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1 复旦学报 医学版 2) / 对 小鼠保护性作用的免疫学研究 张 鸽 常美佳 黄嘉楠 周 建 宋元林 白春学 洪群英 复旦大学附属中山医院呼吸科 上海 摘要 目的 研究角质细胞生长因子 $ % $) $ 94 对慢性阻塞性肺病 $ $ ( -$ ( ( +! 0 模型小鼠肺部炎症及免疫功能的影响 方法 取 只 周龄 体重 % 的雄性 小鼠 首先用烟熏加气道滴注脂多糖 $ $ ( 2 的方法构建 +! 0 模型 94 组于第 天和第 天给予 94 共 次 采用肺组织, 染色及肺泡灌洗液 $$$ % 3 2 蛋白浓度评价小鼠气道炎症及肺泡壁屏障的破坏,2 检测小鼠血浆及 3 2 中 2 和肿瘤坏死因子 -$$(( $ 5 的水平 流式细胞术检测小鼠脾脏中 +0 5 细胞及 +0 5 细胞的比例及细胞程序性死亡蛋白 $% -- $ 0 的表达 结果 与 +! 0 组小鼠比较 94 组小鼠肺部炎症细胞浸润减少 肺泡结构相对完整 肺泡灌洗液及血浆中 2 和 5 水平有降低的趋势 与 +! 0 组比较 94 组小鼠脾脏中 +0 5 细胞及 +0 5 细胞的比例升高 0 比例降低 结论 94 可能具有抑制 +! 0 相关肺组织炎症及增强免疫功能的作用 关键词 角质细胞生长因子 慢性阻塞性肺病 慢性炎症 免疫 小鼠 中图分类号 文献标识码. (( $$!""! 2) / $ !! ! 4 % % " -! % " % 5$( $ $ % $) $ 94$% -- $-$( -$$$ $ ( -$ ( ( +! )$- $ $$ +! 0+! 0)94- % $ ( 5+! 0% $ ()$($ %(-$ $ $ ( 2( $ 94)(( $ $ 94% $5 )-- $$ -% ), ( % $$$ % 3 2$ $ $( 5 (($$2 5 (-3 2 ),2 5% $ +0 5 (+0 5 ((($$ $% -- $ 0($ -)$) $-!" +$- ) +! 0 - $$ -- $ (%(($2-$$(( $ 5 $ % (-) ( % ( 94% $ ) $- 国家自然科学基金面上项目 高等学校博士学科点专项科研基金 国家重点基础研究发展计划 6+ +$ ( $%$,- $%$ - $-

2 张 鸽 等 94 对 +! 0 小鼠保护性作用的免疫学研究 $( +0 5 (+0 5 ( ( ( 0$ ( $- ) +! 0- "!94 ($% +! 0-- $ %--$ $ % $) $ $ $ ( -$ ( ($ -- $--/ $-! 2 "$ "! "()! / +4 -.,,++6//+ )! " " "/-+,--6++/--5, " "$"/-+5 ) +, 慢性阻塞性肺病 $ $ ( -$ ( ( +! 0 是呼吸系统的常见疾病 严重危害人类健康 以气道不完全可逆性气流受限为特征 +! 0 主要累及肺 也可以引起全身炎症及免疫环境的紊乱 具体机制尚未阐明 +! 0 可能是一种由烟草烟雾诱发 5 细胞参与的炎症反 应及自身免疫疾病 角质细胞生长因子 $ % $) $ 94 也被称为 4 是含有 个氨基酸残基的多肽 隶属于 4 家族 结构与 94 相似 能够高亲和力结合 4 受体 4 受体广泛分布于各种上皮细 胞 94 可由间质细胞分泌 能有效促进各种上皮细胞的增殖 迁移和分化 并直接作用于上皮细胞 促进伤口边缘细胞再生和修复 或间接刺激其他细胞因子的分泌 促进肉芽组织形成并减少瘢痕的产生 对脂多糖 $ $ ( 2 引起的急 性肺损伤有较强的保护性作用 本文拟通过建立 +! 