复旦学报医学版年月 #$% $ ''#+''#+ +#5 ' % /% )00 "$ 1 1 )' ) + ' $ ** ')0$23 人类炎症性肠病 ''#+ 是一种肠道免疫系统异常反应所致的肠道炎症损伤性病变包括克罗恩氏病 $: 和溃疡性结肠炎 ## 其病因和发病机制尚未完全明确葡聚

Size: px

Start display at page:

Download "复旦学报医学版年月 #$% $ ''#+''#+ +#5 ' % /% )00 "$ 1 1 )' ) + ' $ ** ')0$23 人类炎症性肠病 ''#+ 是一种肠道免疫系统异常反应所致的肠道炎症损伤性病变包括克罗恩氏病 $: 和溃疡性结肠炎 ## 其病因和发病机制尚未完全明确葡聚"

向我妩伟
5 years ago
Views:

1 复旦学报医学版葡聚糖硫酸钠 &'' 诱导的小鼠肠炎模型中 & & & 细胞的表达及抑炎作用汪路曼钱静刘小明常丽君储以微复旦大学基础医学院免疫学系上海摘要目的探讨 $ 细胞在葡聚糖硫酸钠 1# # ' 诱导的小鼠肠炎模型中的表达及抑炎作用方法建立诱导的小鼠肠炎模型 $ 获取疾病不同阶段的脾淋巴细胞流式细胞仪检测 $ 细胞的比例变化体内转输该群细胞至疾病小鼠观察小鼠肠炎临床评分以及肠道局部炎性因子分泌的变化结果在小鼠肠炎的急性期第天 $ 细胞比例明显增多在肠炎消退期第天其比例恢复到正常水平转输疾病急性期第天的 $ 细胞可有效控制疾病的进展缓解病程 %). 检测提示转输急性期的该群细胞可显著抑制肠道局部促炎细胞因子,&,& 和 )& 的分泌结论诱导的小鼠肠炎中 $ 细胞比例随病程发生改变并可通过抑制肠道局部炎性细胞因子的分泌缓解病症关键词 $ 细胞肠炎炎性细胞因子小鼠中图分类号文献标志码.( & & & & ())* &'' ) **$"% +,*)* 2.,-)&' *.," ) &'" 0.,-)&( 0 9& *$ $#'!$! $($ ) ' $#'' $!"-". #"# #$$" ' $ # # 1# # ' ''#+ ' '$ ' '''#+ #! +# #' #! $ $ #' '"# #" ++ +#' #+ $!#+###$ &# # '#$ +'!#' # #$! # ''#+ +#5 # # ##)$!!# $ #$ #!$+#$ # # #$ +!$ +.!# # $ ' '#!$+ '5+$ # #$! #!''#+ +#5,&,& )& # # #$''# ) $!!# $ & ''#+ $" 5 #+#!$ $ # +$ #"#$ #''#+ +#5 # # 国家自然科学基金项目上海市科委重点项目 & ##$!"#$%&' +$ $'

