2 各组小鼠气道壁杯状细胞增生 胶原沉着及气道平滑肌增殖的比较 F 2Comp ono fgob c hyp c o gndpo ndmoo hmu c c p o f on n h wy 10 g p A NC 生理盐水 组 B OVA 卵 清 蛋 白 组 C OVA CpG ODN 组 D OVA GpC ODN 组 与 NC 组 比 较 犘 0 01 犘 0 001 与 OVA 组比较 犘 0 05 犘 0 01 www yxxb h dyxb cn h x u du cn p j p j

4 1 期方萍, 吴晓明, 周筠, 等.CpG ODNs 对慢性哮喘小鼠气道重塑的影响及机制 各组小鼠犅犃犔犉中白细胞总数和分类计数的比较正常对照组小鼠 BALF 中主要以形态规则 大小较为均一的巨噬细胞为主, 在 BALF 细胞总数中所占比例 >99%, 可见个别单核细胞和淋巴细胞 ; 模型组较正常对照组 BALF 的细胞总数明显增多 ( 犘 <0.01), 其中以嗜酸性粒细胞增多为主 ( 犘 <0.01), 中性粒细胞 与淋巴细胞偶见 ( 犘 >0.05), 巨噬细胞百分比相对减少 ( 犘 <0.05) CpG ODNs 干预组嗜酸粒细胞百分比较模型组下降 ( 犘 <0.01), 中性粒细胞及淋巴细胞比例略有增加, 但无统计学意义 ( 犘 >0.05) GpC ODNs 干预后 BAL 中细胞总数和白细胞分类计数与模型组比较未见明显差异 ( 犘 >0.05, 图 3) 图 3 各组小鼠犅犃犔犉中细胞总数和白细胞分类计数的比较 Fig.3ComparisonoftotalcelsandceldiferentiationinBALF A:NaCl( 生理盐水 ) 组 ;B:OVA( 卵清蛋白 ) 组 ;C:OVA+CpG ODNs 组 ;D:OVA+GpC ODNs 组 与 NaCl 组比较, 犘 <0.05, 犘 <0.01; 与 OVA 组比较, 犘 <0.05, 犘 < 各组小鼠外周血清总犐犵犈和犗犞犃特异性犐犵犈的比较各组小鼠外周血总 IgE 较正常对照组略有升高, 但模型组 CpG ODNs 及 GpC ODNs 干预组之间无明显变化 模型组 OVA 特异性 IgE 较对照组 均明显升高 ( 犘 <0.01);GpC ODNs 干预组 OVA 特异性 IgE 有所下降 ( 犘 <0.05), 但仍高于对照组水平 ;GpC ODNs 干预组 OVA 特异性 IgE 与模型组比较未见明显变化 ( 犘 >0.05, 图 4) 图 4 各组小鼠血清总犐犵犈和犗犞犃特异性犐犵犈比较 Fig.4ComparisonoftotalIgEandOVA specificigeinserum A:NaCl( 生理盐水 ) 组 ;B:OVA( 卵清蛋白 ) 组 ;C:OVA+CpG ODNs 组 ;D:OVA+GpC ODNs 组 与 NaCl 组比较, 犘 <0.01; 与 OVA 组比较, 犘 < 犅犃犔犉中犐犔 4 犐犉犖 γ 及犐犔 10 的比较模型组及 GpC ODNs 干预组 BALF 中 IL 4 较正常对照组明显升高 ( 犘 <0.01), 而 IFN γ 及 IL 10 与正常组比较无统计学差异 ( 犘 >0.05) CpG ODNs 干预后 BALF 中 IL 4 降低 ( 犘 <0.05) IFN γ 及 IL 10 升高, 但后两者改变程度与模型组比较未见显著性差异 