0 小鼠模型 观察 94 对 +! 0 小鼠肺部及全身炎症和免疫环境的影响 以探讨 94 对于 +! 0 保护性作用的机制 材料和方法 实验动物及分组 只雄性 级健康 小鼠 周龄 体重 % 购于上海斯莱克实验动物有限责任公司 复旦大学附属中山医院中心实验室按标准颗粒饲料喂养 自动取食饮水 将 只小鼠随机分为 组 正常对照组 对照组 +! 0 模型组 +! 0 组 及 94 治疗组 94 组 每组 只 主要药物和试剂 94 上海新生源公司 市售大前门牌香烟 焦油量 -% 气烟碱量 -%3+ 试剂盒 碧云天公司 小鼠 2 肿瘤坏 死因子 -$$(( $ 5,2 试剂盒 美国 3$( 公司 戊巴比妥钠 德国默克公司 流式荧光抗体 美国 30 公司 主要仪器 烟雾发生器 美国 0( $ 公司 低温高速离心机 型号 德国, $ 公司 流式细胞检测仪 美国 30 公司 有机玻璃毒染箱 --- 由复旦大学附属中山医院呼吸科自制 动物模型复制 利用烟熏加 2 气道内滴注的方法建立小鼠 +! 0 模型 正常对照组自由饮水和摄食 不做任何处理 +! 0 组小鼠置于有机玻璃毒染箱 --- 内进行被动吸烟 每天 次 每次 支 每次持续 - 次间隔至少 连续 天 并在第 天和第 天气管内滴入 22-2% 滴注 2 当天暂停吸烟 次 给药方法 在烟熏第 天及第 天 对照组气管内滴注生理盐水 2 各 次 +! 0 组在烟熏第 天及第 天 气管内滴注 2%2 次 94 组在烟熏第 天及第 天 气管内滴注 2 -%% 及 94 -%% 共 次 2 次 取材 腹腔注射 戊巴比妥钠 -%% 进行麻醉 眼球取血 于 : 下 离心 - 分离血清于 : 保存 取血后开胸 气管插管并固定 使用 -2 注射器以无菌 3 行右肺肺泡灌洗 回收率 肺泡灌洗液 $$$ % 3 2 于 : 下 离心 - 取上清于 : 保存 留取左肺 未灌洗过的肺组织 放入中性 甲醛溶液 固定 后常规石蜡包埋 切片 肺组织, 染色 用于显微镜下观察肺内支气管损伤以及支气管 肺组织炎症细胞浸润情况

3 复旦学报!医学版"!!"$ 年 ( 月 %! "! " 其余肺组织于,$" X 保存 留取 脾脏研磨过 滤后 独立样本+ 检验 " 为差异有统计学意义 得到单细胞悬液于,$" X 保存 结!!! 果 指标检测! 运用 QC2 法 测定 Q2P! 中 蛋 白 质 浓度全 自 动 酶 标 仪 在 +!%E 处 检 测 各 孔 的 吸 光 度值! 5"运 用 DPL,2 方 法 测 定 血 清 和 Q2P! 中 LP + 和 SO! ( 的 水 平严 格 按 照 试 剂 盒 说 明 书 操 作全 自 动 酶 标 仪 在 %"%E 处 检 测 各 孔 的 吸 光 度! 5"值运 用 流 式 细 胞 术 测 定 脾 脏 中 CH%/S 细 胞 CH$/ S 细 胞 及 KH/ S 细 胞 的 比 例运 用!> 6AF 6U( 软件进行分析 统计学方法! 用 R; $.?K$ 软件进行统计学分, 表示两组计量资料比较采用 小鼠肺组织 XQ 染色! 对照组 可见 支气管和肺 泡结构清晰黏膜 无 明 显 破 坏 及 炎 症 细 胞 浸 润 的 表 现% C3KH 组小鼠肺 结 构 杂 乱破 坏 较 明 显肺 泡 壁 断裂支气管黏膜上皮细胞变形坏死纤毛不齐变 短倒伏甚至脱落管 壁 增 厚周 围 有 大 量 炎 症 细 胞 浸润管 腔 狭 窄 或 扭 曲 扩 张%与 C3KH 组 比 较! 