772 北京大学学报 ( 医学版 ) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vol.48 No.5 Oct.2016 ABSTRACT Objective:ToobservetheefectofCD40siRNAonexpresionofIFN γ,il
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1 北京大学学报 ( 医学版 ) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vol.48 No.5 Oct CD40siRNA 对 MRL/Lpr 狼疮小鼠炎症反应的影响 王志华 1, 张伟 1, 张艳清 1, 庞春艳 2 1, 王永福 论著 (1. 包头医学院第一附属医院风湿免疫科, 内蒙古自治区包头 ;2. 内蒙古自治区自体免疫学重点实验室, 内蒙古自治区包头 ) [ 摘要 ] 目的 : 观察 CD40 的小干扰 RNA(smalinterferingRNA,siRNA) 对系统性红斑狼疮 (systemiclupuserythe matosus,sle) 动物模型 MRL/Lpr 小鼠细胞因子 IFN γ IL 17 IL 4 和抗双链 DNA(anti doublestranddna,anti ds DNA) 抗体表达水平的影响, 探讨 CD40siRNA 治疗 MRL/Lpr 小鼠的可能性 方法 :16 只 MRL/Lpr 小鼠随机分为对照组 空载体组 CD40 sirna1 组及 CD40 sirna2 组, 每组 4 只, 将成功构建的 CD40siRNA 表达载体尾静脉注射 MRL/Lpr 小鼠, 对照组和空载体组小鼠分别注射等剂量 等比例的磷酸盐缓冲液 (PBS) 和 pgfp V RS 空载体, 每隔 1 天 1 次, 共 6 次,14d 处死小鼠, 称其脾的质量, 组织切片在荧光显微镜下观察小鼠脾是否有 CD40siRNA 的表达, 注射前及注射后第 和 14 天小鼠尾部采血,ELISA 法检测 4 组小鼠血清中 IFN γ IL 17 IL 4 和 anti dsdna 抗体的表达水平变化,RT PCR 法检测小鼠脾组织中 CD40mRNA 的表达水平, 免疫组织化学法检测小鼠脾组织中 CD40 蛋白的表达水平 结果 : 注射后的 sirna 表达载体可以在小鼠脾中表达 ; 注射 CD40siRNA 组的小鼠脾质量减轻, 由对照组 (141.88±7.81)mg 和空载体组 (153.10±7.60)mg 降低至 CD40 sirna1 组 (78.85 ±5.61)mg 和 CD40 sirna2 组 (80.25±4.07)mg, 注射前 4 组小鼠血清中 IFN γ IL 17 IL 4 和 anti dsdna 抗体的 ( 质量 ) 浓度比较, 差异无统计学意义 ; 而注射后第 2 5 和 8 天 CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组 MRL/Lpr 小鼠血清中 IFN γ IL 17 和 ( 质量 ) 浓度明显下降,CD40 sirna1 组的 IFN γ 的 ( 质量 ) 浓度依次为 (118.74±10.32)ng/L(pg/mL) (115.24±8.26)ng/L (113.71±5.02)ng/L,CD40 sirna2 组依次为 (117.83±6.83)ng/L (114.07±0.97)ng/ L (112.67±9.66)ng/L;CD40 sirna1 组的 IL 17 的 ( 质量 ) 浓度依次为 (7.05±0.41)ng/L (6.34±0.76)ng/L (5.83±0.43)ng/L,CD40 sirna2 组依次为 (7.07±0.22)ng/L (6.35±0.49)ng/L (6.12±0.80)ng/L;CD40 sirna1 组的 anti dsdna 的浓度依次为 (7.51±0.29)ng/L (6.74±0.45)ng/L (6.32±0.39)ng/L;CD40 sirna2 组依次为 (8.19±0.38)ng/L (7.14±0.50)ng/L (6.48±0.29)ng/L IL 4 的 ( 质量 ) 浓度明显升高,CD40 si RNA1 组 IL 4 的 ( 质量 ) 浓度依次为 (26.51±1.81)ng/L (27.80±1.72)ng/L (28.08±2.21)ng/L,CD40 sirna2 组依次为 (26.28±2.03)ng/L (28.15±2.95)ng/L (28.37±1.71)ng/L CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组与对照组和空载体组比较差异有统计学意义 (P<0.05), 注射后第 11 和 14 天 CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组中这 4 个指标的 ( 质量 ) 浓度逐渐恢复至对照组和空载体组的 ( 质量 ) 浓度水平,IFN γ IL 17 IL 4 的 ( 质量 ) 浓度 4 组小鼠比较, 差异无统计学意义, 注射后第 11 天 CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组 anti dsdna 抗体的水平尽管与对照组和空载体组比较有所提高,4 组比较差异有统计学意义 (P<0.05), 而注射后第 14 天 anti dsdna 抗体的水平 4 组小鼠比较, 差异无统计学意义 注射后第 14 天 CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组 MRL/Lpr 小鼠脾组织中 CD40mRNA 和蛋白的表达水平明显低于对照组和空载体组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 结论:MRL/Lpr 小鼠注射 CD40siRNA 载体后, 血清中 IFN γ IL 17 和 anti dsdna 抗体水平降低,IL 4 的浓度升高,CD40mRNA 和蛋白的表达水平下降, 说明 CD40siRNA 抑制其 mrna 和蛋白后,MRL/Lpr 小鼠炎症反应减轻, 疾病活动度下降, 提示其对 SLE 动物模型 MRL/Lpr 小鼠有治疗作用 [ 关键词 ] 抗原,CD40;RNA, 小分子干扰 ; 红斑狼疮, 系统性 ; 细胞因子类 ; 小鼠, 近交 MRLLpr [ 中图分类号 ]R593.2 [ 文献标志码 ]A [ 文章编号 ] X(2016) doi: /j.isn X EfectofCD40siRNAoninflammatoryresponseofMRL/Lprmice WANGZhi hua 1,ZHANGWei 1,ZHANGYan qing 1,PANGChun yan 2Δ,WANGYong fu 1Δ (1.DepartmentofRheumatology,theFirstAfiliatedHospitalofBaotouMedicalColege,Baotou014010,InnerMogolia, China;2.KeyAutoimmunityLabofInnerMongolia,Baotou014010,InnerMogolia,China) 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 资助 SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina( ) Corespondingauthors e mail,pchy_fighting@163.com,wyf5168@hotmail.com 网络出版时间 : :56:42 网络出版地址 :htp://
2 772 北京大学学报 ( 医学版 ) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vol.48 No.5 Oct.2016 ABSTRACT Objective:ToobservetheefectofCD40siRNAonexpresionofIFN γ,il 17,IL 4and anti dsdnaantibodyofsystemiclupuserythematosus(sle)animalmodelmrl/lprmiceandtodiscus itstherapyonmrl/lprmice.methods:inthestudy,16femalemrl/lprmicewererandomlydivided intocontrolgroup(n=4),emptyvectorgroup(n=4),cd40 sirna1group(n=4)andcd40 sir NA2group(n=4).ThevectorsexpresingsiRNAagainstCD40wereinjectedbytailveilintoMRL/Lpr mice,whilemrl/lprmiceincontrolgroupandemptyvectorgroupwereinjectedwiththesamedoseof PBSandpGFP V RSvectorrespectively.Theinjectionwasgivensixtimesandeveryoneday.Themice weresacrificed14dafterinjection,andthespleentisuewasweighed.thepgfp V RSwaslabeledby greenfluorescentprotein(gfp)andthetisuesectionswereobservedwhethersirnaexpresedinthe