GpC ODNs 干预组上述指标与模型组比较未见明显变化 ( 犘 >0.05, 图 5) 3 讨论 Th 细胞免疫失衡是支气管哮喘的重要发病机制, 哮喘反复发作可导致持续的气道高反应性和气道重塑, 严重影响患者的愈后和生活质量 目前, 临床唯一针对哮喘病因的治疗方法 变应原特异性免疫治疗 (specificimmunotherapy,sit) 旨在促使 Th 细胞免疫反应向 Th1 方向分化, 刺激机体产生保护性

5 62 西安交通大学学报 ( 医学版 ) 第 34 卷 图 5 各组小鼠犅犃犔犉细胞因子犐犔 4 犐犉犖 γ 和犐犔 10 浓度的比较 Fig.5ComparisonofcytokinesIL 4,IFN γandil 10concentrationinBALF A:NaCl( 生理盐水 ) 组 ;B:OVA( 卵清蛋白 ) 组 ;C:OVA+CpG ODNs 组 ;D:OVA+GpC ODNs 组 与 NaCl 组比较, 犘 <0.01; 与 OVA 组比较, 犘 <0.05 抗体, 但该方法目前仍存在诸多疗效及安全性问 [6 8] 题 因此, 寻求新的高效 安全的哮喘气道炎症 [9] 气道重塑防治途径, 一直是该领域的研究热点 近年来, 能够诱导 Th1 免疫反应的新型疫苗佐剂 CpG ODNs 在变态反应疾病防治领域中的作用逐渐被重视 传统的铝佐剂增强机体的 Th2 免疫反应和体液免疫, 易诱发过敏 弗氏完全佐剂虽可引发抗原的 Th1 反应, 但其严重的副作用限制了临床应用 而 CpG ODNs 因其低成本 高效安全稳定 可标准化生产 半衰期长以及可多途径接种等优点逐渐取代了 [10] 上述佐剂的地位 CpG ODNs 是一种非特异性 抗原非依赖性 Th1 反应增强剂, 它是以非甲基化 CpG 二核苷酸为核心的核苷酸序列, 能有效激活多种免疫细胞, 增强 Th1 反应, 保护效应持续时间较长, 并产生强大的记忆性 Thl 反应, 对相同抗原产生再次应答 ; 同时它还可通过非抗原依赖方式直接刺激机体产生 Th1 细胞因子并表达主要组织相容性抗原 Ⅱ (MHC Ⅱ ) 和 B7.1 B7.2 共刺激分子, 促使免疫反应向 Th1 转 [10] 化 已证实 CpG ODNs 可增强肿瘤 结核患者免疫细胞表达 IFNγ 和 IL 12,1999 年它已被作为乙肝 [3] 疫苗佐剂进入 Ⅰ 期临床试验并取得良好效果 FONSECA 和 HIROSE [11 12] 也证实抗原和 CpG ODNs 协同作用可抑制 Th2 反应 嗜酸粒细胞炎症和气道高反应性, 但它能否在慢性哮喘气道重塑的防治中发挥作用目前仍不清楚 本研究以 OVA 为致敏原, 成功制备了哮喘小鼠气道重塑动物模型 与对照组相比, 模型组小鼠出现了易激惹 呼吸急促 腹肌抽搐 大小便失禁等症状, 病理结果显示模型组小鼠小支气管 血管黏膜下和肺组织有明显的炎细胞浸润, 小气道壁及血管壁胶原沉着 平滑肌增殖, 气道壁还可见上皮细胞脱落 杯状细 胞增多 管腔内黏液栓形成等病理改变 模型组 BALF 中细胞总数明显增多, 其中以嗜酸粒细胞增多为主, 淋巴细胞也有少量增多 CpG ODNs 干预组小鼠支气管肺组织的上述改变明显减轻, 而 GpC ODNs 对上述改变无明显影响 CpG ODNs 和 GpC ODNs 的主要区别在于前者具有该序列免疫刺激活性所必须的核心碱基 CG, 