研究报告 生物技术通报 IOTECHNOLOGY ULLETIN 2014 年第 8 期 静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在 ac-to-ac 系统中的表达 纯化与结晶 林波孟海玲吴勇邴晖长孙东亭罗素兰 ( 海南大学热带生物资源教育部重点实验室海口市海洋药物重点实验室, 海口 570228) 摘要 : 表达 纯化静水椎螺 (Lymnaea stagnalis) 乙酰胆碱结合蛋白 (Ls-ChP) 并得到晶体 将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白 cdn 序列克隆到表达载体 pfastac1 上, 构建了重组表达质粒 pfastac1-ls-chp-his, 经重组子筛选, 得到重组杆状病毒质粒 acmid, 采用 Cellfectin Ⅱ 脂质体, 把带有外源基因的杆状病毒质粒 acmid 转染到昆虫细胞中, 经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体, 并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体 重组蛋白 Ls-ChP 在 ac-to-ac 表达系统中得到高效表达并被纯化, 结晶筛选得到晶体 关键词 : 静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白 ac-to-ac 杆状病毒表达系统重组表达纯化结晶 Expression,Purification,Crystallization of cetylcholine inding Proteins from Lymnaea stagnalis in ac-to-ac System Lin o Meng Hailing Wu Yong ing Hui Zhangsun Dongting Luo Sulan (Key Lab for Tropical iological Resources,Ministry of Education,Key Lab for Marine Drugs of Haikou, Hainan University,Haikou 570228) bstract: It was to construct a recombinant bacmid that expresses acetylcholine binding protein from Lymnaea stagnalis(ls-chp) and express the Ls-ChP functional genes in ac-to-ac expression system to obtain the crystal. Synthesized Ls-ChP cdn was inserted into the correct position of the baculovirus expression vector pfastac1. fter the positive recombinant bacmid was screened, the recombinant bacmid was transfected into the insect cells to generate restructured baculovirus for high expression of the recombinant protein Ls-ChP(rLs- ChP), which was captured by nickel-charged resin, and further purified by gel filtration chromatography. The rls-chp pentamer was obtained and performed crystallization by robot screen. Recombinant Ls-ChP expression in ac-to-ac system was successfully and we got Ls- ChP crystal. Ls-ChP is one of the chps. The crystal structure of rls-chp is an available template of description of nchrs structure and function. Key words: Ls-ChP ac-to-ac expression system Recombinant expression Purification Crystallization 烟碱型乙酰胆碱受体 (nchrs) 是配体门控的离子通道蛋白 (Ligand-gated ion channel),nchrs 的研究在成瘾 神经痛 阿尔茨海默氏病, 精神分裂症和帕金森氏病等疾病治疗和机理研究中具有十分重要的作用 然而到目前为止, 人们尚未能清楚解析这些膜蛋白的 X-ray 结构 乙酰胆碱结合蛋白 (ChPs) 与 nchrs 