58 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.31No.1Jan.,2017 (2 ), 美国 ABI 公司 ;CD4 + T 细胞分选磁珠抗体及分选柱, 德国 Miltenyi 公司 ;TR

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练宣
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1 上海中医药大学学报第 31 卷第 1 期 2017 年 1 月 57 实验中医 DOI: /j x 解毒祛瘀滋阴方对 MRL/lpr 狼疮鼠 CD4 + T 细胞 DNA 甲基化敏感基因表达的影响陈红波 1, 张利棕 2, 寿旗扬 2, 马红珍 1, 高祥福 1 3, 范永升 1. 浙江中医药大学附属第一医院肾病科 ( 浙江杭州 ) 2. 浙江中医药大学动物实验中心 ( 浙江杭州 ) 3. 浙江中医药大学风湿病研究所 ( 浙江杭州 ) 摘要目的 : 观察解毒祛瘀滋阴方对 MRL/lpr 狼疮鼠 CD4 + T 细胞 DNA 甲基化敏感基因白介素 10 (IL 10) 蛋白磷酸酶 2Ac(proteinphosphatase2Ac,PP2Ac) CD70 表达水平的影响方法 :40 只 MRL/lpr 狼疮小鼠随机分为对照组和解毒祛瘀滋阴方中药组, 分别予解毒祛瘀滋阴方中药和生理盐水灌胃 8 周干预结束后, 观察小鼠皮损及血清抗 dsdna 抗体 C3 浓度尿蛋白水平变化 ;HE 染色及荧光染色后观察肾脏病理改变 ; 荧光定量 PCR 检测小鼠脾脏 CD4 + T 细胞甲基化敏感基因 CD70 PP2Ac IL 10mRNA 表达水平结果 : 与对照组比较, 中药组小鼠血清抗 dsdna 抗体 C3 浓度和肾脏病理损伤明显改善,CD70 PP2Ac 和 IL 10 的 mrna 表达水平明显降低 (P<0.05) 结论: 解毒祛瘀滋阴方具有对 MRL/lpr 狼疮鼠的治疗作用, 其作用机制可能与其抑制下游甲基化敏感基因 CD70 PP2Ac IL 10 的过度表达有关关键词系统性红斑狼疮 ;CD4 + T 细胞 ; 甲基化敏感基因 ; 解毒祛瘀滋阴方 ; 小鼠系统性红斑狼疮 (systemiclupuserythematosus, SLE) 是一种多系统损害病程长预后差的自身免疫性疾病 [1] 其发病机制复杂, 研究提示 DNA 甲基化在 SLE 疾病过程中起重要作用 [2 3] SLE 患者 CD4 + T 细胞上存在一些甲基化敏感基因, 如白介素 10(IL 10) 蛋白磷酸酶 2Ac(proteinphosphatase 2Ac,PP2Ac) CD70 等,SLE 患者 CD4 + T 细胞基因组低甲基化水平可诱导 SLE 发病或加重 [4 5] CD4 + T 细胞基因组 DNA 低甲基化诱导这些甲基化敏感基因过度表达, 过度表达这些基因的 CD4 + T 细胞具有自身反应性, 杀伤自身巨噬细胞或辅助 B 细胞产生大量的自身抗体, 诱导狼疮样疾病 [6 8] 解毒祛瘀滋阴方是范永升教授治疗 SLE20 余年的临床经验方, 取得了较好的临床疗效 [9 10], 尤其是能明显改善 SLE 患者生存质量 [11] 本研究拟观察解毒祛瘀滋阴方对 CD4 + T 细胞甲基化敏感基因 (IL 10 PP2Ac CD70) 表达水平的影响, 从 DNA 甲 [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( , ); 浙江省自然科学基金资助项目 (Y ) [ 作者简介 ] 陈红波, 男, 博士, 副主任医师, 主要从事中西医结合治疗肾病及自身免疫性疾病研究基化调控角度研究解毒祛瘀滋阴方治疗 SLE 的作用机制 1 材料与方法 1.1 实验材料动物 6 周龄 SPF 级 MRL/lpr 狼疮小鼠 40 只, 体质量 (31.6±1.9)g, 均为雌性, 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供, 动物生产合格证号为 SCXK[ 沪 ] 药物和试剂解毒祛瘀滋阴方中药颗粒剂, 江苏天阴药业有限公司生产, 由干地黄 15g 炙鳖甲 12g 青蒿 12g 白花蛇舌草 15g 积雪草 15g 赤芍 12g 丹皮 12g 佛手片 9g 升麻 9g 甘草 6g 组成浓煎至浓度 1.5g/ml,40 保存待用小鼠血清补体 C3ELISA 试剂盒 (E20294) 小鼠尿微量白蛋白 ELISA 试剂盒 (E9005) 小鼠血清 dsdnaelisa 试剂盒 (E20657) 小鼠尿肌酐 ELISA 试剂盒 (E22021), 北京永辉生物科技有限公司 ;FITC 标记兔抗小鼠 IgG 抗体, 香港 BCAM 公司 PE conjugated anti mouse CD4, 美国 ebios cience 公司 ; 荧光定量 PCR 试剂 SybrGreenPCRMasterMix