如果将之倒转或替代, 其免疫活性将丧失, 因而也丧失了对 Th 细胞免疫反应的调节作用 本研究结果也证实了这一点 此外, 有关外周血和 BALF 的检测结果表明, 模型组与干预组的总 IgE 均有上升, 但模型组 OVA 特异性 IgE 上升明显,CpG ODNs 干预组抑制了 OVA 特异性 IgE 增加, 但仍高于对照组水平 BALF 中 Th2 免疫反应细胞因子代表 IL 4 在模型组中较正常组明显升高, 而 CpG ODNs 干预部分抑制了 IL 4 的增加, 同时也使得 Th1 免疫反应的细胞因子代表 IFN γ 以及调节性 T 细胞 (Treg 细胞 ) 的代表性细胞因子 IL 10 轻度升高, 但 CpG ODNs 干预组 IFN γ 及 IL 10 水平与模型组比较未见统计学差异 推测可能系 CpG ODNs 干预作用是由 Th1 细胞及 Treg 细胞来共同介导完成的, 并且两种信号通路之间可能存在某种协同作用, 但此结论仍需要进一步深入研究来证实 因此,CpG ODNs 对慢性哮喘小鼠气道炎症和气道重塑的抑制作用是通过诱导 IFN γ 介导的 Th1 反应和 IL 10 介导的免疫耐受以及抑制 IL 4 介导的 Th2 反应来实现的, 这与 FON SECA 和 HIROSE [11 12] 的研究结果一致 从本研究结果不难发现,CpG ODNs 并未完全消除 OVA 诱发的气道炎症和气道重塑, 因此可能存在某种其他机制 [13 14] 来促使哮喘小鼠气道炎症和气道重塑的形成 此外, 有研究证实 CpG ODNs 能够通过增加调控 Th 细胞分化的转录因子 T bet/gata 3 的比率抑制哮

6 1 期方萍, 吴晓明, 周筠, 等.CpG ODNs 对慢性哮喘小鼠气道重塑的影响及机制 63 [15] 喘小鼠气道炎症, 这一机制是否也参与了 CpG ODNs 抑制哮喘气道重塑仍需进一步研究证实 综上所述, 本研究成功制备了哮喘小鼠气道重塑动物模型, 明确了 CpG ODNs 作为 Th 细胞免疫反应调节剂能够通过上调 Th1/Th2 比例以及诱导 Treg 细胞介导的免疫耐受发挥防治变应原引发的气道炎症和气道重塑的作用, 在提高特异性免疫治疗 (SIT) 疗效的同时减少变应原疫苗用量 降低 SIT 的副作用 研究结果为下一步 CpG ODNs 与重组变应原疫苗联合防治变应原引发的哮喘及其气道重塑提供了新的理论依据 参考文献 : [1] 犎犃犔犠犃犖犐犚, 犃犔 犕犝犎犛犈犖犛, 犎犃犕犐犇犙. 犃犻狉狑犪狔狉犲犿狅犱犲 犾犻狀犵犻狀犪狊狋犺犿犪 [ 犑 ]. 犆狌狉狉犗狆犻狀犘犺犪狉犿犪犮狅犾,2010,10(3): [2] 犔犃犚犛犛犗犖犓. 犕狅狀犻狋狅狉犻狀犵犪犻狉狑犪狔狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵犻狀犪狊狋犺犿犪 [ 犑 ]. 犆犾犻狀犚犲狊狆犻狉犑,2010,4 ( 犛狌狆狆犾 1): [3] 许淑云, 徐永健, 张珍祥, 等. 支气管哮喘模型大鼠气道重塑的特征及机制 [ 犑 ]. 华中科技大学学报 : 医学版,2006,35(4): [4] 犠犃犖犌犑, 犣犎犃犖犌犠, 犎犈犃, 犲狋犪犾. 犛犮狉犲犲狀犻狀犵狅犳狀狅狏犲犾犻犿犿狌 狀狅狊狋犻犿狌犾犪狋狅狉狔犆狆犌 犗犇犖狊犪狀犱狋犺犲犻狉犪狀狋犻 犾犲狌犽犲犿犻犮犲犳犳犲犮狋狊犪狊犻犿 犿狌狀狅犪犱犼狌狏犪狀狋狊狅犳狋狌犿狅狉狏犪犮犮犻狀犲狊犻狀犿狌狉犻狀犲犪犮狌狋犲犾狔犿狆犺狅犫犾犪狊狋犻犮犾犲狌犽犲犿犻犪 [ 犑 ]. 