的膜外配体结合结构域具有同源性, 具有五聚体结构 多年来, 通过 ChPs 及其与配体结合的复合物的晶体结构的解析, 使我们理解 nchrs 的结构和功能的关系, 为新药开发奠定理论基础 [1-3] 目前, 已从软体动物螺里纯化与鉴别出来 3 种 收稿日期 :2013-12-17 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (41366002), 国家国际科技合作专项 (2011DFR31210), 海南省社会发展科技专项 (SF201328), 海口市重点科技计划项目 (2013-16), 长江学者和创新团队发展计划 (IRT1123), 海南省研究生创新科研课题 (201305,201306) 作者简介 : 林波, 男, 博士研究生, 研究方向 : 蛋白质结构 ;E-mail :linbo_752@163.com 通讯作者 : 罗素兰, 女, 教授, 博士生导师, 研究方向 : 海洋药物与生物技术 ;E-mail :luosulan2003@163.com ; 长孙东亭, 男, 副研究员. 研究方向 : 海洋药物与生物技术 ;E-mail :zhangsundt@163.com
2014 年第 8 期林波等 : 静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在 ac-to-ac 系统中的表达 纯化与结晶 127 乙酰胆碱结合蛋白 (ChPs), 它们的结构基本相同, 分别来自静水椎螺 (Lymnaea stagnalis), 海兔 ( plysia californica), 淡水蜗牛 (ulinus truncates), 分别简称为 Ls-ChP,c-ChP 和 t-chp ChPs 已经被证明与 nchrs 具有相类似的配体结合结构域和相同药理特性 [4-6], 所以 ChPs 的晶体结构可作为研究 nchrs 的工具 Ls-ChP 是三种乙酰胆碱结合蛋白中重要的一种, 也是第一个被发现的 ChPs 本研究重组表达可溶蛋白 Ls-ChP, 得到其晶体, 旨在为研究 nchrs 的结构和功能及其药理学机制提供结构模板 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 载体及基因静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白基因根据 NCI 提供的序列 (Genank number F364899.1) 设计而成, 由上海生工公司合成, 并测序, 在两端分别引入 amh I Xho I 酶切位点 大肠杆菌 (E. coli)dh5α, 转化用大肠杆菌宿主菌 DH10ac 表达载体 pfastac1 昆虫细胞 Sf9 (Spodoptera frugiperda) 由本实验室保存 1.1.2 酶和试剂限制性内切酶 amh I Xho I, PCR 所用的 dntp 和 Taq 酶,DN Marker(DI5000), T4 DN 连接酶等为 NE 公司产品 IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside, 异丙基硫代 -β-d- 半乳糖苷 ), 氨苄青霉素 (mpicillin), 还原剂 DDT (2- 巯基苏糖醇 ), 蛋白质 Marker 购自上海生工公司 ; 其他试剂均为国产分析纯 昆虫细胞培养基 (Insect Xpress) 购自 Lonza 公司 转染试剂脂质体 Cellfectin Ⅱ 为 Invitrogen 公司产品 PEG/Ion1,PEG/ Ion2,Index,Cystal Scree,SalRX 结晶池液试剂购自 HMPTON RESERCH 公司 1.2 方法 1.2.1 构建表达载体 Ls-ChP 基因与经限制性内切酶 amh I 和 Xho I 双酶切后的 pfastac1 载体进行连接, 将鉴定正确的重组质粒 pfastac1-ls- ChP 转化到 E. coli DH10ac 中, 转化产物进行蓝白斑筛选, 利用白斑扩增得到 acmid 1.2.2 acmid 的转染转染前, 先将处于对数生长期的大约密度为 2 10 6 个 /ml Sf9 细胞, 均匀放置 于平板中, 每个孔中加入 2 ml 培养基,27 静置 1 h, 让细胞贴壁, 在显微镜下观察到细胞要 80% 铺满平板 同时准备以下溶液, 溶液 : 把 5 μl 重组 Ls-ChP/ac 加到 100 μl 的昆虫细胞培养基, 混匀 溶液 : 每次转染, 把 8 μl 脂质体 Cellfectin Ⅱ 加到 100 μl 的培养基中, 混匀 再把溶液 加入到溶液 中混合, 在室温孵育 30 min 弃去平板中的培养基, 注意不要吸出细胞 加入 2 ml 培养基到脂质体 Cellfectin Ⅱ 与 Ls-ChP/ac 混合液中, 混匀后移至 Sf9 细胞表面,27 培养 5 h 弃去脂质体 Cellfectin Ⅱ 与 Ls-ChP/ac 混合液, 向细胞中加入 8 ml 培养基,27 潮湿条件孵育 7 d 后, 提取 P1 病毒株, 把 