2 58 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.31No.1Jan.,2017 (2 ), 美国 ABI 公司 ;CD4 + T 细胞分选磁珠抗体及分选柱, 德国 Miltenyi 公司 ;TRIzol(SR1311), 上海生工生物工程有限公司 ; 基因组 DNA 抽提试剂盒 (D0063), 上海碧云天 ; 所有 PCR 引物均委托上海生工生物工程有限公司合成引物见表 1 表 1 小鼠基因引物序列基因名称引物序列扩增长度 (bp) CD70 IL 10 F:5 GCATTACAGCGCCTGACATA 3 R:5 ATCCACTGAACTCCAAAGAAGG 3 F:5 TGGACAACATACTGCTAACCGAC 3 R:5 CCTGGGGCATCACTTCTACC 3 PP2Ac F:5 ACAAGGCGTTCACCAAGGA 3 R:5 CACAGACGGTAACAGGACAGC 3 GAPDH F:5 GGTTGTCTCCTGCGACTTCA 3 R:5 TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 仪器 BDFACSCanto 流式细胞仪, 美国 BD 公司 ;LightCycler480SoftwareSetup 定量 PCR 仪, 美国 Roche 公司 1.2 分组及药物干预小鼠随机分为对照组和中药组干预方法 : 中药组予小鼠灌胃解毒祛瘀滋阴方中药浓缩液, 对照组小鼠灌胃蒸馏水, 灌胃量为 0.01ml/g 体质量, 均每日 1 次, 连续干预 8 周 1.3 MRL/lpr 小鼠 CD4 + T 细胞分选及鉴定断颈法处死小鼠后医用酒精浸泡 5min, 取出脾脏, 碾碎后获取单细胞悬液利用小鼠淋巴细胞分选液分离出细胞悬液中的外周血单个核细胞 (PBMC), 再利用免疫磁珠 (MACS) 分选出 PBMC 中的 CD4 + T 细胞将分离前后 CD4 + T 细胞分别与 PE 标记的 CD4 抗体孵育,4, 避光 30min 同时取等量细胞作为自身对照流式细胞仪检测后 CelQuest 软件进行分析 1.4 观察指标和方法小鼠血清免疫指标等检测采用 ELSIA 试剂盒检测小鼠血清抗 dsdna 抗体 C3 尿蛋白和尿肌酐值小鼠肾组织病理观察小鼠肾脏标本分为两部分, 分别进行以下实验 1 部分肾脏标本用多聚甲醛保存, 制成石蜡包块, 按 4μm 厚度切片, 依次脱蜡脱水,HE 染色后在光镜下检测 2 部分肾脏标本恒温冷冻切片机内切成 5 μm 切片, 0.1mol/L 磷酸缓冲氯化钠溶液 (PBS,pH7.2) 冲洗 3 次, 滴加 FITC 标记的兔抗小鼠 IgG 抗体 (1 16) 稀释, 风干后滴加缓冲甘油 ( 用 20%PBS 稀释甘油 ) 后封片, 于荧光显微镜下观察荧光定量 PCR 检测小鼠 CD4 + T 细胞 CD70 IL 10 PP2Ac 基因 mrna 表达 1RNA 抽提利用 TRIzol 一步法抽提小鼠 CD4 + T 细胞总 RNA 2 逆转录反应体系 (20.0L):totalRNA (5L),Random Primerp(dN)6(0.2g/L,1L), Rnase freeddh 2 O (5 L), 5 Reaction Bufer (4.0L),dNTPMix(10mmol/L,2.0L),Rnase inhibitor(20 U/ L, 1.0 L), AMV Reverse Transcriptase(10U/L,2.0L) 3PCR 扩增反应体系 (20μl):ddH 2 O(7μl),2 SYBRPremixEx TaqTM (10μl), 引物 F(10mmol/L,1.0μl), 引物 R(10μmol/L,1.0μl), 模板 cdna(1.0μl) 反应条件 : 变性 (94,3min), 退火 (96,15s), 延伸 (60,40s),42 个循环样品加入 96 孔板, 于荧光定量 PCR 仪中进行反应每个样本设置 3 个复孔, 取平均值为检测结果为尽可能减小逆转录 PCR 反应及样品间的差异所带来的误差, 以 GAPDH 作为内参基因来标准化样品, 以 2 (ΔΔCt) 方法计算目的基因相对表达量 1.5 统计学方法采用 SPSS17.0 统计软件对实验数据进行分析, 数据以 x±s 表示, 组间两两比较采用 t 检验以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 一般情况在干预结束后, 可见中药组小鼠皮毛光泽明显优于对照组, 尤其是面部皮损明显减轻检查皮下淋巴结, 发现中药组小鼠浅表淋巴结的数量明显减少体积明显减小 ; 腹腔淋巴结也明显减少变小 2.2 MRL/lpr 小鼠 CD4 + T 细胞的分离鉴定结果流式细胞仪检测显示, 免疫磁珠分选前 CD4 + T 淋巴细胞百分比为 10.8%, 免疫磁珠分选后为 76.5% 见图小鼠肾脏病理改变 HE 染色镜下观察发现, 与对照组比较, 中药组小鼠毛细血管内皮细胞增生减轻免疫荧光检查发现, 对照组小鼠肾小球中大量 IgG 呈颗粒状沉积于上皮下系膜区和内皮下, 而中药组中 IgG 沉积明显减少见图 2 图对小鼠血清 dsdna C3 尿蛋白 / 尿肌酐比值的影响与对照组比较, 中药组 MRL/Lpr 小鼠尿蛋白 / 尿肌酐比值明显下降, 差异具有统计学意义 (P<0.05); 两组 dsdna 滴度 C3 浓度差异均无统计学意义 (P>0.05) 见表 2