spleen.theexpresionlevelsofifn γ,il 17,IL 4andanti dsdnaantibodyintheseraweredetected byelisamethodonthe1stdaybeforethefirsttimeandthe2nd,5th,8th,11th,and14thdaysafter lastinjection,andtheexpresionlevelsofcd40mrnainspleentisueofmrl/lprmiceweredetected byrt PCRandtheexpresionlevelsofCD40proteininspleentisueofMRL/Lprmiceweredetectedby immunohistochemistrymethod.results:theexpresionvectorofcd40 sirna couldexpresinthe spleenofmrl/lpr.thespleensincd40 sirna1group[(78.85 ±5.61)mg]andCD40 sirna2 group[(80.25±4.07)mg]werelowerthanthoseincontrol[(141.88±7.81)mg]andemptyvector group[(153.10±7.60)mg].thelevelsofil 17,IFN γandanti dsdnaantibodywerelowerandthe levelsofil 4washigherinCD40 sirna1groupandcd40 sirna2grouponthe2nd,5thand8thdays afterlastinjectionthanonthe1stdaybeforethefirsttime(p<0.05).thelevelsofifn γincd40 sirna1groupwere(118.74±10.32)ng/l,(115.24±8.26)ng/land(113.71±5.02)ng/lin turn,thelevelsofifn γincd40 sirna2groupwere(117.83±6.83)ng/l,(114.07±0.97)ng/l and(112.67±9.66)ng/linturn.thelevelsofil 17inCD40 sirna1groupwere(7.05±0.41) ng/l,(6.34±0.76)ng/land(5.83±0.43)ng/linturn,thelevelsofil 17inCD40 sirna2 groupwere(7.07±0.22)ng/l,(6.35±0.49)ng/land(6.12±0.80)ng/linturn.thelevelsof anti dsdnaantibodyincd40 sirna1groupwere(7.51±0.29)ng/l,(6.74±0.45)ng/land (6.32±0.39)ng/Linturn,thelevelsofanti dsdnaantibodyincd40 sirna2groupwere(8.19± 0.38)ng/L,(7.14±0.50)ng/Land(6.48±0.29)ng/Linturn.ThelevelsofIL 4inCD40 sirna1groupwere(26.51±1.81)ng/l(27.80±1.72)ng/land(28.08±2.21)ng/linturn,the levelofil 4inCD40 sirna2groupwere(26.28±2.03)ng/l,(28.15±2.95)ng/land(28.37± 1.71)ng/Linturn.TheexpresionlevelsofIL 17andIFN γantibodyincreasedgradualyandthe levelsofil 4decreasedgradualyinCD40 sirna1groupandcd40 sirna2grouponthe11thand14th daysafterlastinjection,thenreachedtothelevelsofcontrolgroupandemptyvectorgroup(p>0.05). Thoughthelevelsofanti dsdnaantibodyincd40 sirna1groupandcd40 sirna2grouponthe11th daywashigherthanonthe8thday,therewasmoresignificancethanthoseincontrolgroupandempty vectorgroup(p<0.05).therewasnosignificancebetweenthe4groupsonthe14thday.thelevelsof CD40mRNAandproteinwerelowerinCD40 