实验室猪精液品质检测新技术

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1 冷冻精液在猪生产中的应 用及存在的问题 中国农业大学朱士恩 Tel: mail:

2 汇报提纲 一 猪冷冻精液的研究意义 二 精液品质检查 三 国内外猪精液冷冻技术发展概况 四 存在的问题与分析 五 市场前景展望

3 一 猪冷冻精液的研究意义 1. 充分挖掘优秀种公猪的遗传资源 ; 2. 利于国际 国内交流, 使配种不受时间和空间的限制 ; 3. 加速品种改良, 提高优良品种覆盖率 ; 4. 降低引种及饲养管理成本 ; 5. 降低传染病的危险, 为生物安全提供保障 ; 6. 建立基因库, 保护濒危品种

4 二 精液品质检查与评定 ( 一 ) 猪精液品质评定的内容及标准 ( 二 ) 普通显微镜检查 ( 三 ) 计算机辅助分析仪和流式细胞仪检查

5 ( 一 ) 猪精液品质评定的内容及标准 1 国标(GB/T ) 评定的内容及标准 精子活力 : 在 37 下呈直线前进运动的精子占总精子数的百分比 精子密度 : 单位体积精液中精子数, 单位为 10 8 个 /ml 精子畸形率 : 畸形精子占总精子数的百分率

6 采精频率 : 成年公猪每周采精 2~3 次青年公猪采精每周 1~2 次精液稀释后每头份剂量 : 为 80~100mL 总精子数 : 个 ~ 个精子活力 :70% 以上原精液细菌菌落数 : /ml 精子畸形率 : 18%

7 2 国标 (GB/T ) 对原精液品质评估 颜色乳白色, 均匀一致 异常 绿色 黄色浅红色 红褐色 异常气味略带腥味, 无异味恶臭等异常气味 ph 值 正常精液 ph 值初 : 7.0~7.8; 浓密 : 弱酸性 ph 值越低精子密度越大 采精量 100 ml 电子天平称量法按 1g = 1 ml 计

8 ( 二 ) 显微镜检查 计数法 按 0.1~1.0 的十级评分法进行评估 活率要求 鲜精活率 >0.7 可用 冷冻精液活率 >0.4

9 ( 三 ) 计算机辅助分析仪和流式细胞仪

10 1 计算机辅助 (CASA) 检测精子运动能力 CASA 活率 活力 轨迹速度 ( VCL) 平均路径速度 (VAP) 直线运动速度 (VSL) 直线性 (LIN) Table : 解冻后质膜完整率和活力参数 (from Eriksson,2002) Bree d Boars (n) Ejaculates (n) PMI Motile Linearly (%) 1 (%) 2 motile (%) VSL (μm/s) 3 VAP (μm/s) 4 VCL (μm/s) 5 LHD (μm/s) 6 L ±8.3 53±4.5 60± ± ± ± ± 0.52 Y ±8.4 52±6.0 66± ± ± ± ± 0.63 H ±5.4 49±4.6 69± ± ± ± ± 0.71 H, 汉普夏 ;L, 长白猪 ;Y, 约克夏. 1 精子质膜完整率 ; 2 眼观评估 ; 3 直线运动速度 ; 4 平均路径速度 ; 5 轨迹速度 ; 6 精子侧摆幅度

11 IVOSⅡ 计算机辅助精子分析仪

12 ?? Sperm vision interface

13 2 流式细胞仪

14 精子质膜检测新方法 SYBR-14 和 PI 的联合染色 流式细胞仪检测 显微镜进行检测 B B A C A C Q1: PI 染色的死精子 ; Q4: SYBR-14 染色活精子 ; Q2: SYBR-14/PI 染色, 正在死亡的精子 ; Q3: 杂质颗粒, 无颜色 A:PI 染色的死精子, 为红色 ; B:SYBR-14 染色活精子, 为绿色, 膜功能完整 ; C:SYBR-14/PI 染色, 正在死亡的精子为橙色

15 顶体检测 现在用的最多的是异硫氰酸荧光素 (FITC) 与花生凝集素 (PNA) 结合使用效果好 精子顶体主要是应用 PI 和 FITC-PNA 联合标记, 用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测 流式细胞仪检测精子的活力和顶体状态 荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态 A) B) Q1:PI 标记为未发生顶体反应死精子 ; Q2:PI/FITC-PNA 标记的顶体反应死精子 ; Q3: 无颜色, 未发生顶体反应活精子 ; Q4:FITC-PNA 标记发生顶体反应活精子 A)PI 标记死精子的细胞核呈现红色荧光 ; B) 发生顶体反应或顶体膜破损的精子被 FITC-PNA 标记, 呈现绿色顶体