上海中医药大学学报第３卷５第期２７年月图免疫磁珠分选结果流式细胞术图２两组小鼠肾组织病理ＨＥ染色２图３两组小鼠肾组织免疫荧光检测２

８５４２８±３８２２５３±２４中药组２２８８４±２３４３５３８±３５４２８３８４± ８注与对照组比较Ｐ５２５对小鼠

图７表３３讨论物单一不含引物二聚体及非特异性产物与对照系统性红斑狼疮病因至今尚未完全明确ＣＤ４组比较中药组ＭＲＬｌｐｒ小鼠甲基

3 上海中医药大学学报第３卷５第期２７年月图免疫磁珠分选结果流式细胞术图２两组小鼠肾组织病理ＨＥ染色２图３两组小鼠肾组织免疫荧光检测２表２两组小鼠血清ｄｓＤＮＡＣ３尿蛋白尿肌酐比值比较ｘ±ｓ组别ｎｄｓＤＮＡｍｇＬＣ３ｍｇＬ尿蛋白尿肌酐对照组２２７４８±２３８５４２８±３８２２５３±２４中药组２２８８４±２３４３５３８±３５４２８３８４± ８注与对照组比较Ｐ５２５对小鼠ＣＤ４Ｔ细胞ＣＤ７ＩＰＰ２Ａｃ基因ｍｒｎａ表达的影响目的基因与内参基因有良好的扩增曲线和溶解曲线表明反应体系稳定扩增产具有统计学意义Ｐ５见图４图７表３３讨论物单一不含引物二聚体及非特异性产物与对照系统性红斑狼疮病因至今尚未完全明确ＣＤ４组比较中药组ＭＲＬｌｐｒ小鼠甲基化敏感基因Ｔ细胞在ＳＬＥ发病过程中扮演重要角色它可以辅ＣＤ７ＩＰＰ２ＡｃｍＲＮＡ表达量均明显下降差异助Ｂ细胞活化分泌大量自身抗体同时辅助ＣＤ８Ｔ