sirna1groupandcd40 sirna2groupthanincontrol groupandemptyvectorgrouponthe14thdayafterlastinjection(p<0.05).conclusion:cd 40si RNAcanreducetheconcentrationofIL 17,IFN γandofanti dsdnaantibodyinserum,andatthe sametime,itcanelevatetheconcentrationofil 4andsuppresCD40mRNAandproteinofspleenin MRL/Lpr.MeanwhileaftersuppresingCD40mRNAandprotein,itcanreduceinflammatoryresponseof themiceandthediseaseactivityofmrl/lpr,suggestingthatcd 40siRNAhastherapyefectonSLE. KEYWORDS Antigens,CD40;RNA,smalinterfering;Lupuserythematosus,systemic;Cytokines; Mice,inbredMRLLpr 系统性红斑狼疮 (systemiclupuserythematosus, SLE) 是一种多发于青年女性, 并可累积多系统 多器官的自身免疫性疾病, 严重危害育龄期妇女的健康,SLE 的确切病因不清楚, 可能由多种因素综合引起, 由于异常的免疫激活和自身耐受性丧失可引起免疫活性过高, 从而导致该病的发生 Th1 细胞 Th2 细胞 Th17 细胞及其分泌的多种细胞因子 (IFN γ IL 4 IL 17 等 ) 和自身抗体, 以及 CD40 与其配体 CD40L 形成信号通路在 SLE 的病理过程中起重要作用 [1-2], 其中抗双链 DNA(anti doublestrand DNA,anti dsdna) 抗体在 SLE 诊断和指导治疗方面具有重要的意义 [3-4] 目前,SLE 的治疗主要是应用糖皮质激素和免疫抑制剂, 其毒副作用较大, 而且治 疗周期较长 小干扰 RNA(smalinterferingRNA, sirna) 是一种特定基因沉默技术, 它具有高效性 特异性等优点 因此, 本研究采用 sirna 技术沉默 MRL/Lpr 小鼠中 CD40 基因的表达, 探讨 CD40 基因的 sirna 对 MRL/Lpr 小鼠的可能治疗作用 1 材料与方法主要试剂及仪器 : 载体 pgfp V RS 购自美国 Origene 公司,AxyPrep 质粒 DNA 大量抽提试剂盒购自美国 Axygen 公司,TRIzol 购自日本 Takara 公司,M MLV 逆转录酶和脂质体 lipofectamine TM 2000 购自美国 Invitrogen 公司,ELISA 试剂盒为美国 RD 公司国内分装试剂盒, 购自上海生工生物工程有限公司
3 王志华, 等 CD40siRNA 对 MRL/Lpr 狼疮小鼠炎症反应的影响 773 sirna 的设计和 CD40 sirna 是否在小鼠脾中表达 : 针对 CD40 基因的 cdna 序列设计 2 段 sir NA, 第 1 段序列为 CTTGGAGGTCCTACAGAAA, 第 2 段序列为 GTGTTATCCCTGGACAAGC, 将上述序列的模板插入质粒载体 pgfp V RS 中, 构建其真核表达载体 将构建好的 60μgCD40siRNA1 和脂质体 lipofectamine2000 TM 的混合物 200μL[DNA(μg) lipofectamine TM 2000(μL) 为 1 2] 分别自尾静脉注射 MRL/Lpr 小鼠, 对照组小鼠注射等剂量 等比例的磷酸盐缓冲液 (PBS) 和 lipofectamine TM 2000 的混合物,6h 后处死其中一只小鼠取脾, 快速冰冻切片, 荧光显微镜下观察是否有绿色荧光 实验动物分组及给药 : 十二周龄 MRL/Lpr 雌性小鼠 16 只, 体质量 18~23g, 购自南京大学动物研究所 按照简单随机化分组方法将小鼠分为对照组 空载体组 CD40siRNA1 组和 CD40siRNA2 组 4 组, 每组 4 只 注射方法同上, 空载体组小鼠注射和空载体与 lipofectamine TM 2000 的混合物, 每隔 1 天 1 次, 共 6 次 注射前一天和第 6 次注射后的第 和 14 天小鼠尾部采血, 取血清 -80 保存 各项指标的检测 : 小鼠血清 50 倍稀释后 ELISA 检测 IFN γ IL 17 IL 4 和 anti dsdna 抗体的水平, 450nm 处检测其光密度 (D) 值 ; 根据标准曲线计算出 IFN γ IL 17 IL 4 和 anti dsdna 抗体的 ( 质量 ) 浓度 注射后第 14 天处死所有组 MRL/Lpr 小鼠, 取小鼠脾, 