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1 打造猪人工授精中国第一品牌 人工授精中提高繁殖效益关键因素探讨 --- 越丰生物科技

2 主要内容 猪人工授精的历史精液常温保存的优势影响繁殖效益关键因素选择长效稀释粉的优势长效稀释粉的处方设计思想

3 猪人工授精的历史及现状 该技术始于 20 世纪 30 年代, 已有 70 多年的历史 我国始于上世纪 50 年代, 未达到理想的推广程度 20 世纪 90 年代后, 得到迅速普及 目前该技术已成为猪配种繁殖的主要手段之一

4 人工授精技术分类 冷冻保存 (-79~-196 ) 低温保存 (0~5 ) 常温保存 (15~25 )

5 冷冻保存技术 冷冻保存可以持久的保持精子的活力, 适合良种引进的洲际运输和珍稀品种精子的保存, 对牛进行大规模精液冷冻保存和冻精人工授精, 其他家畜的精液冷冻技术尚未取得实质性进展, 特别是猪精液冷冻保存后精子存活率低 特点 :AI 妊娠率低, 窝产仔数过少, 世界上猪的 AI 总数中应用冷冻精液的比例不到 1 %, 研究方向

6 低温保存技术 优点 : 1. 方便储存 : 不需要 17 度冰箱等专业设备 2. 方便运输 : 可以直接冰袋制冷, 运输温差小 缺点 : 1. 活力难以保证 : 猪精子细胞质膜中胆固醇与磷脂比率显著低于其他哺乳动物, 快速降温使得猪精子质膜的磷脂发生相转变, 使膜的通透性增加, 导致精细胞内部的阳离子和酶外泄, 及膜控制酶活性和扩散能力的降低, 引起精子的获能 顶体反应及死亡, 使得精子的活率急剧下降 2. 保存剂成本较贵 : 要加入抗冻保护剂和抗氧剂等 3. 受胎率不稳定 : 原因多种多样 研制更为简易, 高效的猪精液低温保存稀释液配方及操作程序, 成为猪稀释液保存技术的研究热点

7 常温保存技术 常温保存是利用一定范围的酸性接近中 性且等渗环境, 通过离子强度和比例变化抑制精子的活动, 减少其能量消耗, 使精子保持可逆的静止状态而不丧失受精能力 特点 : 技术成熟, 活力保存良好, 受胎率稳定, 但是在精液远距离运输方面具有一定的局限, 在常温保存时, 猪精液稀释液配方尤为关键

8 影响繁殖效益的关键因素 1. 公猪因素 2. 采精及稀释环节 3. 保存环节 4. 输精环节 5. 受孕环节

9 Sperm/ejaculate, billion 影响繁殖效益关键因素 --- 公猪季节性射精数 Winter Summer A B C D Boar facility

10 影响繁殖效益关键因素 --- 公猪季节性不合格精子率 Winter Summer Ejaculates discarded, % A B C D Boar facility

11 Sperm/ejaculate, billion 影响繁殖效益关键因素 --- 光照时间和温度对精子产量的影响 15 C 35 C hrs 16 hrs Photoperiod, hrs

12 影响繁殖效益关键因素 --- 采精间隔对精子产量的影响 每一次采精的精子总数十亿 ( ) 次采精间的间隔 ( 天 ) 79 82

13 影响猪繁殖效率的关键因素 - 采精及稀释环节 注意采精及稀释过程中器械 : 一次性塑料袋 器械无菌消毒 : 支原体, 细菌, 霉菌 搅拌过程 : 保温, 防止冷热休克 封装过程 : 防止热封口接触精液, 灌装管道清洁, 硅胶管材质

14 温度应激对精子顶体酶活性影响

15 抑菌剂效果

16 精液稀释用水 水中悬浮物 = 水中挥发性悬浮物 + 水中固定性悬浮物 : 悬浮物包括粒径较大的颗粒物和粒径较小的颗粒物 后者的粒径比较小, 粒径在 0.001~0.1 微米之间, 这类颗粒也称为胶体颗粒 胶体颗粒在水中比较稳定, 会产生丁达尔现象, 不易产生沉淀 通常胶体颗粒表面都带有正电荷或负电荷, 是水产生浑浊的主要原因 溶解氧 (DO-Dissolved Oxygen); 精子呼吸