2 复旦学报医学版年月 #$% $ ''#+''#+ +#5 ' % /% )00 "$ 1 1 )' ) + ' $ ** ')0$23 人类炎症性肠病 ''#+ 是一种肠道免疫系统异常反应所致的肠道炎症损伤性病变包括克罗恩氏病 $: 和溃疡性结肠炎 ## 其病因和发病机制尚未完全明确葡聚糖硫酸钠 1# # ' 诱导的小鼠肠道损伤是人类炎性肠病的实验性动物模型其病程可分为炎症加重期第天和炎症缓解期第天后主要症状为腹泻便血和体重减轻病理学表现为全结肠的炎性细胞浸润和糜烂作为机体中一类重要的免疫细胞细胞在免疫和炎症反应中行使着多种功能细胞不仅可以介导体液免疫和细胞免疫发挥正性免疫调节作用近年来的研究显示细胞中还存在着发挥负性调节作用的细胞亚群 $ 细胞是新近报道的一种发挥负性调节作用的细胞其免疫调节作用已在多种疾病模型中得到证实然而有关这类细胞在肠炎模型中的研究不多尤其在疾病过程中其数量比例以及功能的动态变化尚不清楚因此本文拟以诱导的小鼠肠炎为研究模型聚焦 $ 细胞通过流式检测其在疾病发展中的比例变化分析其在疾病进程中的抑炎作用为临床的研究和疾病的治疗提供新思路材料和方法实验动物及试剂周雌性小鼠只购于斯莱克公司 4 级环境饲养于复旦大学基础医学院动物实验中心相对分子质量为的购自美国 4 ' 公司脂多糖 )4 离子霉素 '+ 佛波酯 4. 均购自美国 "' 公司莫能星 ' 抗 5& 抗,&,& 和 )& %). 抗体均购自美国公司 4%& 抗和.1& 抗购自美国 " 公司肠炎模型的诱导以及疾病评价给予雌性小鼠含有 3 的饮用水天后改成正常饮用水根据文献报道及实验指标第天为肠炎急性期第天为肠炎消退期分别在第天和第天处死小鼠作为不同阶段的实验组未饮用 3 水的小鼠作为健康对照组每组至少只小鼠疾病临床评分 ##+ 1. 包括体质量下降的程度大便性状以及有无便血小鼠在不同时间点处死后取肠组织固定在 3 甲醛中用切片机将其切成 ' 厚度苏木精 & 伊红染色并进行病理学评分分正常分轻度炎症散在的单个核细胞浸润分中度炎症多发性病灶分重度炎症血管增生以及肠壁显著增厚分严重的炎症反应伴随透壁性炎性细胞浸润以及肠道杯状细胞脱落每只小鼠的肠道组织观察个视野取平均值作为该小鼠的病理学评分流式检测脾细胞中 & & & 细胞的表达不同时间点的小鼠断颈处死 3 酒精浸泡消毒后取小鼠脾脏研磨成单个细胞后重悬于 4 缓冲液中置于 ') 离心管并插于冰盒中 ' 离心 ' 弃上清加入红细胞裂解液裂解红细胞后 ' 离心 ' 弃上清加入 ') 4 细胞培养液重悬细胞计数取细胞于流式管中加入封闭细胞端的抗体抗 ;' 后加入抗抗抗抗体 ; 下避光反应 ' 洗涤次 ' 离心 ' 加入流式洗涤液 ) 重悬用流式细胞仪分析体内转输实验如前所述不同时间点的小鼠断颈处死脾细胞制成单细胞悬液用流式抗体抗抗抗抗体染色后用细胞分选仪分选出 $ 细胞将 ) 浓度的细胞通过尾静脉转输到诱导天的小鼠体内 4 组作为阴性对照观察小鼠的体重变化给予. 评分局部细胞因子的检测取转输了 $ 细胞的小鼠局部肠组织加入含蛋白酶抑制剂的 4 碾碎后离心 " ' 取上清用 %). 试剂盒检测肠局部,&,&

3 汪路曼等葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠炎模型中 $ 细胞的表达及抑炎作用和 )& 的表达统计学分析用统计软件 4' 分析两组间比较采用检验多组间比较采用 / & +.,/8. 检验为差异有统计学意义结果代表正常第天炎症急性期第天以及炎症恢复期第天小鼠脾细胞中的 $ 细胞的比例分别进行了分析结果显示在炎症急性期脾细胞中的 $ 细胞的比例明显增加图小鼠肠炎模型的疾病评估对经诱导的肠炎小鼠分别进行体质量临床评分. 以及病理学评分结果显示第天小鼠体质量减轻. 疾病指数升高病理学切片发现肠壁有大量炎症细胞浸润肠黏膜受损肠腺体杯状细胞减少放大倍数病理学评分增高表明天是小鼠肠炎的疾病加重期而天后小鼠体质量回升. 及病理学评分则逐步下降提示天以后为疾病的恢复期图. 肠炎病程中 & & & 细胞的改变我们首先检测了肠炎小鼠脾脏中细胞的变化发现与对照组相比处理组细胞比例增加图. 随后我们对于图 &'' 诱导的小鼠肠炎模型 4 &'' ) **$"%* 4.+ $" + "$###+ 1. 0# "+# ' # $# " "$# )0 # 图肠炎小鼠脾脏中 & & & 细胞的比例变化 0 0 0& & & &'' ) **$"%. $ "#' +)0 + +)0 + +)0 + & & & 细胞在炎症不同时期的功能差异为了探究 $ 细胞在炎症不同阶段的功能改变我们在诱导的小鼠肠炎模型中分选第和天小鼠脾细胞中 $ 细胞分别转输到诱导的急性期小鼠体内图. 结果发现只有转输了第天即炎症急性期的 $ 细胞能使小鼠急性肠炎症状得到减轻而转输了第天和第天的 $ 细胞小鼠肠炎症状无明显改善图提示在肠炎急性期 $ 细胞的抑炎功能增强 & & & 细胞对肠道炎性因子的

复旦学报医学版年月影响,&,& 和 )& 是小鼠肠炎模型中肠道重要的炎性因子为了验证 $ 细胞对于它们的作用我们分别检测了转输 4 对照组和炎症急性期 $ 细胞的小 $ 细胞可明显下调,&,& 和 )& 的分泌图提示下调局部炎性细胞因子的产生很有可能是 $ 细胞的免疫调节机制之一鼠肠道局部炎性因子的变化结果表明转输图 5 体内转输 & & & 细胞的抑炎作用 5 & & &