分成两份, 其中一份 TRIzol 提 RNA, 实时荧光定量 PCR 检测小鼠脾中 CD40mRNA 的表达水平, 根据 ct 值计算 2 -ΔΔct 引物由上海生工生物工程有限公司合成,CD40 上游引物 5 GAGAAGAC CCAATGCCACC 3, 下游引物 5 GCACATGCCTCG CAATCC 3 ; 内参 β actin 上游引物 5 CTGTCCCTG TATGCCTCTG 3, 下游引物 5 ATGTCACGCACGA TTTCC 3 另一份脾放入 4%( 体积分数 ) 甲醛溶液固定, 石蜡包埋, 切片, 然后脱蜡,TrionX 100 通透, 5%( 质量分数 ) 牛血清白蛋白 (bovineserum albu min,bsa)37 封闭, 滴加兔抗小鼠的一抗 4 过夜,PBS 洗涤后加 AlexaFluorRR546 标记山羊抗兔的 IgG 二抗, 封片, 荧光显微镜观察红色荧光强度, 同时采集图片, 图片采用 IPP6 软件分析平均 D 值 统计学分析 : 采用 SPSS17.0 统计软件进行数据分析, 以均数 ± 标准差表示, 组间的比较采用单因素方差分析,P<0.05 认为差异有统计学意义 2 结果 2.1 MRL/Lpr 小鼠脾质量的改变 4 组小鼠脾质量比较, 对照组和空载体组小鼠的脾质量明显比 sirna1 组和 sirna2 组小鼠的脾质量增加, 对照组和空载体组比较差异无统计学意义,siRNA1 组和 sirna2 组比较差异也无统计学意义 对照组和空载体组与 sirna1 组和 sirna2 组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05, 表 1) 表 1 4 组小鼠脾质量 ( x±s) 珋 Table1 ThequantityofspleeninMRL/Lprmice( x±s) 珋 /mg Group Weightofspleen Controlgroup ±7.81 Emptygroup ±7.60 sirna1group ±5.61 sirna2group ±4.07 P<0.05,camparedwithcontrolgroup. 2.2 CD40siRNA 真核表达载体可以在 MRL/Lpr 小鼠脾中的表达由于本实验用到的质粒载体 pgfp V RS 含有绿色荧光蛋白, 因此荧光显微镜下观察冰冻切片, 结果发现 : 对照组小鼠脾中看不到绿色荧光, 而 CD40 sir NA1 组可看到明显的绿色荧光, 即 CD40siRNA 真核表达载体可以在 MRL/Lpr 小鼠脾中表达 ( 图 1) A,controlgroup;B,CD40 sirnalgroup. 图 1 CD40siRNA 表达载体在小鼠脾中的表达 Figure1 CD40siRNAexpresionvectorinspleenofmice 组小鼠 CD40siRNA 注射前后 IFN γ 的表达注射前 1 天对照组 IFN γ 的 ( 质量 ) 浓度为 (132.51±8.50) ng/l, 空载体组为 (130.72± 8.05)ng/L,CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组分别为 (129.70±4.42)ng/L 和 (131.97±2.98)ng/ L,4 组比较差异无统计学意义, 但注射后第 天 CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组 MRL/Lpr 小鼠血清中 IFN γ 的 ( 质量 ) 浓度逐渐下降, 而对照组和空载体组的 ( 质量 ) 浓度并未明显下降,CD40 sir NA1 组和 CD40 sirna2 组与对照组和空载体组比较差异有统计学意义 (P<0.05), 注射后第 11 和
4 北 4 京 大 学 学 报 医 学 版 J OURNALOFPEKI NGUNI VERS I TY HEALTHS CI ENCES V 48 N 5 O 2 4天 RNA组和 小鼠血清中 和 小鼠血清中 I 的 质量 I FN γ的浓度逐渐升高 略低于对照组和空载体组 浓度逐渐升高 略低于对照组和空载体组中的 质 的 质 量 浓 度 4组 比 较 差 异 没 有 统 计 学 差 异 量浓度 4组比较差异没有统计学意义 P 5 P 5 图 2 图 4 5 m w h m P 图 2 4组小鼠血清 I FN ± γ表达水平 4 珋 F 2 I FN m fmrl m γ 4 珋 ± 5 m w h m P 图 3 4组小鼠血清 I 4表达水平 4 珋 ± F 3 I 4 m fmrl m 4 珋± 4 4组小鼠 RNA注射前后 I 4的表达 水平 注射 前 一 天 对 照 组 I 4的 质 量 浓 度 为 2 83± L 空载体组为 3 ±4 2 9 L RNA组 和 RNA2组 分 别 为 2 ± L和 9 4± 35 L 4组 