17 精液稀释用水的选择 双蒸水 : 含有微量铜离子等其他重金属 瓶装蒸馏水 :PET 瓶装, 溴酸盐超标的原因是水生产企业水处理系统的缺陷, 在生产加工中采用臭氧杀菌的工艺过程中产生溴酸盐 桶装纯净水 : 细菌含量超标 超纯水 : 较好, 设备较贵

18 精子密度检测 估测法 精子密度仪法 主观性强, 误差大 方便 时间短 重复性好 < 一个精子为 密 = 一个精子为 中 > 一个精子为 稀 原精液 200μL 3%NaCl 稀释 10 倍 血细胞计数法 最准确, 但速度慢 猪精子密度一般为 2~3 亿 /ml 生产上主要以精子密度仪法检测 计数板上放盖玻片滴上 1 滴稀释精液计数 5 个中方格精子将该数乘以 50 万 MTT 测定

19 精子畸形率检测 畸形率检查方法 相差显微镜直接观察 伊红或姬姆萨等染色后普通显微镜观察 取中层精液抹片 固定液固定 20min 染色后显微镜观查 Giemsa 染色 90min 水洗并风干 置 1000 倍油镜下 畸形率要求 观察精子 > 300 个 要求 : 一般要求不超过 18% 为宜 影响 : 畸形率过高会减少精液的受精能力 改善 : 增加精液的用量可以提高其受精效果

20 苯胺蓝一龙胆紫顶体染色法染色精子

21 膜的完整性与受精能力之间具有显著但可变的相关性 r = 0.05(Alm et al.,2001); r = 0.39~0.57(Januskauskas, 2001) 膜 活力与受精能力之间具有可变的相关性 r = 0.15~0.83 (Kjaestad et al.,1993; Januskauskas et al.,2003) 活力 受精能力 顶体 顶体与受精能力之间具有显著的 可变的相关性 r = (Withfield and Parkinson 1995;Januskauskas et al.,2000) 体外受精 (IVF) 与受精能力之间具有显著的相关性 r = (Zhang et al., 1997;Schneider et al.,1999) IVF HZA 精子与透明带的结合能力与受精能力之间具有显著的相关性 r = 0.50 (Zhang et al.,1998) 实验室评估与精子质量 受精之间的关系

22 精子质膜作用及分布 维持完整的细胞内环境 作用 受精过程中起到信号识别与传导作用 精子质膜 转运物质功能 覆盖于顶体外膜区上的质膜 分布 覆盖于精子头部非顶体区的质膜 覆盖于尾部的中段和主段部分的质膜

23 购买精液保存剂考虑的因素 每一头份的精子数量 : 每头母猪每次输精都保证输入的精液活率! 精液的保存时间 : 多数母猪输精时精液保存的天数? 所用精液保存最长的天数? 猪场环境及病原体生长的控制 保存剂的效能 : 维持精子的活率 分娩率和窝产仔数 采购成本 : 可接受程度 公司的特点 : 产品的通用性 公司经营的诚实和正直, 生产和经营的经验, 产品质量的稳定性 选择猪精液保存剂剂的原则 : 相同类型比质量, 相同质量比价格 的方法选择精液保存剂的类型 品牌和生产厂家

24 常温保存剂剂的研究指导思想 1. 猪精子的特性 2. 影响猪精子保存期限的各种因素 : 公猪 ph 渗透压 细菌 病原体 离子强度 冷热应激 光照度 水质

25 猪精子的特性 1.1 运动类型 : 直线运动 原地摆动 转圈运动, 活动能力越强精子消耗的能量越多, 存活时间就越短 1.2 向流性 : 在流动的液体中, 精子表现出向逆流方向活动, 并随液体流速运动加快 1.3 向异性 : 在精液或稀释液中有异物存在时, 精子有向异物边缘运动的趋向, 其头部聚集在异物而死亡 1.4 向化性 : 精子有趋向某些化学物质的特性

26 保存剂分类 短效 :1-3 天 中效 :5-7 天 长效 :7-10 天 超长效 :7-14 天 固体粉末制剂, 液体制剂 自配 : 成本低 方便 商品化保存剂 : 稳定, 适合不同品种 不同地区

