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汀斋路
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1 第卷第期 ) 年月电化学 5 67 $/ /8+7 8!/9:#+7; $% ) % % ' %,.,(! ( ).(( "#, % % ' % 3 % & 金标银染放大技术的羟基自由基灵敏检测杨妍喻鹏张小华陈金华湖南大学化学化工学院化学生物传感与计量学国家重点实验室湖南长沙南阳师范学院化学与制药工程学院河南南阳摘要本文采用银染增强金纳米粒子为信号因子构建了一种新型的灵敏检测羟基自由基! 的 " 电化学传感器首先巯基化的 " 通过 # 键自组装于金基底电极表面然后由 $%&' & 反应产生的! 可引起电极表面 " 自组装层的氧化损伤裂解未损伤的 " 可与功能化上的 " 杂交利用对银离子的催化还原反应将银原子沉积在的周围形成一层银外壳再用差分脉冲伏安法 " 技术对沉积的银进行电化学检测从而实现! 的定量分析研究结果表明在最优实验条件下该传感器检测! 的线性范围为 ( 检测下限为 )& ( 该传感器有较好的重复性选择性并在抗氧化剂抗氧化能力评估方面具有潜在应用价值关键词羟基自由基 " 损伤金纳米粒子银染增强电化学传感器中图分类号文献标识码活性氧是生物有氧代谢过程的一副产品主要包括超氧阴离子过氧化氢!. 和羟基自由基! 其中! 是最活泼的活性氧物种能引起严重的 " 蛋白质和体液氧化损伤脂质过氧化和细胞毒作用等 4 在正常生理情况下体内! 一般处于不断产生与清除的动态平衡之中维持在正常生理水平上 4 但在疾病或某些外源性药物的作用下! 会快速地增加导致氧化应激和抗氧化防御之间的平衡失调从而在毒理学 ) 和病理学上导致机体的衰老和疾病的产生 4 因此跟踪和检测! 对病理研究和疾病预防有重要意义目前! 检测方法主要包括荧光法电子自旋共振法及高效液相色谱法等 4 然而这些方法仪器昂贵成本高难以实现常规监测 4 电化学方法易于操作响应速率快价格低廉能耗低且易于小型化 4 文献曾报道过! 引起的 " 损 ) 伤分析及抗氧化剂评估等但针对! 浓度的检测研究甚少 4 最近作者课题组构建了一种生物条形码放大的 " 电化学传感器实现了! 的检测但检测灵敏度仍不高 4 针对! 检测的 " 电化学传感器还有待深入研究 4 此外金标银染放大技术由于具有操作简便对响应信号放大明显等特点在电化学生物传感如手性氨基酸检测电化学免疫分析和 " 分析等方面得到 * 了较好的应用 4 金标银染放大技术的基本原理为利用金纳米颗粒对银离子的催化还原反应将银原子沉积在的周围形成一层银外壳再采用差分脉冲伏安法 " 等电化学技术对沉积的银进行检测从而实现目标物的灵敏分析 4 但应用金标银染放大技术进行! 的电化学检测目前尚未见报道 4 本文采用金标银染放大技术构建了用于! 检测的电化学 " 传感器图 4 通过 $%&' & 反应产生的! 对电极表面的 " 产生氧化损伤没有损伤的 " 可以通过碱基互补配对与功能化金纳米颗粒上的 " 杂交再通过金纳米颗粒催化银染法放大响应信号实现! 的高灵敏度检测实验 $ 试剂与仪器收稿日期 (( 修订日期 (*() 通讯作者 +%,- (./( 01 %& 1& 0 & % & 1 231% & % & 国家自然科学基金项目 4 ) ) 资助