治疗组肺泡结构 破 坏 减 轻炎 症 细 胞 浸 润 减 少!图 " 图 C! 各组小鼠肺组织 XQ 染色 A, ) )( )4 3)( 3 "! ) -6 + ( "35 (C!XQ!! 小 鼠 J7ZA 中 蛋 白 质 浓 度! 与 对 照 组 比 较 C3KH 组和! 组 Q2P! 中 蛋 白 质 浓 度 明 显 升 高! ""但是! 组与 C3KH 组差异 无统 计学意义!图!表 " 对 照 组 比 较C3KH 组 Q2P! 和 血 浆 中 LP +和 SO! ""%与 ( 显著升高差异有统计学意义! C3KH 组比 较! 组 Q2P! 和 血 浆 中 LP +和 SO! ( 稍有下降差异无统计学意义!图 表 " 小鼠脾脏 <IR!$ 细胞和 <IB!$ 细胞的比例 与对照组比较 C3KH 组 小 鼠 脾 脏 CH%/ 细 胞 比 例 明显减少差异有统计学 意 义! ""%与 C3KH 组比较! 组小鼠脾脏 CH%/S 细 胞 比 例 明 显 上升差异 有 统 计 学 意 义!! $"/ "" 与 对 照 组 比 较 C3KH 组小鼠脾脏 CH$/S 细胞比例明显减少 差异有 统 计 学 意 义!! $"/ ""%与 C3KH 组 比 较! 组小鼠脾脏 CH$/S 细 胞 比 例 稍 有 上 升差 图 G! 各组小鼠 J7ZA 中蛋白浓度的比较 A " )+ ")+ ), ") )J7ZA"! ) -6 + ( "35 (G!K M S 和 $?A M! 水 平! 与!! 小鼠 J7ZA 及血浆中 LZ 异无统计学 意 义 与 对 照 组 比 较 C3KH 组 小 鼠 脾 脏 CH%/SCH$/S 明 显 升 高差 异 有 统 计 学 意 义! ""%与 C3KH 组 比 较! 组 CH%/S CH$/S 未见明显改变!图 %"

4 张 鸽 等 94 对 +! 0 小鼠保护性作用的免疫学研究 图, 各组小鼠 % ) 和血浆中 5 和 ) 水平 ), 5) "" % ) " $$! 图 4 各组小鼠脾脏中 细胞的分布情况 )4! "" $! 小鼠脾脏细胞 + 的表达 与对照组比较 +! 0 组小鼠脾脏 +0 5 细胞中 0 的表达比例明显升高 差异有统计学意义 与 +! 0 组比较 94 组小鼠脾脏 +0 5 细胞中 0 的表达比例明显下降 差异有统计学意义 与 +! 0 组比较 94 组小鼠脾脏 +0 5 细胞中 0 的表达比例明显升高 差异有统计学意义 图

5 复旦学报 医学版 年 月 讨 论 94 对 2 引起的急性肺损伤有较强的保护性作用 在急性肺损伤模型中 我们分别验证了 94 在 及 -%% 时的保护性作用 结果显示在 -%% 时保护性作用最强 基于之前 的结果 本次实验采用 -%% 气管插管 共给药 次 分别在第 天和第 天 的实验方法 94 可有效促进各种上皮细胞的增殖 迁移和分化 并直接作用于上皮细胞 促进伤口边缘细胞再生和修复 或间接刺激其他细胞因子的分泌 促进 肉芽组织形成并减少瘢痕的产生 此外 94 可以通过减少炎症因子的释放 从而减少 5 细胞的 过度增殖 经 94 治疗的小鼠 +0 5 细胞及 +0 5 细胞的比例明显高于 +! 0 组小鼠 0 表达阳性的 5 细胞比例降低 此结果说明 94 可以减轻 5 细胞介导的炎症反应 提高免疫功能 +! 