犗狀犮狅犾犚犲狆,2011,25(2): [5] 犅犝犎犜犗犐犃犚犗犞犐犖, 犛犗犖犇犈犔犘犕, 犠犐犌犌犐犖犜犗犖犑犕, 犲狋犪犾. 犃狀狋犻 狋狌犿狅狌狉狊狔狀犲狉犵狔狅犳犮狔狋狅狋狅狓犻犮犮犺犲犿狅狋犺犲狉犪狆狔犪狀犱犪狀狋犻 犆犇 40 狆犾狌狊犆狆犌 犗犇犖犻犿犿狌狀狅狋犺犲狉犪狆狔狋犺狉狅狌犵犺狉犲狆狅犾犪狉犻狕犪狋犻狅狀狅犳狋狌犿狅狌狉 犪狊狅犮犻犪狋犲犱犿犪犮狉狅狆犺犪犵犲狊 [ 犑 ]. 犐犿犿狌狀狅犾狅犵狔,2011,32 (2): [6] 张璇, 李孟荣, 王超, 等. 尘螨标准化免疫治疗 85 例哮喘儿童疗 效相关指标分析 [ 犑 ]. 中华儿科杂志,2010,48(7): [7] 犆犃犔犇犈犚? 犖犕犃, 犆犃犛犃犔犈犜犅, 犜犗犌犐犃犛犃, 犲狋犪犾. 犇犲犿狅犾狔犘. 犃犾犲狉犵犲狀 狊狆犲犮犻犳犻犮犻犿犿狌狀狅狋犺犲狉犪狆狔犳狅狉狉犲狊狆犻狉犪狋狅狉狔犪犾犲狉犵犻犲狊 : 犉狉狅犿犿犲狋犪 犪狀犪犾狔狊犻狊狋狅狉犲犵犻狊狋狉犪狋犻狅狀犪狀犱犫犲狔狅狀犱 [ 犑 ]. 犑犃犾犲狉犵狔犆犾犻狀犐犿犿狌狀狅犾,2011,127(1): [8] 犉犚犈犠犃犑. 犃犾犲狉犵犲狀犻犿犿狌狀狅狋犺犲狉犪狆狔 [ 犑 ]. 犑犃犾犲狉犵狔犆犾犻狀犐犿犿狌 狀狅犾,2010,125(2 犛狌狆狆犾 2): 犛 306 犛 313. [9] 犚犗犢犆犈犛犌, 犜犃犖犌犕犔. 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狊狅犳犮狌狉狉犲狀狋狋犺犲狉犪狆犻犲狊狅狀犪犻狉狑犪狔狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵犻狀犪狊狋犺犿犪犪狀犱狀犲狑狆狅狊犻犫犻犾犻狋犻犲狊犳狅狉狋狉犲犪狋犿犲狀狋犪狀犱狆狉犲狏犲狀狋犻狅狀 [ 犑 ]. 犆狌狉狉犕狅犾犘犺犪狉犿犪犮狅犾,2009,2(2): [10] 犅犔犃犖犓犛犇犃. 犐犿犿狌狀狅狊狋犻犿狌犾犪狋狅狉狔狊犲狇狌犲狀犮犲狊犻狀犻犿犿狌狀狅狋犺犲狉犪 狆狔 [ 犑 ]. 犆狌狉狉犗狆犻狀犗狋狅犾犪狉狔狀犵狅犾犎犲犪犱犖犲犮犽犛狌狉犵,2007,15(4): [11] 犉犗犖犛犈犆犃犇犈, 犓犔犐犖犈犑犖. 犝狊犲狅犳犆狆犌狅犾犻犵狅狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犻狀狋狉犲犪狋 犿犲狀狋狅犳犪狊狋犺犿犪犪狀犱犪犾犲狉犵犻犮犱犻狊犲犪狊犲 [ 犑 ]. 犃犱狏犇狉狌犵犇犲犾犻狏犚犲狏, 2009,61(3): [12] 犎犐犚犗犛犈犐, 犜犃犖犃犓犃犎, 犜犃犓犃犎犃犛犎犐犌, 犲狋犪犾. 犐犿犿狌狀狅犿狅犱狌 犾犪狋狅狉狔犲犳犲犮狋狊狅犳犆狆犌狅犾犻犵狅犱犲狅狓狔狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊狅狀犺狅狌狊犲犱狌狊狋犿犻狋犲 犻狀 犱狌犮犲犱犪犻狉狑犪狔犻狀犳犾犪犿犿犪狋犻狅狀犻狀犿犻犮犲 [ 犑 ]. 犐狀狋犃狉犮犺犃犾犲狉犵狔犐犿犿狌 狀狅犾,2008,147(1):6 16. [13] 犎犃犛犛犃犖犕, 犑犗犜, 犚犐犛犛犈犘犃, 犲狋犪犾. 