2 第期杨妍等金标银染放大技术的羟基自由基灵敏检测 /. () * +,,-)),)--,)-)-),). 和 / 0) * + ),,,),,,),),,. 上海生物工程 + 巯基己醇 1) $ 粒径约为 /.! 溶液由柠檬酸盐还原氯金酸法制得 23 ) 冰箱中储存待用 4 由 5 - 螯合的过渡金属 /6 4 2 催化 / 4 / 发生!! 反应产生 / * / 4 / 7+'% 以 /6 浓度近似表示 4 的浓度 +8/ / 8// 银染溶液现配实验用水为超纯水其他试剂均为分析纯由金电极 7/ 饱和甘汞参比电极 )5 和铂辅助电极组成传统的三电极体系通过饱和 9 4. 溶液的盐桥将参比电极与电解质溶液隔开使用 ) :++ ; 电化学工作站上海辰华测试电极的循环伏安 ) 曲线电化学阻抗 5: 谱图和差分脉冲伏安曲线 5: 频率范围振幅 ) 电位区间扫速 3 电解质溶液为 3 3 9) ) * +. <2 '%3 水溶液 3 使用 = / 紫外可见分光光度仪表征功能化的金纳米颗粒 3 功能化金纳米粒子先将溶液 /3 与 //34 混合然后向该混合液中缓慢加入一定量的 3 3 ) 和 3 3 ;# 3>2 溶液 3 室温下搅拌 /232 3! 离心. 3! 即得 / 功能化金纳米粒子 /! 3 再将所得的 /" 样品转移于 /3 缓冲溶液. 3 3 ; # 3>263/..3 3 ) 363? 3 39) 363>3 31) / 363>3 3 /83/. ) ) / 中即可传感界面构建和羟基自由基电化学检测基底电极依次用 3# 和 3$ 3 / 4. 粉抛光无水乙醇和超纯水超声清洗各 3! 除去金电极表面吸附的 / 4. 粉末 3 处理的基底电极置于 3 3 / 4 2 溶液中循环伏安扫描 % 扫速 3 直至特征循环伏安曲线稳定 3 而后超纯水冲洗干净氮气吹干备用将 3& 3 3' 巯基化的溶液. 3 3 ;# 3>2 滴涂于已处理的金基底电极表面并室温下搁置 +3 然后将该修饰电极置于 3 31) 溶液中浸泡 3 以封闭金基底电极上未结合的活性位点即得 1) < < 电极 3 该电极在!! 溶液 / * / 4 / 373+'%3 中浸泡. 3! 使溶液中产生的 4 与完全反应 3 然后又滴涂 / 3 3 / 溶液在 4 反应后的 1) < < 电极上室温下搁置 /33 即得 / <1) < < 电极 3 为放大检测信号将 / <1) < < 电极避光浸泡于银染溶液中 3! 然后用大量的水冲洗电极去除多余的银染溶液 3 传感器制备过程中每步操作之后均用 3 3 ; 缓冲溶液 # 3>2 冲洗电极并用氮气吹干将经银染放大处理的 / <1) < < 电极在 3 的 9 4. 溶液中测试曲线电位扫描范围振幅 3 83 图金标银染法放大技术的羟基自由基检测示意图! " # "!$! "%$ &% $ ' $!!! $ $!! # '

9 电化学年脉冲宽度 % 脉冲周期 % $ 响应信号为电极上银纳米颗粒的氧化电流所有实验均重复次及以上金基底电极的每一步修饰均使用 23 和!

表明其有比较好的电子转移能力通过 3 键自组装得到电极带负电的能有效地阻碍 6! 7 8 9 探针与电极之间的电子传递使电子转移阻力增加 ) 7 曲线为消除电极表面未结合位点的非特异性吸附效应采用!" 封闭电极即得!" 电极其图 $% 和 $% 的紫外! 可见光谱图 ".

