张 伟 等 小鼠的治疗效果及对脾脏 % % 细胞平衡的影响 7 ' $ $ 8$ %' #$ $ $# ' $ $$$,,,, $ #$ $ $4 7!,, 4,, %$$$$$ ' $ $ 8' $ %' J /$%#8 %#$ '#$ #' %' $$ 8$ %'

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1 =;(,=&/>9;9-(9%:,%9-#8 脂肪间充质干细胞对 7& 小鼠的治疗效果及对脾脏. % 细胞平衡的影响 张 伟 庞春艳 王永福 论著 包头医学院第一附属医院中心实验室 包头医学院风湿免疫研究所 内蒙古自治区自体免疫学重点实验室 内蒙古包头 摘 要 目的 探讨移植脂肪间充质干细胞 '! #8 小鼠脾脏 % % 细胞平衡的影响 方法 只 小鼠采用随机数字表法分为 8 治疗组 8 组 对照组 $# 组 和环磷酰胺治疗组 #''% 组 每组 只 8 组经尾静脉注射 8 每次注射的细胞数为, 每周 次 共注射 4 次 $# 组经尾静脉注射等体积磷酸盐缓冲液 每周 次 共注射 4 次 % 组经尾静脉注射环磷酰胺 剂量为 7 体重 每周 次 连用 次 休息 周后重复 共注射 次 留取治疗前和治疗后尿液检测 尿蛋白浓度 治疗 4 周后 小鼠 以流式细胞仪分析脾细胞 % % 细胞比例变化 结果 尿蛋白浓度变化 治疗前 组小鼠的 尿蛋白浓度差异无统计学意义 J 治疗 周后 8 组和 % 组 尿蛋白浓度显著低于 $# 组 差异有统计学意义,,,, 而且治疗时间越长 效果越明显 治疗 4 周后 8 组和 % 组 尿蛋白浓度显著低于 $# 组,,4,,8 组和 % 组之间 尿蛋白浓度差异无统计学意义 J 脾脏 % 细胞占 8 % 细胞的百分率 8 组和 % 组脾淋巴细胞中 % 细胞占 8 % 细胞的百分率高于 $# 组 组分别为 D 4DD DD D 但组间差异无统计学意义 J 脾脏 % 细胞占 8 % 细胞的百分率 8 组和 % 组脾淋巴细胞中 % 细胞占 8 % 细胞的百分率显著低于 $# 组 组分别为 D GDD DD D 差异有统计学意义 结论 移植 8 小鼠尿蛋白浓度 治疗时间越长 效果越显著 8 小鼠脾脏 % 细胞水平 提高 % 细胞水平 负向调节 % % 细胞平衡 进而发挥抗炎和免疫调节的作用 关键词 脂肪组织 间质干细胞移植 红斑狼疮 系统性 疾病模型 动物 小鼠 中图分类号 ( 文献标志码 文章编号 6$ '&#$ 7&!. % /$$ $ ''!($ /#$$ ''! # 8 $ $ #$% % &$ $#! $ '$ $ $ # $#$8 ' $#' $ #''% ' $ '8' $ $ #' $6 8'' #$ /! #!$ '! # $7 #%' $6 % 7 $7 7 $ $ ' 7 # % ' $ $ $# $ 4 7% #$ %#$ '#$<$ ## % ' $ $ ' $$$$$J ' 基金项目 内蒙古自治区重大基础研究开放课题 内蒙古自治区高等学校科学研究项目 内蒙古卫生厅和计划生育委员会医疗卫生科研计划项目 资助 '' >&$$#( /69$$@$# #$( /6 # ( /6# $ &#/#$$$$ 9$$@$# '$$# 4# 网络出版时间 网络出版地址 ' $7$7#(#