比较差异无统计学意义 但注射后第 2 5 8和 天 RNA组和 小鼠 血清中 I 4的 质量浓度逐渐升高 而对照组和空 载体组 I 4的 质 量浓 度 没 有 明 显 变 化 RNA2组与对照组和空载体组 RNA组和 比较差异有统计学意义 P 5 注射后第 4天 RNA组和 小鼠血清中 I 4 5 m w h m P 图 4 4组小鼠血清 I 表达水平 4 珋 ± F 4 I m fmrl m 4 珋 ± 的浓度逐渐下降 略高于对照组和空载体组中的浓 4组小鼠 RNA注射前后 DNA抗 度 4组比较差异没有统计学意义 P 5 图 3 体的变化 5 4组小鼠 RNA注射前后 I 的表达 注射 前 一 天 对 照 组 I 的 质 量 浓 度 为 注射前一天 DNA抗体对照组的 质量浓 度为 9 ± 3 3 L 空载体组为 9 5 4± 3 2 ± 23 L 空载体组为 4± L RNA组为 9 2± L L RNA 组 和 RNA2 组 分 别 为 RNA2组为 9 9 ± 4 5 L 4组比较差异无统 ± 4 L和 8± 5 5 L 4组比 计学意义 注射后第 2 5 8和 天 RNA组 较差 异 无 统 计 学 意 义 但 注 射 后 第 2 5和 8天 和 小鼠血清 DNA抗 RNA组和 小鼠 体的 质 量浓 度 逐 渐 下 降 但 在 注 射 后 第 4天 的浓度逐渐下降 而对照组和空载体 血清中 I RNA组和 RNA2组 DNA抗体 组I 的浓度略有上升 RNA组和 的浓度开始升高 而对照组和空载体组小鼠血清中 RNA2组与对照组和空载体组比较差异有统计学 DNA抗体的浓度随着时间的延长略有上升 意义 P 5 注射后第 和 4天 RNA组 RNA组和 RNA2组与对照组和空载
5 王志华 等 5 RNA对 MRL 狼疮小鼠炎症反应的影响 体组比较差异有统计学意义 P 5 图 5 在其发病过程中发挥重要作用 并与疾病活动度呈 正相关 Th 和 T 之间的失衡在 SLE的病理发 展中起关键作用 5 MRL 小鼠作为一 种 SLE 的动物模型 被广泛用于 S LE的研究 RNA干扰 f RNA 技术作为一种疾病基因 RNA 治疗手段被广泛用于自身免疫性疾病和肿瘤等的治 疗 8 5 m w h m P 图 5 4组小鼠 DNA抗体的表达水平 4 珋 ± F 5 DNA b y m f MRL m 4 珋 ± 4组小鼠 RNA注射后 mrna的 表达 RNA组和 注射后第 4天处死小鼠 RNA2组小鼠脾中 mrna的表达明显 低于对照组和空载体组 差异有统计学意义 P 5 对照组和空载体组比较差异无统计学意义 RNA组和 RNA2组比 P 5 A B m C RNA D RNA2 较差异有统计学意义 P 5 表 2 表 2 4组小鼠脾中 mrna表达水平 珋± T b 2 h fmrna f mmrl m 珋± 图 4组小鼠脾中 蛋白的表达水平 F h f f m MRL m 是与 T细胞和 B细胞功能有关的一种表 G 2 ΔΔC C ± 面抗原 为 Ⅰ 型 跨 膜 糖 蛋 白 研 究 发 现 在 Em ± 2 SLE患者骨髓造血祖细胞中高表达 SLE患者的骨 RNA 9± 8 髓细胞和健康对照者相比 L在其培养的上清 RNA2 33± 液中 和 贴 壁 层 细 胞 中 表 达 水 平 明 显 升 高 因 此 5 m w h P 8 4组小鼠 RNA注射后 蛋白的表达 注射后第 4天处死小鼠 检测 4组小鼠脾中 蛋白的表达 发现对照组和空载体组有很强的 与其配体 L形成信号通路在 SLE中可能 起重要作用 9 同时 还可激活 SLE患者 B细 胞 使其增殖和分化能力增强 免疫球蛋白 mm b I S分泌增多 因此 针对 的基因 红色荧光 而 RNA组和 RNA2组的 治疗是治疗 S LE的策略之一 本课题组的前期体外 红色荧光量明显减弱 即 RNA组和 研究发现 的 RNA可抑制小鼠巨噬细胞 J 4 的表达明显低于对照组和空载体组 RNA2组 细胞中 mrna和蛋白的表达水平 用本研究 对照组 和 空 载 体 组 比 较 差 异 不 明 显 RNA组 和 成功构建的 2段 RNA真核表达载体注射 MRL RNA2组比较也无明显差异 图 上述应用的为 小鼠尾静脉后发现 MRL 小鼠脾重量减轻 同时 荧光免疫组织化学法 无需染色 放大倍数为 倍 C4 的 RNA可 以 在 小 鼠 脾 中 表 达 RNA组 和 3 讨论 系统性红斑狼疮是一种常见的自身免疫性疾 病 好发于育龄期女性 Th 分泌的细胞因子 I FN γ 小鼠脾中 mrna和蛋白的 表达与对照组和空载体组比较明显下降 充分说明 的特异性 RNA能在基因和蛋白水平上沉默其 表达 同时它对免疫器官有一定的保护作用