3 9 电化学年脉冲宽度 % 脉冲周期 % $ 响应信号为电极上银纳米颗粒的氧化电流所有实验均重复次及以上金基底电极的每一步修饰均使用 23 和! 技术进行表征结果与讨论的紫外可见光谱表征使用紫外可见光谱表征 $% 和 $% 样品如图所示粒径约 -/ 的 $% 在 -/ 处有一特征紫外吸收峰 $% 的吸收峰则在 -/ 附近该紫外吸收峰位置的微小变化说明在 $% 上修饰虽影响了 $% 的分布但并未改变 $% 的固有特性传感界面的电化学表征不同电极在 //,+4 5 6! : ; /,+4 5!+ 溶液中的交流阻抗谱图和循环伏安曲线如图所示在法拉第阻抗谱图低频区的线性部分对应着电极的扩散控制过程高频区的半圆部分对应着电子转移控制过程如果电荷转移速率比较快阻抗谱图中可能只存在线性部分相反比较慢的电荷转移过程的阻抗谱图中则出现一个较大的半圆半圆的直径等于电极上电子转移电阻 ) 从图中可以看到裸金电极半圆直径很小 ) 9 曲线表明其有比较好的电子转移能力通过 3 键自组装得到电极带负电的能有效地阻碍 6! 探针与电极之间的电子传递使电子转移阻力增加 ) 7 曲线为消除电极表面未结合位点的非特异性吸附效应采用!" 封闭电极即得!" 电极其图 $% 和 $% 的紫外! 可见光谱图 ". % + %* #)0,1 $% -& #1-#5 ),- + & $% ) 值进一步增加 ) 77 曲线 # 而后!" 电极的与功能化 $% 上的进行杂交可得 $%!" 电极其 ) 有显著的增加 ) 曲线 & 与的杂交使电极表面连接了更多带负电荷的且 $% 的空间位阻较大进一步阻碍了电极与 6! 之间的电子转移这表明通过图所示步骤已成功构建了 $%!" 电极不同传感电极的循环伏安曲线如图 ' 所示裸电极的循环伏安曲线呈现出 6! 的准可逆氧化还原峰电极依次修饰了!" $% 后循环伏安曲线的氧化还原峰电位差 * 逐增而氧化还原峰电流趋减这表明随着自组装步骤的进行电极表面的电子转图裸!" # 和 $%!" & 电极的电化学阻抗谱图和循环伏安曲线 ' ( %) *+,)% -& # #+ #.,+) //, 0 /% ',1 ) & ) + #)0,& % ' 0,+& + #)0,& + #)0,& #!" + #)0,& & $%!" + #)0,&

4 第期杨妍等金标银染放大技术的羟基自由基灵敏检测移速率越来越慢实验可行性如图 3 所示未与反应的电极经与杂交并银染放大处理后的响应信号 / 为 4 5 曲线 / 与 "#$% 2 反应后的电极经与杂交并银染放大处理后的响应信号为 4 6 曲线由此可看出电极中的经 "#$% 2 氧化损伤后引发链断裂引起电极上减少在接下来的银染反应中金催化沉积银的量也随之减少从而导致其响应电流明显降低其图 3 电极与 "#$% 2 反应前 /1 和后 1 经杂交并银染放大后的响应信号 ' 3 - #) #* $ +.-# *#- /1/) /*. - 1 ). -/+.. "#$% 2 /). ) * -. - "# *. $, - ) /)+ 电流变化值! / 2 为 7 这表明所设计的该电化学传感器用于检测是可行的实验参数优化银染时间和与电极反应时间对电极响应信号的影响如图所示随着银染时间的增加金催化银的沉积量随之增加其响应信号也增大当时间太长时银染溶液中 8 会与电极上带负电荷的链发生非特异性吸附导致单独成核造成干扰故控制银染时间非常重要 ( 电极随着银染时间增加其响应信号随之增加 7(" ) 之后响应信号没有明显变化图故选取 7(" ) 为银染时间 ( 从与电极反应时间对电极响应信号的影响图可看出随着与电极反应时间增加响应信号逐渐减小 97(" ) 趋于稳定故选取 97(" ) 为与电极的反应时间羟基自由基的检测电极与不同浓度的反应后经杂交并银染放大处理后的响应信号曲线由图 : 示出 ( 从图 : 中可以看出响应信号随着浓度的增加而减小图 : ( 峰电流差值和浓度的对数在 7 (;( 77("#$% 2 成线性关系图 : 线性回归方程 (!(3 47:4$ "#$% 2 1 (8( 6:56 ( 图银染时间和与电极反应时间对电极响应信号的影响!"#$% & ' ( )*$ )+ #* $, -./ ) ) (. " (01/). - /+. #). ". )/). $ +.-# 1#). - #) #*. $ +.-#!"#$% 2 1