2 张 伟 等 小鼠的治疗效果及对脾脏 % % 细胞平衡的影响 7 ' $ $ 8$ %' #$ $ $# ' $ $$$,,,, $ #$ $ $4 7!,, 4,, %$$$$$ ' $ $ 8' $ %' J /$%#8 %#$ '#$ #' %' $$ 8$ %' $ $ $#'%#!#D G4D D D D D '!# $$$$ J /$% #8 %#$ '#$ #' %'$$ 8$ %'$$## $ $ $#'%#!#D GD D D D D '!# #$$ # %$'#$$ 8$ ' $ %' #$ $ $$%$'#$$ 8$ '#%# $ $#% #8!# #$#$% $8'# #$$#$ $ #$ #$%$ % 8# 系统性红斑狼疮 #', 是一种表现为多脏器损害的慢性系统性自身免疫性疾病 以大量自身抗体产生 补体激活及免疫复合物沉积为主要特点 研究发现 在, 患者中存在 % 细胞的受损 % 细胞和 % 细胞之间的平 衡被破坏的现象? 目前 多数, 患者使用非特异性的免疫抑制药物以及糖皮质激素治疗 但这些治疗方法效果仍不理想且有许多副作用 近些年 采用异基因间充质干细胞 $# #@ 移植治疗难治性, 患者取得了较好 的疗效 且具有安全 费用低的优点? 脂肪间充质干细胞 '! #8 具有分化为多种细胞和免疫调节的能力 ( 等的研究发现 8 比骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞具有更强的抑制 % 细胞活化的能力 因此 本研究将 8 小鼠体内 初步探讨移植 8 小鼠尿蛋白浓度以及脾脏 % % 细胞平衡的影响 材料与方法.. 实验动物分组 /& 自发系统性红斑狼疮样模型小鼠 只 雌性 4 周龄 购自南京大学模式动物研究所 适应性饲养 周后用于实验 小鼠采用随机数字表法分为 组 8 治疗组 8 组 对照组 $# 组 和环磷酰胺治疗组 #' '% 组 每组 只 由专人饲养. 主要试剂 8@@& 培养基和胎牛血清购自 公司 总蛋白定量测试盒 考马斯亮蓝法 购自生工生 物工程 上海 股份有限公司 8/ 8 &9% 8&9% 8/ % %/$'$> 购自 8 公司.8 的分离培养与鉴定取 只 周龄, 小鼠 以 D 体积分数 水合氯醛,7 体重腹腔麻醉 无菌条件下剪取腹股沟部皮下脂肪约 磷酸盐缓冲液 '' #$/ 冲洗 次以去除肉眼可见的小血管和血细胞 剪碎至 加入 倍体积的 D 质量分数 型胶原酶 于 E 温箱中振荡 $ 加入等体积的含 D 体积分数 胎牛血清的 8@@& 培养基 用吸管吹打数次 $ 离心 $ 弃上清液 再用含 D 胎牛血清的 8@@& 重悬细胞 目细胞筛过滤 四格计数板计数后以 的密度接种于, 培养瓶中 放置于 ED 体积分数 = 的孵箱内培养 后首次换液 之后每 天换液 次 光学倒置显微镜下观察细胞生长状况 待细胞融合至瓶底 4D 以上时利用 D 质量分数 胰蛋白酶消化 以体积比 F 进行传代 收集第 代的 8 利用 8&# 流式细胞仪分别检测其表面抗原 888 和 8. 各组动物给药方式检测尿蛋白浓度, 小鼠发生自身免疫性疾病 8 组经尾静脉注射 8 每次注射的细胞数为, 每周 次 $# 组尾静脉注射等体积 / % 组经尾静脉注射 % 剂量为 7 体重 每周 次 连用 次 休息 周后重复.@(,#' 小鼠尿蛋白浓度测定分别于治疗第 4 小鼠放