器官损伤２研究发现在ＳＬＥ患者中ＣＤ４Ｔ细胞基因组ＤＮＡ普遍存在低甲基化诱导ＳＬＥ发病或加重４５同卵双胞胎研究证实ＤＮＡ甲基化在对照组４± ７４５４２７± ４２２５５± ３ＳＬＥ发病中的重要性在５对ＳＬＥ双胞胎中发现４中药组

4 ＡＣＴＡＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴＩＳＴＲＡＤＩＴＩＯＮＩＳＭＥＤＩＣＡＬＩＳＳＩＮＥＮＳＩＳＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＡＥＱＵＥＳＨＡＮＧＨＡＩＶｏｌ３ＮｏＪａｎ２７图４内参基因ＧＡＰＤＨ扩增曲线左图和熔解曲线右图图５目的基因ＣＤ７扩增曲线左图和溶解曲线右图图目的基因Ｉ扩增曲线左图和溶解曲线右图图７目的基因ＰＰ２Ａｃ扩增曲线左图和溶解曲线右图表３两组小鼠ＣＤ４Ｔ细胞ＣＤ７ＩＰＰ２Ａｃ基因ｍｒｎａ表达量比较ｎ２ｘ±ｓ组别ＣＤ７ＩＰＰ２Ａｃ器官损伤２研究发现在ＳＬＥ患者中ＣＤ４Ｔ细胞基因组ＤＮＡ普遍存在低甲基化诱导ＳＬＥ发病或加重４５同卵双胞胎研究证实ＤＮＡ甲基化在对照组４± ７４５４２７± ４２２５５± ３ＳＬＥ发病中的重要性在５对ＳＬＥ双胞胎中发现４中药组２２± ４３５４ ± ４８３４± ５７８２个ＳＬＥ相关重要基因存在低甲基化３注与对照组比较Ｐ５细胞分化成细胞毒性Ｔ细胞ＣＴＬ引起自身组织在ＳＬＥ患者ＣＤ４Ｔ细胞上存在一些甲基化敏感基因ＣＤ７ＰＰ２Ａｃ等基因组ＤＮＡ低 α Ｉ