16 三 国内外猪精液冷冻技术发展概况

17 全球猪冻精研究实验室 猪鲜精配种使用率 99.5% 猪冻精配种使用率 0.5% 有 30 多家猪冻精实验室分布于 : 美国 英国 意大利 西班牙 法国 德国 瑞典 丹麦 比利时 中国等

18 目前国内猪冷冻精液研究单位和研究者 吉林省农业科学院李兆华研究院 上海农科院张德福研究员 甘肃农业大学张兆旺教授 南京农业大学芮荣教授 西北农林科技大学李青旺教授 四川农业大学马恒东教授 东北农业大学刘娣教授 广东温氏集团 卡苏公司 百钧达科技发展 ( 北京 ) 有限公司等

19 渗透性和非渗透性冷冻保护剂种类 1. 渗透性抗冻保护剂 甘油 (Glycerol) 乙二醇(EG) 二甲基亚砜(DMSO) 丙二醇 (PROH) 二甲基甲酰胺(DMF) 乙酰胺(AA) 等 2. 非渗透性抗冻保护剂 蔗糖 海藻糖 岩藻糖 聚蔗糖 葡聚糖 聚已二醇 (PEG) 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 血清白蛋白 犊牛血清等

20 抗冻保护剂保护原理 1. 渗透性冷冻保护剂由于细胞外液渗透压较高, 在精子脱水的同时, 渗透性抗冻保护剂被置换到细胞内部, 并与水分子结合, 在平衡与降温过程中, 可降低细胞内电解质浓度, 从而保护细胞器免受高浓度电解质的损伤 同时避免细胞内水分子结晶导致的损伤 2. 非渗透性冷冻保护剂其不能进入细胞内, 能够提高细胞外渗透压, 在冷冻过程中使细胞内的水分向细胞外渗出, 达到脱水的目的, 以减少细胞内有序冰晶的形成, 从而保护细胞免受损伤

21 冷冻载体 1. 颗粒 : 约 0.1mL 2. 细管 : mL 1mL 小型细管 5mL 大型细管 3.5mL 扁平塑料袋

22 ( 一 ) 温室集团猪精液冷冻保存

23 冷冻程序 : 1. 采用卵黄稀释液稀释, 放入 4 冰柜平衡 1~2h, 使精 子最终密度达到 12.5 亿 /ml,;

24 2. 装入 5mL 冷冻管, 低温 (5 ) 平衡 2h

25 3. 计算机软件设计降温程序

26 4. 细管置于冷冻架上降温,7min 完成

27 5. 细管在液氮中冷冻保存

28 6. 在 50 水浴中解冻 30s

29 冷冻精液输精效果比较 目前, 猪精液冷冻主要是颗粒法 5 ml 细管法及 5 ml 扁平袋 (Flat- Pack) 法, 其中 5 ml 细管法及 5 ml 扁平袋 (Flat-Pack) 法保存效果要优 于颗粒法 采用子宫颈输精法, 对自然发情母猪进行 2 次人工授精 (50 亿 ~60 亿 / 次 ), 结果显示 : 方法 产仔率 (%) 平均窝产仔数 ( 头 ) 研究者 5 ml 扁平袋法 (Eriksson et al.,2002) 5 ml 细管法 (Hofmo et al.,2000) 颗粒法 (Didion et al.,1996) 5 ml 细管法 ( 深部 ) ( 广东温氏集团,2014)

30 广东温氏集团冻精及输精效果 (2016) 冻精剂型 (ml) 表 -1 精液冷冻效果 每剂冻精所含精子数 ( 亿 ) 解冻后平均活力 (%) 母猪品种 YY/LL/DR /RR 母猪胎次 输精 / 头 表 -2 冻精输精方式 输精方式 输精剂量 / 亿 / 次 输精次数 / 次 每次输精间隔 /h 解冻至输精的间隔 /min 深部 25(1/2 管 ) 表 -3 冻精输精受胎及分娩 输精头数配种受胎率 /% 分娩率 /% 窝均产仔 / 头

31 ( 二 ) 百钧达科技发展 ( 北京 ) 有限公司 近年来在猪冷冻精液保存技术研发取得突破性进展 采用 0.5mL 细管冷冻解冻后活力测定, 使用单层精子活动空间的专用精子计数板, 在显微镜下检测, 活力达到 80% 以上 在 38 条件下可存活 5~6h 近一年的冻精输精结果统计, 发情正常母猪的情期受胎率达 88.5%, 平均窝产仔数 11.2 头 与鲜精输精效果无显著性差异