3 =;(,=&/>9;9-(9%:,%9-#8 入代谢笼内 用, 离心管收集小鼠 尿液 置于?4 E 冰箱中保存 以考马斯亮蓝法集中检测尿蛋白浓度.@(,#' 小鼠脾脏 % % 细胞的流式检测治疗 4 周后处死小鼠 无菌摘取脾脏 在 #, 的无菌尼龙网将脾脏剪碎 研磨 收集到的脾细胞经红细胞裂解液裂解红细胞 以 孔培养于 孔板中 并加入, 的 /@, 的离子霉素 $$ 以及莫能菌素 $$$ 置于 ED = 培养箱中培养 收集细胞 加入抗 8// 进行细胞表面染色 温育 $ 加, 固定液 <$ 温育 $ 固定 洗涤 弃上清液 加入, 破膜剂 '#B $ 破膜 洗涤后加入抗小鼠 9,/ 和抗小鼠 &<'/ 单抗作胞内染色 洗涤后上机检测. 数据处理用 / 统计软件进行分析 数据以均 数 标准差表示 多个组间均数的比较采用,8 统计学方法分析 为差异有统计学意义 / 结果. 尿蛋白浓度治疗前 组小鼠的 尿蛋白浓度差异无统计学意义 J 治疗 周后 8 组和 % 组 尿蛋白浓度低于 $# 组 差异有统计学意义 8 组和 % 组之间 尿蛋白浓度差异无统计学意义 治疗时间越长 尿蛋白浓度下降越明显 具体结果见表 小鼠脾脏淋巴细胞中 % 细胞 % 细胞比例的变化流式细胞检测结果显示 与 $# 组相比 8 组和 % 组脾淋巴细胞中 % 细胞的比例稍高 % 细胞的比例较低 结果见图 8 '! # % #'' 图 各组小鼠脾脏淋巴细胞 % 细胞流式检测图 %#%#$ '#$ ' 8 '! # % #'' 脾脏 % 细胞占 8 % 细胞的百分率 8 组和 % 组小鼠脾淋巴细胞中 % 细 图 / 各组小鼠脾脏淋巴细胞 % 细胞流式检测图 %#/% #$ '#$ ' 胞占 8 % 细胞的百分率高于 $# 组 分别为 D 4D D D D

4 CPP 张伟等脂肪间充质干细胞对 9小鼠的治疗效果及对脾脏 7=!P ( 7 4细胞平衡的影响!$ #&h但组间差异无统计学意义!,t%$ %图 &# $ 组分 胞占 HV' j7细胞的百分率显著低于 H$ J脾脏 7=!P 细胞占 HV' j7细胞的百分率 别为!$'&h N%$#%h%!$O&h N%$Oh%O$&Ph N!$ O'h差异有统计学意义!,Q%$ %!图 '# $ KV[H组和 H7S组小鼠脾淋巴细胞中 7=!P 细 表 FG各组小鼠尿蛋白浓度的变化 < 'FGH=/ 64., 6/ 9 6 Y 6/ 9 6 (! 4( D# E #N? % <U H 4 #O N%$ RR ' <U O <U P$!% N!$ O& R$ R' N#$ #'!%$ &O N!$ O' s #$ #' N%$ P& s %# N#$ %C &$ R% N!$ ' s KV[H4 O# N!$ O %# N!$ O! H7S4 R# N!$ '' '$ C% N%$ P! '$ '# N!$ P R <U,Q%$ % s,q%$ %! ;9/ : < = =- 4 $KV[H / : 9 -,-: : ; & H7S 9= ; 研究发现间充质干细胞可以通过抑制多种免疫相 关细胞介导的免疫应答反应进行免疫调节另外其 可抑制 ]细胞向浆细胞分化减少免疫球蛋白的生 成理论上间充质干细胞的这种免疫调节作用可以 很好地应用于自身免疫性疾病的治疗$ 有研究表明 间充质干细胞有望成为新的类风湿关节炎的免疫治 疗方法 R $ 有研究使用异基因间充质干细胞移植 治疗病情较重以及常规治疗不起作用的系统性红斑 狼疮患者经过 ' 年的研究发现在治疗过程中未发 KV[H / : 9 -,-: : ; & H7S 9= ; j 图 IG各组小鼠脾脏淋巴细胞 7 4细胞占 HV' 7细胞的百分率 % 7/ 'IGG / HV' j7 =- 9 6 ;9= 生移植相 关 的 不 良 反 应 患 者 的 临 床 症 状 得 到 缓 解 C $ 越来越多的证据表明间充质干细胞是人类 自身免疫性疾病细胞治疗的理想细胞选择!% c!! $ d@d( 9狼疮小鼠作为 [D>的常用动物模型之 一其症状与人类系统性红斑狼疮相似d@D( 9小 鼠存在调亡缺陷8/ 基因的突变导致自身反应性 淋巴细胞增生循环免疫复合物的产生增多导致细 胞浸润%蛋白尿和进行性肾损害$ 免疫复合物的沉 积最早出现在 d@d( 9小鼠 # 月龄时肾损害为亚 急性增生性肾小球肾炎轻%中度蛋白尿%h死亡 9狼疮鼠作为 率发生于第 个月$ 本研究以 d@d( 研究对象治疗起始时间选在 d@d( 9小鼠#$ 月 月龄时$ 龄时治疗截止时间选在 '$ s,q%$ %! ;9/ : < = =- 4 $KV[H / : 9 -,-:B : ; & H7S 9= ; 图 JG各组小鼠脾脏淋巴细胞 7=!P 细胞占 HV' j7细胞的百分率 % 7/ 'JGG / 4 -.7=!P 6 HV' j7 =- 9 6 ;9= 目前的研究表明活动性 [D>中 7=!P ( 7 4细 胞免 疫 平 衡 被 打 破 表 现 为 7=!P 细 胞 数 目 增 多 7 4细胞数目减少且缺乏正常免疫活性$ 通过各种 治疗手段使其 7=!P 细胞下降7 4细胞上调可以 缓解病情$ 环磷酰胺是治疗 [D>的有效药物之一 IG讨论 小剂量环磷酰胺治疗 [D>疗效确切!# $ 本研究采用经 尾 静 脉 移 植 KV[H治 疗 d@d( 间充质干细胞是干细胞家族的重要成员来源 于发育早期的中胚层和外胚层$ 间充质干细胞移植 9狼疮鼠以环磷酰胺作为治疗对照组$ 初步探讨 在治疗血液系统疾病%心血管疾病%肝硬化%神经系 移植 KV[H对 d@d( 9狼疮鼠的治疗效果及机制$ 统疾病和自身免疫性疾病等方面取得了重大突破$ 本研究结果显示 组狼疮鼠尿蛋白浓度明显