6 776 北京大学学报 ( 医学版 ) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vol.48 No.5 Oct.2016 [11] Harigai 等检测 SLE 患者外周血 T 细胞中 IFN γ 的表达, 结果发现 IFN γ 的表达明显升高, 它通过诱导可溶性 B 淋巴细胞刺激因子 (solubleb lymphocytestimulator,sblys) 的表达而参与 SLE 的免疫病理过程, 从而在 SLE 的发病过程中起非常重 [12] 要的作用 Amarilyo 等研究发现 2,6,10,14 四甲基十五烷 (pristane) 不能诱导 IL 17 缺失的小鼠形产生狼疮相关的自身抗体和狼疮肾炎的形成, 原因是 IL 17 的缺失可减少 CD3+CD4 CD8 T 的产生, 同时增加 CD4+ 调节性 T 细胞的产生 本研究针对基因 CD40 成功构建 2 段 sirna 真核表达载体, 并经尾静脉注射 MRL/Lpr 小鼠, 结果显示 CD40 sirna 真核表达载体可以靶向到 MRL/Lpr 小鼠脾, 从而发挥作用 ELISA 的结果显示注射后第 2 5 和 8 天 CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组 MRL/Lpr 小鼠血清中 IFN γ 和 IL 17 的 ( 质量 ) 浓度随时间的延长而逐渐下降, 与治疗前比较差异均有统计学意义, 而对照组和空载体组的浓度与治疗前比较并未明显下降,3 个时间段 CD40 sirna1 组和 CD40 sir NA2 组与对照组和空载体组比较差异均有统计学意义, 提示 CD40 的 sirna 可减弱 MRL/Lpr 小鼠的 Th1 和 Th17 相关炎症因子的表达水平 Robak [13] 等研究发现 SLE 患者血清中 IL 4 的表达水平降低, 与健康对照者相比差异有统计学意义 本研究发现注射后第 2 5 和 8 天 CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组 MRL/Lpr 小鼠血清中 IL 4 的 ( 质量 ) 浓度随时间的延长而逐渐升高, 与治疗前比较差异均有统计学意义, 提示 CD40 的 sirna 可升高 MRL/Lpr 小鼠的 Th2 相关炎症因子的表达水平, 而注射后第 11 和 14 天 CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组 MRL/Lpr 小鼠血清中 IFN γ 和 IL 17 的浓度开始逐渐升高,IL 4 的浓度逐渐降低, 接近于对照组和空载体组中的浓度,4 组比较差异没有统计学意义, 这可能与 CD40 的 sirna 载体在小鼠体内代谢及产生的免疫反应有关 anti dsdna 抗体是判断 SLE 活动度的重要标记, 在诊断 SLE 时有很好的灵敏度和特异性 [7] ZHOU 等研究发现 B 淋巴细胞诱导成熟蛋白 1 (B lymphocyte inducedmaturationprotein1,blimp 1) 的 sirna 可以清除产生 anti dsdna 抗体的浆细胞和降低血清中 anti dsdna 抗体的浓度, 从而延缓狼疮的进程 本研究结果发现 CD40 的 sirna 真核表达载体注射 MRL/Lpr 小鼠第 和 11 天后 anti dsdna 抗体的浓度逐渐下降, 与治疗前比较差异有统计学意义, 而对照组和空载体组的浓度比治疗前略有上升,4 个时间段 CD40 sirna1 组和 CD40 sir NA2 组与对照组和空载体组比较差异均有统计学意义, 但在注射后第 14 天 CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组 anti dsdna 抗体的浓度开始升高, 但还是要远低于对照组和空载体组,CD40 sirna1 组和 CD40 sirna2 组与对照组和空载体组比较差异有统计学意义 因此,CD40 的 sirna 载体注射 MRL/ Lpr 小鼠后 anti dsdna 抗体的表达明显减弱, 即 CD40 的 sirna 可减轻 SLE 的疾病活动程度 综上所述,CD40siRNA 可抑制 CD40mRNA 和蛋白的表达水平, 降低血清中 IFN γ 和 IL 17 的表达, 提升 IL 4 的表达水平, 说明 CD40siRNA 可使 MRL/Lpr 小鼠炎症反应减轻, 疾病活动度下降, 提示其对 SLE 动物模型 MRL/Lpr 小鼠有治疗作用, 为 SLE 的基因治疗提供了实验依据 参考文献 [1]MokMY,WuHJ,LoY,etal.Therelationofinterleukin17(IL 17)andIL 23toTh1/Th2cytokinesanddiseaseactivityinsys temiclupuserythematosus[j].jrheumatol,2010,37(10): [2] ShahK,LeeWW,LeeSH,etal.DysregulatedbalanceofTh17 