5 上海中医药大学学报第 31 卷第 1 期 2017 年 1 月甲基化导致这些基因启动子区低甲基化基因高表达, 这些细胞因子可诱导 SLE 病情加重或复发 [6 8] CD70 是 B 细胞共刺激因子, 主要表达在 CD4 + T 细胞上, 促进 T B 细胞活化 CD70 基因组 DNA 在 SLE 患者 CD4 + T 细胞上表现为低甲基化, 引起基因过度表达, 刺激 B 细胞过度活化, 分泌大量 Ig 抗体, 引起类似狼疮样的自身免疫反应 [6] PP2Acα 是调节 IL 2 表达的重要转录因子, 在 SLE 患者 CD4 + T 细胞中,PP2Acα 基因启动子区低甲基化基因过度表达, 能够抑制 IL 2 的表达, 导致 SLE 活动度增加 [7] SLE 患者 CD4 + T 细胞中,IL 10 基因启动子区低甲基化,IL 10 基因高表达, 血清 IL 10 浓度升高, 导致 SLE 活动度增加 [8] 前期研究发现解毒祛瘀滋阴方可以升高 MRL/ lpr 狼疮小鼠 CD4 + T 细胞基因组 DNA 甲基化水平, 这与其上调 DNMT1 表达下调 Gadd45a 表达有关, 同时发现解毒祛瘀滋阴方可以升高 GRα 表达 [14] 本研究发现经过中药干预治疗后, 狼疮小鼠 CD4 + T 细胞基因组甲基化水平明显上升, 而甲基化敏感基因 (CD70 PP2Ac IL 10)mRNA 表达水平明显下降, 从而发挥治疗作用抗 dsdna 抗体与 C3 是判断 SLE 疾病活动程度的重要指标 [15 16] 在本实验中, 中药组狼疮小鼠面部皮损明显减轻, 全身皮毛光泽度好转 ; 中药组狼疮小鼠尿蛋白 / 尿肌酐比值明显下降, 肾脏病理改变也明显减轻, 说明解毒祛瘀滋阴方中药可以减少尿蛋白排泄, 缓解肾脏损害解毒祛瘀滋阴方主要功效是清热解毒活血祛瘀滋阴益肾, 在治疗 SLE 撤减激素用量及减少激素毒副作用方面发挥了很好的效果其主要包括 10 味中药, 其中干地黄炙鳖甲为君药, 共奏滋阴益肾之功 ; 青蒿白花蛇舌草积雪草为臣药, 奏清热解毒之效 ; 赤芍丹皮共为佐药, 两者性苦凉, 能活血凉血 ; 佛手升麻生甘草共为使药综上所述, 解毒祛瘀滋阴方可明显缓解狼疮小鼠皮肤损害和肾脏损伤, 其作用机制可能与其上调 CD4 + T 细胞基因组 DNA 甲基化水平抑制 DNA 甲基化敏感基因 (CD70 PP2Ac IL 10) 表达有关参考文献 : [1]YuC,GershwinME,ChangC.Diagnosticcriteriaforsystemic lupuserythematosus:acriticalreview[j].jautoimmun,2014, 48 49: [2]BalestarE.Epigeneticalterationsinautoimmunerheumaticdiseases 61 [J].NatRevRheumatol,2011,7(5): [3]JanuchowskiR,ProkopJ,JagodzińskiPP.RoleofepigeneticDNA alterationsinthepathogenesisofsystemiclupuserythematosus[j]. JApplGenet,2004,45(2): [4]ZhangY,ZhaoM,SawalhaAH,etal.ImpairedDNAmethylation anditsmechanismsincd4 + Tcelsofsystemiclupuserythematosus [J].JAutoimmun,2013,41: [5]Strickland FM, Richardson BC. Epigenetics in human autoimmunity.epigeneticsin autoimmunity DNA methylation in systemiclupuserythematosusandbeyond[j].autoimmunity,2008, 41(4): [6]LuQ,WuA,RichardsonBC.Demethylationofthesamepromoter sequenceincreasescd70expresioninlupustcelsandtcels treatedwithlupus inducingdrugs[j].jimmunol,2005,174(10): [7]Sunahori K, Juang YT, Kytaris VC, et al. Promoter hypomethylation results in increased expresion of protein phosphatase2a in T celsfrom patientswith systemic lupus erythematosus[j].jimmunol,2011,186(7): [8]ZhaoM,TangJL,GaoF,etal.HypomethylationofIL10andIL13 promotersin CD4 + T cels ofpatients with systemic lupus erythematosus[j].jbiomedbiotechnol,2010,2010: [9] 范永升, 温成平, 李永伟, 等. 解毒祛瘀滋阴法治疗 SLE 对撤减激素和保护下丘脑垂体肾上腺轴的作用研究 [J]. 浙江中医药大学学报,2006,30(2): [10] 温成平, 范永升, 李永伟, 等. 中西医结合治疗系统性红斑狼疮的增效减毒作用研究 [J]. 浙江中医药大学学报,2007,31(3): [11] 温成平, 范永升, 李夏玉, 等. 中医解毒祛瘀滋阴法对 SLE 患者生存质量的影响研究 [J]. 中华中医药学刊,2007,25(8): [12]ShiozawaS.Causeoflupuserythematosus:anovelself organized criticalitytheoryofautoimmunity[j].expertrevclinimmunol, 2011,7(6): [13] JaviereBM,FernandezAF,RichterJ,,etal.Changesinthe paternofdna methylationasociatewithtwindiscordancein systemiclupuserythematosus[j].genomeres,2010,20(2): [14] 陈红波, 赵丹妮, 史佳丽, 等. 解毒祛瘀滋阴方对 MRL/lpr 小鼠 CD4 + T 细胞 DNA 甲基化的影响及其与 GR 表达的相关性研究 [J]. 浙江中医药大学学报,2015,39(3): [15]RekvigOP.Anti dsdnaantibodiesasaclasificationcriterionand adiagnosticmarkerforsystemiclupuserythematosus: Critical remarks[j].clinexpimmunol,2015,179(1):5 10. [16]LiW,LiH,SongW,etal.Diferentialdiagnosisofsystemiclupus erythematosusandrheumatoidarthritiswithcomplementsc3and C4andC reactiveprotein[j].expthermed,2013,6(5): 编辑 : 沈蕾收稿日期 :