犃犻狉狑犪狔狊犿狅狅狋犺犿狌狊犮犾犲狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵犻狊犪犱狔狀犪犿犻犮狆狉狅犮犲狊狊犻狀狊犲狏犲狉犲犾狅狀犵 狊狋犪狀犱犻狀犵犪狊狋犺犿犪 [ 犑 ]. 犑犃犾犲狉犵狔犆犾犻狀犐犿犿狌狀狅犾, (5): 犲 3. 犱 [14] 犇犈犓犓犈犚犛犅犌, 犕犃犃犚犛犐犖犌犎犎, 犕犈犝犚犛犎, 犲狋犪犾. 犃犻狉狑犪狔狊狋狉狌犮狋狌狉犪犾犮狅犿狆狅狀犲狀狋狊犱狉犻狏犲犪犻狉狑犪狔狊犿狅狅狋犺犿狌狊犮犾犲狉犲犿狅犱犲犾犻狀犵犻狀犪狊狋犺犿犪 [ 犑 ]. 犘狉狅犮犃犿犜犺狅狉犪犮犛狅犮,20096(8): [15] 犇犗犖犌犔, 犆犎犈犖犕, 犣犎犃犖犌犙, 犲狋犪犾. 犜 犫犲狋 / 犌犃犜犃 3 狉犪狋犻狅犻狊犪狊狌狉狉狅犵犪狋犲犿犲犪狊狌狉犲狅犳犜犺 1/ 犜犺 2 犮狔狋狅犽犻狀犲狆狉狅犳犻犾犲狊犪狀犱犿犪狔犫犲狀狅狏犲犾狋犪狉犵犲狋狊犳狅狉犆狆犌犗犇犖狋狉犲犪狋犿犲狀狋犻狀犪狊狋犺犿犪狆犪狋犻犲狀狋狊 [ 犑 ]. 犆犺犻狀犕犲犱犑 ( 犈狀犵犾 ),2006,119(16): ( 编辑国荣 ) 櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵 ( 上接第 53 页 ) [10] 犕犃犛犛犐犈犅犕, 犆犃犚犛犗犖犘犈, 犕犆犕犝犚犚犃犢犑犑, 犲狋犪犾. 犐狉犫犲狊犪狉 狋犪狀犻狀狆犪狋犻犲狀狋狊狑犻狋犺犺犲犪狉狋犳犪犻犾狌狉犲犪狀犱狆狉犲狊犲狉狏犲犱犲犼犲犮狋犻狅狀犳狉犪犮狋犻狅狀 [ 犑 ]. 犖犲狑犈狀犵犾犑犕犲犱,2008,359(23): [11] 犌犃犚犆犐犃犚, 犇犐犈犅犗犔犇犛. 犛犻犿狆犾犲, 狉犪狆犻犱犪狀犱犲犳犳犲犮狋犻狏犲犿犲狋犺狅犱狅犳狆狉狅犱狌犮犻狀犵犪狅狉狋狅犮犪狏犪犾狊犺狌狀狋狊犻狀狋犺犲狉犪狋 [ 犑 ]. 犆犪狉犱犻狅狏犪狊犮犚犲狊, 1990,24(5): [12] 犚犗犛犃犜犐犅, 犕犆犓犐犖犖犗犖犇. 犚犲犵狌犾犪狋犻狅狀狅犳犻狅狀犮犺犪狀狀犲犾犲狓狆狉犲狊 狊犻狅狀 [ 犑 ]. 犆犻狉犮犚犲狊,2004,94(7): [13] 犅犗犚犔犃犓犑, 犜犎犝犕犜. 犎犪犾犿犪狉犽狊狅犳犻狅狀犮犺犪狀狀犲犾犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊 狊犻狅狀犻狀犲狀犱 狊狋犪犵犲犺犲犪狉狋犳犪犻犾狌狉犲 [ 犑 ]. 犉犃犛犈犅犑,2003,17(12): [14] 犚犗犛犈犑, 犃犚犕犗犝犖犇犃犛犃犃, 犜犐犃犖犢犔, 犲狋犪犾. 犕狅犾犲犮狌犾犪狉犮狅狉 狉犲犾犪狋犲狊狅犳犪犾狋犲狉犲犱犲狓狆狉犲狊犻狅狀狅犳狆狅狋犪狊狊犻狌犿犮狌狉狉犲狀狋狊犻狀犳犪犻犾犻狀犵狉犪犫犫犻狋犿狔狅犮犪狉犱犻狌犿 [ 犑 ]. 犃犿犑犘犺狔狊犻狅犾 犎犲犪狉狋犆,2005,288(5): 犎 2077 犎 狋犻狅狀,2003,108(6): [16] 犃犓犃犚犉犌, 犠犝犚犆, 犑犝犃犖犌犌犑, 犲狋犪犾. 犕狅犾犲犮狌犾犪狉犿犲犮犺犪 + 狀犻狊犿狊狌狀犱犲狉犾狔犻狀犵犓犮狌狉狉犲狀狋犱狅狑狀狉犲犵狌犾犪狋犻狅狀犻狀犮犪狀犻狀犲狋犪犮犺狔 犮犪狉犱犻犪犻狀犱狌犮犲犱犺犲犪狉狋犳犪犻犾狌狉犲 [ 犑 ]. 犃犿犑犘犺狔狊犻狅犾犎犲犪狉狋犆犻狉犮犘犺狔狊 犻狅犾,2005,288(6): 犎 2887 犎 [17] 犔犐犡, 犕犃犃犙, 犚犈犖犑犜, 犲狋犪犾. 