andth1celsinsystemiclupuserythematosus[j].arthritisres Ther,2010,12(2):53. [3] WichainunR,KasitanonN,WangkaewS,etal.Sensitivityand specificityofanaandanti dsdnainthediagnosisofsystemiclu puserythematosus:acomparisonusingcontrolseraobtainedfrom healthyindividualsandpatientswithmultiplemedicalproblems [J].AsianPacJAlergyImmunol,2013,31(4): [4]VilaltaD,BizaroN,BasiN,etal.Anti dsdnaantibodyiso typesinsystemiclupuserythematosus:igainadditiontoigganti dsdnahelptoidentifyglomerulonephritisandactivedisease[j]. PLoSOne,2013,8(8):e [5] Szmyrka KaczmarekM,KosmaczewskaA,CiszakL,etal.Pe ripheralbloodth17/tregimbalanceinpatientswithlow active systemiclupuserythematosus[j].postepyhigmeddosw(on line),2014,68: [6] HuangZY,Kim MK,Kim HanTH,etal.Efectoflocalyad ministeredsyksirna onalergen inducedarthritisandasthma [J].MolImmunol,2013,53(1/2): [7]ZhouZ,RenY,HuZ.Blimp 1siRNAinhibitsBceldiferentia tionandpreventsthedevelopmentoflupusinmice[j].humim munol,2013,74(3): [8]PatilSP,KimSH,JadhavJR,etal.Cancer specificgenesilen cingthroughtherapeuticsirna deliverywith B vitamin based nanoasembledlow molecular weighthydrogelators[j].bioconjug Chem,2014,25(8): [9]PyrovolakiK,MavroudiI,SidiropoulosP,etal.Increasedex presionofcd40onbonemarowcd34+ hematopoieticprogeni torcelsinpatientswithsystemiclupuserythematosus:contribu tiontofas mediatedapoptosis[j].arthritisrheum,2009,60 (2): [10]NéronS,BoireG,DusaultN,etal.CD40 activatedbcelsfrom patientswithsystemiclupuserythematosuscanbemodulatedby therapeuticimmunoglobulinsinvitro[j].archimmunoltherexp (Warsz),2009,57(6): [11] HarigaiM,KawamotoM,HaraM,etal.Excesiveproductionof IFN gammainpatientswithsystemiclupuserythematosusandits contributiontoinductionofblymphocytestimulator/bcel activa tingfactor/tnfligandsuperfamily 13B[J].JImmunol,2008, 181(3): [12]AmarilyoG,Louren oev,shifd,etal.il 17promotesmurine lupus[j].jimmunol,2014,193(2): [13] RobakE,SmolewskiP,WozniackaA,etal.Relationshipbe tweenperipheralblooddendriticcelsandcytokinesinvolvedinthe pathogenesisofsystemiclupuserythematosus[j].eurcytokine Netw,2004,15(3): ( 收稿 ) ( 本文编辑 : 王蕾 )
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