32 百钧达冷冻精液输精新进展 (2017) 单位冻精配种 / 头 北京养猪育种中心 返情与空怀 / 头 妊娠 / 头妊娠率 / % 均窝产仔数 / 头 均窝产活仔数 / 头 广东温氏新兴种猪 威宁正大花庙猪场 上饶市正邦牛皮山猪场 对照组 襄阳正大武马岗种猪场

33 ( 三 )Peng Wang,2012 精液用等体积的 BTS 稀释,3h 降温到 15, 经 800 g 离心 10 min, 弃上清 在 15 用 BTS 稀释,1.5~2.5 h 降温至 5, 再将精子终浓度调整为 , 甘油终浓度为 3% 0.25mL 细管分装 封闭,5 平衡 1h 再用冷冻仪以 1 /min 降温至 -5, 置于液氮上方 4cm 处熏蒸 15min, 然后投进液氮 解冻 : 在 37 水浴中 45s 结果 : 活率 : 43.2 % 顶体完整率 :52.75% 质膜完整率 :48.13%

34 ( 四 )San-Yuan Huang- 台湾,2009 鲜精在 25 室温平衡 1h, 经稀释后 15 下平衡 4h, 然后 800g 离心 10min, 弃上清 用含 80% 乳糖和 20% 蛋黄溶液, 重新悬浮 将装精液的离心管置于水中,2.5h 降温至 5 再次用含 7% 甘油的蛋黄 - 乳酸溶液稀释至精子密度为 /ml, 装入 6mL 细管中, 将细管在液氮上方 3cm 处熏蒸 20min 后, 投入液氮保存 解冻 : 50 水浴中 45s, 室温下用稀释液将精液 稀释, 然后在 37 培养箱中培养 10min 活力 :56%

35 ( 五 ) 国外冻精研究进展 1. 法国 IMV( 卡苏 ) 公司,2014 鲜精 : 活力 85%, 畸形率 15%; 用 0.5mL 卡苏细管冻精,42 水浴锅加热 20s, 将解冻后精液加入 34 的稀释液中, 计 7 支冻精 / 深部输精, 冻精输精最低标准为活力 >40%, 使用冻精输精, 建议输精 3 次, 结果如下 :

36 卡苏公司采用冻精深部输精的猪场实验数据 实验批次 总精子数 受胎率 % 生产指标 5 0.5mL (22) 11.4(0.7) mL (22) 11.8(0.7) mL (22) 11.1(0.8)

37 2. 韩国 : Yong-Seung Lee,2015 添加 11% 乳糖和 20mL 蛋黄稀释至 80mL, 使精子密度达 /ml, 然后离心 (400 g,10 min, 22 C), 3h 降温至 5 C 用含 1.5% Orvus Es Paste 和 9% 甘油的乳糖 - 蛋黄液 2:1 进行稀释 然后用 0.5mL 细管分装, 10min 降温至 -120 C 解冻 :50 C 水浴 10 s 结果 : 活率 :76.9 ± 1.01% IVF 后卵裂率 :80.2 ± 4.3% 囊胚发育率 :28.3 ± 3.8%

38 3. 泰国 :P Chanapiwat,2015 精液用 ModenaTM1:1 稀释后装入 50mL 离心管中,15 C 下 静置 120min,800g 离心 10min 用乳糖- 蛋黄液稀释至精子浓 度为 /ml,5 C 下静置 90min; 再用上液将精子浓度稀释 为 /ml, 用 0.5mL 细管分装 将细管置于液氮上方 3cm 处, 20min 后投入液氮 解冻 :50 C 水浴 12s, 后用 4 倍体积 ModenaTM 液在 37 C 下稀 释, 备用 结果 : 杜洛克 大白猪 长白猪 活率 : 50.0 ± 8.2% 49.0 ± 6.5% 48.0 ±10.4% 活力 : 40.0 ± 6.4% 42.2 ± 5.4% 36.7 ±7.9% 顶体完整率 : 52.2 ± 9.6% 60.3 ± 11.8% 51.6 ± 15.4%

39 4. 瑞典 :F.Saravia,2010 精液与乳糖 - 蛋黄液混合后在 1.5h 降到 5, 再与蛋黄 Equex STM 和甘油 ( 终浓度为 3%) 混合, 精子的终浓度为 /ml 然后在 5 下分装到扁平塑料袋中, 精子终浓度为 /ml 然后放在程序冷冻仪中, 以 3 /min 速率从 5 降到 -5, 植冰后以 50 /min 的速率从 5 降到 140, 投入液氮 解冻 : 将扁平塑料袋置于 35 水浴中 20s 结果 : 活力 : 69% 顶体完整率 : 70.6% 质膜完整率 : 56.1%

40 5. 瑞典 - Eriksson,2002 采用 5mL 平管冷冻猪精液, 解冻后输精获得了较为理想的效果 结果 : 活力 :49%~53% 质膜完整率 :60% 产仔率达 :73%(308/421) 平均窝产仔数 :10.7 头