27 猪常温长效稀释保存剂处方设计原理 能量提供剂 抗结剂 抗冷热应激剂 ph 稳定剂 稀释保存剂处方 支持电解质 病原体抑制剂 渗透压调节剂

28 1. 提供支持电解质, 提供合适的离子强度 离子浓度影响精子的代谢和运动, 一般阴离子对精子损害力大于阳离子 在哺乳动物精子中 K + 比 Na + 含量高, 而在精清中则相反 精清中少量的 K + 能促进精子的呼吸 糖酵解和运动 ; 低浓度的 K 离子被认为在维持细胞内 K 离子的生理水平中起着重要作用, 但高浓度的 K + 对精子代谢和运动有抑制作用 PO 4 3- 能抑制精子呼吸和运动,SO 4 2- 对精子的代谢没有影响 柠檬酸离子 Cl - ClO 3 3- Br - I - 等离子对精子有害

29 2. 抗冷热应激剂保持精子免受低高温影响 高温使精子的代谢和活力增强, 消耗能量加快, 促使精子在短时间内死亡 低温使精子冻伤, 减少受胎率, 尤其是反复低温高温交替对精子保存非常不利 通过抗冷热应激成分的加入, 降低精子对温度的变化敏感性, 可以提供极端温度条件下的应激性

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31 3. 病原体抑制剂 猪精液有潜在传播疾病的可能 : 1. 病原体 : 细菌 衣原体 病毒 : 布鲁氏杆菌 衣原体 细螺旋体 支原体 繁殖与呼吸综合征病毒 猪细小病毒等 2. 感染环节 : 生殖道感染, 采精环节污染, 输精环节感染 3. 应对方法 : 需要选择广谱抗菌 抗霉菌 抗病毒成分

32 4. 渗透压稳定剂 精子是特化的细胞与血细胞一样要求所处的环境应为等渗, 即渗透压为 300 毫渗摩尔浓度左右, 精子能忍受的渗透范围为正负 50% 一般说来低渗比高渗更加容易对精子造成损害 渗透压稳定剂不仅要在精液稀释的时候保持渗透压稳定, 而且要有足够的能力来维持缓冲的能量和物质代谢产生的渗透压变化

33 5. 提供适当的营养物质 营养剂中最大物质是提供能量的糖类 由于精子只能进行简单的分解代谢, 不能通过同化作用合成自身所需物质, 所以精子只能吸收利用单糖弥补能量消耗 一般在猪的精液中采用葡萄糖 果糖和蜂蜜, 包括 ATP, 甘露糖, 卵黄等等但是现在效果仍有争议

34 6. 提供缓冲环境保护精子免受极端 ph 影响 ph 值影响精子的代谢和活动力, 偏酸性的环境精子运动 代谢减弱但维持生命时间延长 ; 偏碱性的环境, 精子活动能力和代谢能力提高, 但精子存活时间显著缩短 实验检测表明 :PH 6.5~6.9 时的保存效果明显好于 PH 值为 6.0~6.4 与 5.5~5.9 的保存效果, 可见精液常温保存的最佳 PH 值为 6.5~6.9 通过复配 ph 缓冲盐形成多重缓冲体系可以减少精子代谢产生的 ph 产物, 保证精子相关酶的活性

35 长效保存剂与短效保存剂的对比 初始 ph 加入 0.01N HCL100ul 加入 0.01N HCL250ul 加入 0.01N HCL500ul 加入 0.01N HCL1000ul 5 长效 短效

36 商品化长效保存剂的优越性 --- 研发技术优势 影响精液质量的因素很多, 自制保存剂如果没有大量对比保存实验为基础, 很难筛选出保存效果好的配方 针对不同地区猪场的人员及设备环境及猪的品种进行优化条件 针对不同地区猪场水质条件进行优化 具有更高的活力保险冗余度 : 降低各种不可预见的风险如温度变化, 震动, 精液质量, 病原体问题 有售后服务, 能及时查找人工授精问题的原因

37 保存剂热稳定剂 当保存剂热稳定性不足时候容易在运输途中发生热降解其所含的 PH 稳定剂的降解产物会改变精密配比的缓冲体系的抗酸碱能力, 使得保存剂对于精子代谢产物的缓冲能力减弱, 影响精子顶体和生物膜的完整性, 抑菌物质的热降解会导致有毒有害物质的产生, 不仅丧失了应有的抑菌能力而且对于精子细胞产生较大的毒性, 容易导致受胎率的下降, 特殊添加热稳定剂, 能够稳定长效保存剂在经历 度运输条件下精液保存性能