6 62 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.31No.1Jan.,2017 EfectsofJieduQuyuZiyinPrescriptiononDNAMethylationSensitive GeneExpresioninCD4 + TCelofMRL/lprMice CHENHong bo 1,ZHANGLi zong 2,SHOUQi yang 2, MAHong zhen 1,GAOXiang fu 1,FANYong sheng 3 1.DepartmentofNephrology,TheFirstHospitalAfiliatedtoZhejiang UniversityofChineseMedicine,Hangzhou,310006; 2.AnimalExperimentalCenter,ZhejiangUniversityofChineseMedicine,Hangzhou,310053; 3.InstituteofRheumaticDiseases,ZhejiangUniversityofChineseMedicine,Hangzhou, ABSTRACT Objective: ToobservetheefectsofJieduQuyuZiyinPrescriptionontheexpresionofDNA methylation sensitivegeneinterleukin 10(IL 10),proteinphosphatase2Ac(PP2Ac)andCD70inCD4 + TcelofMRL/lprlupusmice. Methods:40MRL/lprlupusmicewererandomlydividedintothecontrolgroupandChinesemedicinegroupofJieduQuyu ZiyinPrescription,andintragastricalytreatedwithnormalsalineandJieduQuyuZiyinPrescriptionfor8weeks.After intervention,theskinlesionsandthelevelsofserum anti dsdnaantibody,c3andurineproteinwereobserved.therenal pathologicalchangeswereobservedafterheandfluorescencestaining.themrnaexpresionsofmethylationsensitivegene includingcd70,pp2acandil 10inCD4 + TcelsofmicespleenweredetectedbyfluorescencequantitativePCR.Results: Comparedwiththecontrolgroup,theserumanti dsdnaantibody,c3concentrationandrenalpathologicalinjurywereobviously improvedinthechinesemedicinegroup,themrnaexpresionlevelsofcd70,pp2acandil 10weresignificantlydecreased inthechinesemedicinegroup(p<0.05).conclusion:jieduquyuziyinprescriptionshowsthetherapeuticefectsonthe MRL/lprmice,anditsmechanismmayberelatedtosuppresingtheover expresionofdownstreammethylationsensitivegenes CD70,PP2AcandIL 10. KEYWORDS systemiclupuserythematosus;cd4 + Tcel;methylationsensitivegene;JieduQuyuZiyinPrescription; mice 櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃 ( 上接第 56 页 ) EfectsofBufalinontheProteinExpresionofHumanColorectal CancerAngiogenesisRelatedVEGFAinNudeMice YAOZi han,qiuyan yan,hexue,yuanyu xia, TANGXue yao,zhangyi xi,yinpei hao PutuoHospitalAfiliatedtoShanghaiUniversityofTraditional ChineseMedicine,Shanghai, ABSTRACT Objective: Toinvestigatetheefectsofbufalinonhumancolorectalcancerangiogenesis.Methods:The efectsofbufalinatdiferentconcentrationonproliferationofhumanumbilicalveinendothelialcelsweredetectedbycck 8 method.transplantedtumormodelofhumancolorectalcancerwasestablishedinnudemice,andthenthemicewererandomly dividedintothecontrolgroupwhichtreatedwithnormalsalineandthebufalingroupwhichtreatedwithbufalinatthedoseof 1.5mg/kgaday.Afterdruginterventionfor4weeks,thegrowthoftransplantedtumorinnudemicewasobserved,the expresionofvascularendothelialgrowthfactora(vegfa)intumortisueswasdetectedbywesternblot.results:inthe concentrationrangeof ng/ml,thegrowthinhibitionrateofbufalinonhumanumbilicalveinendothelialcelswas 1.67% 95.40%,whichshowedinadose dependentmanner,ic 50 was20.86ng/ml.thetransplantedtumorinnudemiceof thebufalingroupwassignificantlysmalerthanthatofthecontrolgroup(p<0.01).theproteinexpresionofvegfain tumortisuesofthebufalingroupwassignificantlylowerthanthatofthecontrolgroup(p<0.05).conclusion:bufalincould inhibittheproliferationofvascularendothelialcelsandthetumorgrowthinnudemicetransplantedwithhumancolorectal cancer.itsmechanismmayberelatedtodown regulatingtheproteinexpresionofvegfa. KEYWORDS bufalin;colorectalcancer;vascularendothelialcel;vascularendothelialgrowthfactora;nudemice

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