41 6. B.A 美国 :. Didion,2013 精液稀释后, 放置于 17 生物培养箱中, 然后以 800g 离心 20min, 弃上清 添加冷冻稀释剂至精子浓度为 /ml, 经 2h 降温到 5, 加等体积的冷冻稀释剂, 用 0.5mL 细管分装 置于程序冷冻仪中从 1 /min 降到 -7,-7 保存 5min, 再以 29.6 /min 降至 -130, 在 -130 保存 20min 然后投入液氮 输精 : 输精量至少 个 /ml, 宫颈内输精 结果 : 妊娠率 :78.7% 产仔率 :81.1% 窝产仔数 :12.5

42 7. 德国 :K. Buranaamnuay,2011 精液稀释后于 15 C 下放置 2h, 于 50mL 离心管 800g 离心 10min, 用乳糖 - 蛋黄液稀释至 /ml, 经 90min 降温至 5 C 时, 用乳糖 - 蛋黄液稀释至 /ml 采用 0.25mL 细管分装后, 于程序冷冻仪以 -3 C/min 速率从 5 C 降温至 -7 C 植冰, 再以 -50 C/min 速率从 -7 C 降温至 -120 C, 然后以 -10 C/min 速率降温至 -140 C, 投入液氮 解冻 :38 C 水浴 30s, 用 38 C 的 5 倍体积的 Androhep plus TM 稀释, 备用 结果 : 活率 :32.4 ± 1.2% 活力 :19.1 ± 1.1% 质膜 / 顶体完整率 :54.9± 0.8%

43 8. 西班牙 :E. de Mercado,2008 精液在 50mL 离心管中降温至 17 C 用 FE-1 稀释至精子浓度为 /ml,90min 降温至 5 C, 用 FE-2 将精子稀释至终浓度为 /ml 采用 0.5mL 细管分装后进行冷冻 : 从 5~-5 C, 6 C/min; 5~ 80 C,40 C/min; 在 -80 C 静置 30s, 以 70 C /min 降温至 -150 C, 然后投入液氮 解冻 : 在 37 C 循环水中 20s, 移入 37 C 2 倍体积的 BTS 液中 150min 结果 : 活率 :50.2% 顶体完整率 :51.3% 质膜完整率 :49.5%

44 9. 西班牙 :Jorge D. Juarez,2011 精液用 FE 液稀释至 /ml, 以不同速率降温至 5 再用 FE-Glycerol-Orvus( 甘油终浓度 9%) 液稀释至 /ml, 用 0.5mL 细管分装 采用程序冷冻仪以 6 /min 的速率降温至 -5, 然后 40 /min 的速率降温至 -80, 再以 70 /min 速率降温到 -150, 投入液氮保存 解冻 : 在 37 水浴中 20s 结果 : 活力 :66.7±2.3%

45 四 存在的问题与分析 1. 种公猪站发展不规范, 种公猪良莠不齐, 冷冻精液无标准可循 ; 2. 猪的精子脂肪含量相对较高, 冷冻前脱水较困难, 冷冻后精子内部产生结晶 膨胀而致损伤 ; 3. 冷冻液的配制和渗透性抗冻保护剂的选择单调, 除了甘油外, 乙二醇和 DMSO 等化学毒性小 渗透性强 玻璃化形成较好抗冻剂有待开发 ; 4. 选择海藻糖 棉子糖 阿拉伯半乳聚糖 聚蔗糖 葡聚糖等大分子非渗透性抗冻保护剂, 提高胞外渗透压和抗损伤作用 ; 5. 优质遗传资源的保存技术研发投入力度不够

46 五 市场前景展望 1. 建立优秀 遗传资源银行 - 精子库 ; 2. 降低活体保种成本和风险 ; 3. 解除鲜精输精在时间和空间上的限制 ; 4. 加速优良品种覆盖率和品种改良效率 ; 5. 占领市场先机, 具有广阔的经济效益和社会效益 ; 6. 得冻精者得天下

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汇报提纲 猪精液的特性及精子结构 实验室精子质量检测方法 精子指标与受精能力的关系 精液体外保存及操作安全 人工授精新方法及操作安全 猪人工授精技术与操作安全 中国农业大学动物科技学院朱士恩 Tel: 010-62731979 Fax:010-62731767 E-mail: zhushien@cau.edu.cn 日期 :2011-05-11 汇报提纲 猪精液的特性及精子结构 实验室精子质量检测方法 精子指标与受精能力的关系 精液体外保存及操作安全 人工授精新方法及操作安全 猪精液的特性及精子结构 猪精液的特性 猪精子结构 猪精液的特性

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