4 复旦学报医学版年月影响,&,& 和 )& 是小鼠肠炎模型中肠道重要的炎性因子为了验证 $ 细胞对于它们的作用我们分别检测了转输 4 对照组和炎症急性期 $ 细胞的小 $ 细胞可明显下调,&,& 和 )& 的分泌图提示下调局部炎性细胞因子的产生很有可能是 $ 细胞的免疫调节机制之一鼠肠道局部炎性因子的变化结果表明转输图 5 体内转输 & & & 细胞的抑炎作用 5 & & & )00$*0* &'' ) **$"%.! # ##$ $ & #+ "$#. '#!# # $ '# #"..!# #)0&# #. 4 图 & & & 细胞抑制肠道炎性因子的分泌 **$ $/& & & 0 讨论我们的研究表明 $ 细胞可能在小鼠肠炎模型中发挥着重要的保护性作用脾脏中 $ 细胞的比例与肠炎的严重程度正相关体内转输 $ 细胞可有效控制疾病的进展改善疾病的症状 $ 细胞的转输可明显降低肠道局部炎性细胞因子的分泌以上结果表明 $ 细胞可通过抑制肠道炎性细胞因子的分泌在小鼠肠炎模型中发挥着负性调节作用此外我们的研究还发现只有疾病急性期第天的 $ 细胞才具备有效的抑炎作用疾病的初始期第天及恢复期第天此类细胞的负性免疫调节功能不明显提示 $ 细胞的功能变化也与小鼠肠炎病情严重程度密切相关这与文献报道相吻合研究表明正常小鼠体内 $ 细胞不具备抑制作用只有处于炎症环境中 $ 细胞的免疫功能才能被激活从而起到缓解和调节疾病的作用本研究中处于健康状态的第天小鼠 $ 细胞处于静息状态因而不具备调节功能而在第天炎症处于急性期 $ 被激活产生了调节性作用转输实验表明外源性增加 $ 可以缓解疾病的症状但是其调节疾病的途径目前存在争议文献表明 )& 是 $ 调节疾病的主要方式然而越来越多的证据表明 $ 及其他类型的调节性细胞通过 )& 非依赖的方式协同其他调节性细胞缓解疾病此外在炎症环境中具体是什么因素促进了 $ 细胞的调节作用尚需进一步的研究证明本研究中处于第天缓解期的 $ 细胞同样

5 汪路曼等葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠炎模型中 $ 细胞的表达及抑炎作用不具有调节性作用可能是由于炎症环境减轻后 $ 细胞受到的刺激作用减弱调节作用不能持续这个发现有待进一步验证调节性细胞是一群以分泌 )& 为主要特点的免疫功能负调性细胞它参与调节多种自身免疫疾病并促进肿瘤转移在自身免疫性疾病小鼠模型中如类风湿关节炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎清除小鼠体内的细胞会加重病情降低自愈倾向在人外周血中 $ $ 和 $ $ 细胞亚群被证实具有很强的抑制功能而在小鼠体内调节性细胞 " 包含在几乎每一个细胞亚群中比如脾脏的过渡型细胞 & 64 边缘性细胞 6 腹腔淋巴结中的 & 型细胞等在小鼠脾脏中通常用 $ 表示调节性细胞本研究发现在炎症状态最为严重的急性期 $ 细胞的比例增多抑制效率增强而在炎症消退后其比例减少抑制功能也下降到了正常水平由此可见 $ 细胞与小鼠肠炎疾病进程有着强烈的正相关性可能起着与炎性免疫细胞相互制约的作用并为的自愈倾向打下了基础本研究证实抑制炎性因子的分泌可能是调节性细胞发挥体内免疫抑制作用的方式之一深入研究其调节机制将为自身免疫病的治疗提供新的契机参考文献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收稿日期编辑张秀峰

复旦学报 医学版 年 月 #$% $ ''#+''#+ +#5 ' % /% )00 "$ 1 1 )' ) + ' $ ** ')0$23 人类炎症性肠病 ''#+ 是一种肠道免疫系统异常反应所致的肠道炎症损伤性病变 包括克罗恩氏病 $: 和溃疡性结肠炎 ## 其病 因和发病机制尚未完全明确 葡聚

复旦学报医学版年月 #$% $ ''#+''#+ +#5 ' % /% )00 "$ 1 1 )' ) + ' $ ** ')0$23 人类炎症性肠病 ''#+ 是一种肠道免疫系统异常反应所致的肠道炎症损伤性病变包括克罗恩氏病 $: 和溃疡性结肠炎 ## 其病因和发病机制尚未完全明确葡聚