0 的主要特征是肺部及全身的慢性炎症及免疫失调 巨噬细胞 5 淋巴细胞和嗜中性粒细胞在 肺部浸润增加 活化的炎症细胞释放各种炎 症介质 包括 2 和 5 等 2 作为一种多效应的细胞因子可由多种细胞产生 它能抑制巨 噬细胞释放 5 减轻炎症反应 5 是导致 +! 0 慢性炎症损伤和肺实质毁损的重要细胞因子 吸烟可导致支气管上皮细胞受损 组织或肺泡巨噬细胞和上皮细胞分泌 5 促进炎症 因子的趋化和活化 导致气道结构破坏 5 还能诱导支气管上皮细胞 受体表达 后者能 够上调细胞 02 的表达 5 可诱导气道黏液细胞化生和分泌增多 导致小鼠肺气肿性损害 和肺泡壁胶原沉积 本研究发现在 +! 0 模型小鼠的 3 2 和血浆中 2 和 5 的含量明显升高 经 94 治疗后的 +! 0 小鼠 2 和 5 水平较 +! 0 组小鼠有所下降 由此说明 94 对 +! 0 小鼠的肺部及全身炎症有一定的改善作用 近年来研究发现 香烟等有害气体刺激机体启动固有免疫 固有免疫破坏肺组织 裂解出来的弹力蛋白片段成为抗原 又启动了 5 细胞介导的获得性 免疫 0 是表达在效应 5 细胞表面的一个负向调控共刺激分子 在持续的炎症性免疫应答中 表达会上调 通过与配体 02 和 02 相互作用 抑制外周组织中持续免疫反应 并阻止自身组织 受到免疫损伤 吸烟的 +! 0 患者肺内存在寡克隆 +0 5 细胞聚集 +! 0 可能是一种由烟草烟雾诱发 5 细胞参与的炎症反应及自身免疫疾病 +! 0 患者常常存在气道及全身炎症及免疫失调 导致容易发生感染及急性加重 5 淋巴细胞亚群各细胞成分间比例的维系是正常免疫反应的细胞学基础 5 淋巴细胞在抗原的刺激下呈现亚群比例紊乱 导致免疫反应不恰当增强或减弱 造成组织损伤或炎症的持久存在 这可能是 +! 0 病情进展的机制 之一 已有研究证实 在 +! 0 缓解期 外周血 +0 5 细胞数目及 细胞相对于 对照组有所降低 在我们的研究中 +! 0 小鼠 +0 5 细胞和 +0 5 细胞比例明显低于对照组 0 表达阳性的 5 细胞比例升高 提示 +! 0 小鼠免疫反应减弱 经 94 治疗的小鼠 +0 5 细胞及 +0 5 细胞的比例明显高于 +! 0 组小鼠 0 表达阳性的 5 细胞比例降低 提示 94 可以提高小鼠脾脏中 +0 5 细胞及 +0 5 细胞数量 并部分恢复 +0 5 细胞的免疫活性 本研究结果说明 94 对于炎症损伤的保护性作用有限 但是对于增强免疫功能有一定的作用 提高了 +0 5 细胞的比例和活性及 +0 5 细胞的数量 +0 5 细胞的分类及机制有待进一步探讨 综上所述 94 通过降低肺部及全身 2 和 5 水平及提高 +0 5 细胞和 +0 5 细胞比例 降低 5 细胞 0 的表达来改善 +! 0 提示 94 在一定程度上能改善 +! 0 慢性炎症反应及增强免疫力 参 考 文 献 +!4+! " +! 0 --$ $ $% %" 4!20+! 55,,4 $ $ +$! ( 2%0( ( $!2 ))) %$$$ %! 5! 2 " 9 $ % $) $($ $%% % % " % 3 5! 42 "" 9 $ % $) $

6 张 鸽 等 94 对 +! 0 小鼠保护性作用的免疫学研究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收稿日期 编辑 段佳

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