P1 病毒株按 1 500 扩增,5 d 后获得 P2 病毒株, 同样方法获得 P3 病毒株 1.2.3 重组蛋白的表达用 P3 病毒感染处于对数生长期的 Sf9 细胞 ( 大约细胞密度为 2 10 6 个 /ml), 接种量为 1 100, 摇床转速为 100 r/min, 温度为 27,48 h 后收获蛋白 1.2.4 重组蛋白分离纯化和鉴定由于蛋白为分泌表达, 所以将培养基与细胞混和物 3 000 r/min 离心 15 min 后, 取上清浓缩后换溶液, 溶液为 50 mmol/l NaCl,50 mmol/l Tris(pH8.0) 再高速 13 000 r/min 离心 30 min 后, 挂镍柱, 用 300 mmol/l 的咪唑冲洗 最后用凝胶色谱 (KT,spudex200 柱 ) 纯化, 流动相为 50 mmol/l NaCl,50 mmol/l Tris(pH8.0), 流速为 0.5 ml/min 1.2.5 Ls-ChP 的蛋白结晶将纯化的 Ls-ChP 浓缩至约 10 mg/ml 使用坐滴蒸气扩散法在 291 k 长晶体 在 96 孔板中, 用 HMPTON RESERCH 试剂 PEG/Ion1,PEG/Ion2,Index,Cystal Scree,Sal trx 当池液, 用机器人 CRYSTL GRYPHON(rt robbins instrusmets) 点样, 将浓缩蛋白与池液 1 1 混合点坐滴, 点样量为 0.15 μl, 在显微镜下观察晶体生长 [8,9] 2 结果 2.1 构建表达载体 Ls-ChP 基因 N 端带有前导肽, 能够指导它分泌表达, 前导肽的序列为 MRRNIFCLCLWIVQ- CLS Ls-ChP 基因 C 端带有 6 His, 有利于它的
生物技术通报 iotechnology ulletin 128 M 分离纯化 将带有前导肽的 Ls-ChP-His 经限制性 5000 3000 2000 进行连接 得到 pfastac 1-Ls-ChP 载体 图 1 Ls-ChP precursor Ls-ChP C-terminal 6 His-tag 1000 750 SV40-P 100 1 重组质粒 -pfastac 1-Ls-ChP 用 amh I Xho I 双酶切 菌 按 1 100 的比例转接于 100 ml 含氨苄青霉素 验证 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析 图 2 表明 所切下的目的片段 Ls-ChP 与预期大小 708 bp 一 致 说明表达载体构建成功 将重组质粒送上海生 工公司测序 并用 NCI ORF finder 分析测序结果 分析结果 图 3 表明目的基因 Ls-ChP 已正确插 入到 pfastac 1 中 开放阅读框正确 将 鉴 定 正 确 的 重 组 质 粒 pfastac 1-Ls-ChP Ls-ChP1 250 把 含 载 体 pfastac 1-Ls-ChP 的 E. coli DH5α 用限制性内切酶 amh I 和 Xho Ⅰ进行双酶切再次 pfastac 1 500 图 1 C 端带 6 His-tag 的 pfastac 1-Ls-ChP 昆虫表 达载体构建图 的培养基中 37 振荡培养过夜 提取表达质粒 1 bp 内切酶 amh I 和 Xho Ⅰ双酶切的 pfastac1 载体 Gentamicin PPH 2014年第8期 M DN marker 5000 图 2 重组质粒 pfastac 1-Ls-ChP 用 amh I Xho I 双酶切鉴定 的质粒 并用 0.5% 琼脂糖凝胶电泳 图 4 鉴定 acmid 在点样口附近 Heper 质粒在中间 pfastac 1-Ls-ChP 在最下面 约 5 000 bp 处 2.2 Ls-ChP融合蛋白在ac-to-ac系统中的表 达与纯化 将 bacmid 扩增和纯化后 用脂质体 Cellfectin Ⅱ 转 化 到 E. coli DH10ac 中 在 Heper 质 粒 的 帮 助 把 acmid 转染进入 Sf9 细胞 得到 P1 第一代病毒 下 pfastac 1-Ls-ChP 质 粒 中 Ls-ChP 基 因 重 将 P1 传代为 P2 第 2 代病毒 再传代为 P3 第 3 代病毒 组到 acmid 中 产物经蓝白斑筛选 将鉴定正确的 从而获得高滴度的病毒株 用 P3 病毒株去感染大约 白斑菌落扩增后 用碱裂解法提取 E. coli DH10ac 密度为 2 106 个 /ml Sf9 细胞 接种比例为 1 100 阴影部分表示前导肽的序列 图 3 NCI ORF finder 分析重组 Ls-ChP 基因序列及相应的蛋白序列