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犫犻狊狅狉狆狉狅犾狅犾狅狀狆狅狋犪狊 狊犻狌犿犮犺犪狀狀犲犾狊犻狀犪狋狉犻犪犾犿狔狅犮狔狋犲狊狅犳狉犪犫犫犻狋狊狑犻狋犺犺犲犪狉狋犳犪犻犾狌狉犲 [ 犑 ]. 犑犛犺犪狀狓犻犕犲犱犝狀犻狏,2011,42(10): [18] 犖犐犆犓犔犃犛犑犕, 犘犐犜犜犅, 犜犐犕犕犐犛犌, 犲狋犪犾. 犈犳犳犲犮狋狅犳犲狀犪犾犪狆狉犻犾狅狀犿狅狉狋犪犾犻狋狔犪狀犱狋犺犲犱犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋狅犳犺犲犪狉狋 犳犪犻犾狌狉犲犻狀犪狊狔犿狆狋狅 犿犪狋犻犮狆犪狋犻犲狀狋狊狑犻狋犺狉犲犱狌犮犲犱犾犲犳狋狏犲狀狋狉犻犮狌犾犪狉犲犼犲犮狋犻狅狀犳狉犪犮狋犻狅狀狊 [ 犑 ]. 犖犲狑犈狀犵犾犑犕犲犱,1992,327(10): [19] 犑犝犇犢犢犆, 犖犐犖犌犓, 犇犈犅犗犚犃犎犜犑, 犲狋犪犾. 犎犲犪狉狋犳犪犻犾狌狉犲狆犪 狋犻犲狀狋狊狉犲犮犲犻狏犻狀犵犃犆犈犐狊 / 犃犚犅狊狑犲狉犲犾犲狊犾犻犽犲犾狔狋狅犫犲犺狅狊狆犻狋犪犾犻狕犲犱狅狉狋狅狌狊犲犲犿犲狉犵犲狀犮狔犮犪狉犲犻狀狋犺犲犳狅犾狅狑犻狀犵狔犲犪狉 [ 犑 ]. 犑犎犲犪犾狋犺犙狌犪犾犻狋狔,2011,33(4): [15] 犞犈犚犓犈犚犓犃犗, 犠犐犔犇犈犚犛犚, 犆犗犚犗犖犈犔犚, 犲狋犪犾. 犐狅狀犻犮狉犲 犿狅犱犲犾犻狀犵狅犳狊犻狀狅犪狋狉犻犪犾狀狅犱犲犮犲犾狊犫狔犺犲犪狉狋犳犪犻犾狌狉犲 [ 犑 ]. 犆犻狉犮狌犾犪 ( 编辑 韩维栋 )

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610 西安交通大学学报 ( 医学版 ) 第 34 卷 izingfactor,edhf) 介导 其中,NO 和 PGI 2 通常在较大血管发挥主要的扩张血管作用, 而 EDHF 通 [2] 常在中小血管中发挥作用 EDHF 的本质及其信号通路目前并不完全清楚, 但在 EDHF 介导的血管舒张过程中

610 西安交通大学学报 ( 医学版 ) 第 34 卷 izingfactor,edhf) 介导 其中,NO 和 PGI 2 通常在较大血管发挥主要的扩张血管作用, 而 EDHF 通 [2] 常在中小血管中发挥作用 EDHF 的本质及其信号通路目前并不完全清楚, 但在 EDHF 介导的血管舒张过程中 第 34 卷第 5 期 2013 年 9 月 西安交通大学学报 ( 医学版 ) 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犡犻 犪狀犑犻犪狅狋狅狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔 ( 犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊 ) 犞狅犾.34 犖狅.5 犛犲狆.2013 钙激活钾通道在高糖所致内皮源性超极化因子介导的内皮舒张功能障碍中的作用 赵丽梅, 王燕, 杨勇, 杨予白, 邓秀玲 ( 西安交通大学医学院生理学与病理生理学系, 陕西西安 710061)

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