电化学年图 ()* ( + 电极与不同浓度反应后经 )* +*,- 杂交并银染放大处理的 ),. 响应曲线 (/0" 1 2 3 "4 ),. 峰电流差值 5 与浓度对数之间的校正曲线 ),.

5 电化学年图 ()* ( + 电极与不同浓度反应后经 )* +*,- 杂交并银染放大处理的 ),. 响应曲线 (/0" "4 ),. 峰电流差值 5 与浓度对数之间的校正曲线 ),.' -&" - -"#$ ()* 2( + '"% ' %6 $% ## ' " ' " -"##+'$ '0"% # %6 $ - ' $ %)* +*,-5$ " ' " -"# ' " 1 2 5#'"0 "" 84 9$ '# & ""#$ ),.& :+'' % ## ' 5 - #+ " "#$ " ' $0"# " ' " 图所发展传感电极对和检测的选择性!"#$ % "& % '"% " % ; 检测限为 0" 1 5; 与其他检测的电化学传感器相比基于金标银染放大技术的 )* 电化学传感器极大地提高了检测灵敏度其检测限远低于最近发展的基于生物条形码放大的 )* 电化学传感器 0" 1 和一些光电传感器获得的检测限 0" 1 和 00" 1 选择性和重现性生物体系中可能共存其他活性氧如和因此有必要考察该电化学 )* 传感器的选择性结果如图所示相对于 0" 1 分别与 0" 1 和反应后的 ()* ( + 电极经 )* +*,- 杂交并银染放大获得的响应信号均非常小充分说明该传感器具有比较好的选择性此外支相同的 ()* ( + 电极对 0" 1 的检测其响应信号的标准误差为表明该传感器具有很好的重现性结论基于金标银染放大技术构建了一种高灵敏检测的新型电化学 )* 传感器 3 在优化条件下该电化学 )* 传感器对检测表现出了极佳性能检测范围宽 " 1 检测限低 3 0" 1 具有良好的选择性和重现性 3 此外该电化学传感器有望在抗氧化剂抗氧化性能评估方面获得应用参考文献 33 "313)73 ' % <3 73 '' << 3=73 3 3> - " -3 "#3 $ 3 "? % 3 &'"& ' -3 "#3 & 3?' )* '"$ 0 3@ "- -"' A 34 "- -"'-3 %34 " '" :"3 73>< :" 3 73 <+' B" 3"#3"?! 3' % -3 3)* 3% 0 3 %3 '3 % A 3 " + '3 %3 + '34 "$ 0 -'! ( 3 33C 3,73 % '-" 3.73D%6 '%-3A " %3$ 3 ' -3$!%'"?! 3' % 3+&" 3% --" + " 3 3 E+ "+-3-" + " - 3B " 36 $3&'" -3 %3 + 3 % A 3A"+' 3 "#3$ 3 0 ' 3 $ 0 3 "!

6 第期杨妍等金标银染放大技术的羟基自由基灵敏检测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第期杨妍等金标银染放大技术的羟基自由基灵敏检测 /. () * +,,-)),)--,)-)-),). 和 / 0) * + ),,,),,,),),,. 上海生物工程 + 巯基己醇 1) $ 粒径约为 /.! 溶液由柠檬酸盐还原氯金酸法制得 23 ) 冰箱中储存待用 4 由 5 - 螯