38 三种保存剂对不同品种公猪精液保存效果对比 Viability, % 活率 精液保存时间 ( 天 ) BTS 配方 1 配方 2

39 三种保存剂对不同品种公猪精液保存效果对比 Viability, % 活率 精液保存时间 ( 天 ) BTS 配方 1 配方 2

40 商品化长效保存剂的优越性 生产环节 原料采购优势 : 就拿最必须的成分葡萄糖来说, 市场上可以买到的有食品级葡萄糖 工业级葡萄糖 注射级葡萄糖等, 化学药店有分析纯无水葡萄糖 一水合葡萄糖等, 但可能没有哪个保存剂生产厂家会提供这些详细而必须的说明给大众, 而不同品种的葡萄糖的渗透压及杂质含量相差较大 原料检测

41 商品化长效保存剂的优越性 储存优势 保存剂的各种成分都有一定的保存要求, 如葡萄糖, 柠檬酸等有很强的吸湿性, 且易发霉, 是细菌的良好培养基, 如果在贮存 配制过程中没有控制好湿度, 首先会造成保存剂中这种成分比例上的差错, 造成渗透压及 ph 变化, 其次是细菌滋生造成精液保存时间的减少 抗生素对温度和湿度都有严格要求

42 商品化长效保存剂的优越性 生产环节优势 配制环境要求 : 由于精子有向质性, 一旦保存剂内混有杂质, 会引起大量精子聚集到杂质周围而死亡 如果配制保存剂的场所不能做到无尘 无菌, 结果将是显而易见的, 而猪场自配基本无法达到无菌和无尘要求 十万级环境, 局部万级

43 ISO class number(n) ISO 无尘房等级 0.1um 0.2um 0.3um 0.5um 1um 5um Class Class Class Class Class Class Class Class Class

44 长效保存剂生产车间平面图

45 长效保存剂生产车间

46 长效保存剂生产车间

47 商品化长效保存剂的优越性 生产设备优势 生产设备优势 : 因保存剂成分的准确性对稀释液的 ph 渗透压有决定性作用, 因此需要比较精密的测量设备, 如精密分析天平, 精密包装机械等仪器, 增加了设备投入资金, 但是也保证了产品质量, 这是自配无法达到的 质量稳定, 批次间变化小, 便于人工授精中规范化操作和管理

48 商品化保存剂的质量指标 商品化的保存剂剂的主要成分含有供应精子的营养物, 维持 ph 值和渗透压的无机盐和有机酸, 抑制微生物繁殖与活动的抗菌素等 稀释剂中各种成分均达到分析纯级别 非水溶性物质不超过 10PPM 不含或不能检测出重金属离子 经保存后, 一个授精剂量中含有 60% 以上的活动精子,A 级和 B 级精子数之和达 亿个

49 商品化长效保存剂的优越性 ph 值稳定性 批次 长效保存剂 中效保存剂 短效保存剂 标准偏差

50 商品化长效保存剂的优越性 渗透压稳定性 批次渗透压数据 标准偏差 平均值 相对标准偏差

51 不同商品稀释剂 ph 值与渗透压测定结果 测定的 26 种稀释剂中 ph 最高的为 7.42, 最低的为 6.36, 其中 20 种稀释剂 ph 值在 6.50~ 7.20, 占全部稀释剂 74%; 11 种稀释剂 ph 值低于 7.00, 占全部稀释剂的 41% 渗透压最高的为 357.0mOsm, 最低的为 270.7mOsm, 其中 23 种稀释剂的渗透压值在 280.0~ mosm, 占全部稀释剂的 85%

52 不同商家的保存剂剂质量差异

53 不同商家的保存剂剂质量差异 精液保存时间为 3 d 时, 除 5 号 10 号和 15 号稀释剂保存的精液精子活力下降至 0.60 以下外, 其余稀释剂均在 0.60 以上, 其中 1 号 4 号和 9 号稀释剂精子活力仍维持在 0.80 以上 15 种稀释剂对精液保存时间在 1.25~ 7.52 d, 生存指数在 1.45~ 6.72

54 不同商家的保存剂剂质量差异

55 不同商家的保存剂剂质量差异 在 0 d 和 3 d 时, 15 种稀释剂保存精液的精子畸形率分别在 5.72% ~ 9.12% 和 7.35% %, 精子顶体完整率分别在 95.11% ~ 98.65% 和 90.37% ~ 98.18%, 基本合格

56 不同商家的保存剂剂质量差异 --- 微粒数目 个 /L 0.5um 1um 5um 样品 样品 样品 样品

57 打造猪人工授精中国第一品牌 杭州越丰生物科技有限公司冯海

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