5 4 =;(,=&/>9;9-(9%:,%9-#8 高于治疗组 同时 脾脏 % 细胞显著高于治疗组 % 细胞低于治疗组 狼疮鼠脾脏细胞中存在 % % 细胞免疫失衡 且与肾脏受累关系密切 同时观察到移植 8 能够减少, 模型小鼠尿蛋白浓度 且治疗时间越长 效果越显著 8 的治疗效果与环磷酰胺的疗效相近 8 能够明显降低狼疮鼠脾脏 % 细胞水平 提高 % 细胞水平 使 % % 细胞比值降低 提示 8 能够负向调节狼疮小鼠 % % 细胞平衡 进而发挥抗炎和免疫调节的作用 机体的免疫系统是一个相互联系 相互影响错综复杂的大网络 并非几个细胞因子 几条信号途径就可以说明 就现阶段我们的实验结果可见 8 狼疮鼠脾脏 % 细胞 减少 % 细胞过度活化来减轻自身免疫反应 狼疮鼠的肾损害 从而改善病情 此外 间充质干细胞不仅具有免疫调节的能力 还具有在组织损伤时迁移至损伤部位 修复受损组织的功能 狼疮鼠肾脏进行组织病理检测 观察 8 狼疮鼠肾脏的修复情况 研究移植 8 狼疮鼠自身抗体 炎性细胞因子以及生存率的影响 参考文献 #$$ #$ $= ##$$ # %$ % #$ #' # $ $#$ 8!9$# '$ >- % #%#' $, (!(#? $, $ $, $ % #$ $ #' ='$ (# 4? $,: 7> $: #@$# # $'#$$!#$ $$ $ #' $ $#?,$ $: ##$$# #$'#$$ $ #' '##$#$$ (8 4? #@$# ### < '$ $ <$'#'' ''## $ # 7# $ %##(%? > $ $ = #%$'#$$ $ $ $###$' #@9$# 4? 4, (, #%''$#$ ## $##$ $ (%? $8 $ $, ##$$# #$'#$$ $!$ #' <'$ #%$'#$? /77$!$ #9$#$! '##$## '($? $B#B@ $B#B( (, #%$<' $# $$$#$ $ '! $# # (? 6$!, 6$! ( > - # ' #'! # '$#!#''$ ' $#$'#,'? 收稿 本文编辑 任英慧

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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36 CHINESE NURSING RESEARCH January,2016Vol.30No.1A ; 273 ( ) , 1.2 [2-10] [3-7] :1 PubMed Medline 3 38

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