129 林波等 静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在 ac-to-ac 系统中的表达 纯化与结晶 2014年第8期 pfastac 1 -Ls-ChP1 acmid 1500 mu 1000 Helper M C 500 0 1 0 bp acmid Helper 5000 kd 116 M 5 10 15 ml R R RC 20 25 30 C 66 pfastac 1-Ls-ChP1 45 3000 2000 35 1000 750 25 18 转化重组质粒 pfastac 1-Ls-ChP 的 E. coli DH10ac 琼脂糖凝胶 14 电泳分析 DH10ac 中的质粒 1 acmid 在点样口附近有个弯月的形状 Helper 质粒在中间 重组质粒 -pfastac 1-Ls-ChP 在最下面 约 5 000 bp 处 rls-chp 的凝胶色谱图 SDS-PGE 分析图 中原始状态的片段 M DN marker 5000 C 和还原状态的 R R RC 片段 M 蛋白分子量 marker 图 4 琼脂糖凝胶电泳鉴定 DH10ac 中的 cmid 27 培养 60 h 后 离心收集其上清 分泌的重组蛋 图5 2.3 白 Ls-ChP 的 C-端带 6 His 标签 所以用镍柱初 步纯化其上清液 纯化和鉴定分泌表达的重组蛋白 Ls-ChP rls-chp的蛋白结晶 将纯化的 rls-chp 浓缩至约 10 mg/ml 使用 坐滴蒸气扩散法在 291 k 长晶体 点完晶体后 3 d 分泌表达的上清液经镍柱初步纯化后 进一步 观察到晶体生长出来 图 6 机器人筛选出长晶体 用凝胶色谱法纯化 图 5- 显示 Ls-ChP 的凝胶 的池液的配比如下 0.05 mol/l 的柠檬酸 0.05 mol/l 纯化色谱 Ls-ChP 的出峰位置在 12.5 ml 根据 is-tris-三丙烷 ph 为 5.0 16 W/V PEG3350 Superdex200 柱 GE Healthcare 的说明 峰位置为 12.5 ml 表示大约为 130 kd 的相对分子量 从 不 同 的 峰 位 置 -DC 收 集 组 分 作 进 一 步 的 SDS-PGE 分析 图 5- 图 5- 中 -C 是重组蛋 白 Ls-ChP 原 始 状 态 时 的 SDS-PGE 胶 图 SDS- 1 mm PGE 分 析 上 样 时 没 有 加 还 原 剂 和 煮 沸 样 品 RRC 所示是还原状态的 SDS-PGE 胶图 即上样时 加还原剂 DDT 和煮沸样品样 5 min C 条 带 在 SDS-PGE 胶 顶 部 图 5- 利用图 5- 中的出峰片段 -C 长晶体 生长 3 d 后得到的晶体图 图6 显示它们原始状态形成五聚体 相对分子量约为 130 kd 结果与凝胶色谱法出峰位置在 12.5 ml 一致 R R 和 RC 的条带在 SDS-PGE 胶中 分子量约 为 26 kd 正好是表达出来的重组蛋白五聚体分子 量的 1/5 表示它们的还原状态为单体 3 rls-chp 蛋白晶体 讨论 已知 Ls-ChP 基因 cdn 序列开放阅读框长 度为 690 bp 包括前导肽 编码 230 个氨基酸 由
130 生物技术通报 iotechnology ulletin 2014 年第 8 期 氨基酸序列推断的基因编码蛋白的等电点为 4.9, 相对分子质量为 26 kd [7] 本研究将 Ls-ChP-6 His 基因开放阅读框序列 (708 bp, 含 6 个组氨酸 ) 克隆到 pfastac 1 载体中, 成功构建出表达质粒 pfastac 1-Ls-ChP-6 His, 转化 E. coli DH10ac, 并转染 Sf9 细胞, 纯化后得到五聚体蛋白, 还原后的相对分子量约为 26 kd, 与预先设计的理论相对分子量相符 在构建表达载体时, 将 His-tag 连接在 Ls-ChP 蛋白序列的 C- 端, 产生 6 His 融合表达载体, 主要是便于利用亲和层析镍柱进行纯化, 大 [7] 大提高了纯化效率 Hansen 等在哺乳动物细胞 (HEK 细胞 ) 表达了 C 端带有 His-tag, 和不带 Histag 的 Ls-ChP, 它们也形成五聚体, 通过与不同配体结合, 证明了带 His-tag 和不带 His-tag 的 Ls- ChP 活性相似 但是, 在哺乳动物细胞里表达 Ls-ChP 容易被糖基化而不易得到蛋白晶体 已知与 nchrs 结合的激动剂和竞争性拮抗剂如乙酰胆碱, 尼古丁, 筒箭毒碱和 α- 银环蛇毒素,α- 芋螺毒素等都可与 ChPs 结合 ChPs 是水溶性蛋白, 较易得到晶体, 而且它们的晶体结构和特性与 nchrs 的胞外配体结合结构域相似, 具有同源五聚体结构 [10-14] 本研究利用 ac-to-ac 系统成功表达了可溶性 Ls-ChP 蛋白, 并得到了蛋白晶体 该研究方法和结果为后续研究 ChPs 与其特殊配体进行共结晶提供了前提和奠定物质基础 可以用毒素或药物泡在已得到的晶体中, 或者把毒素或药物与蛋白按一定的摩尔比混合点样, 可得到共同结晶体, 然后收集 X-ray 晶体数据, 分析受体 - 配体之间相互作用的机制及其药理学关系 为开发治疗与 nchrs 相关的疾病药物设计奠定理论基础 [15-18] 2014 年是晶体学年, 是晶体学创始人之一劳厄获得诺贝尔奖 100 周年, 可以预期, 在随后的几年里, 晶体学的研究将进入一个新的高潮,ChPs 与不同的药物共结晶的研究也将是这个高潮中的一个亮点 4 结论成功在 ac-to-ac 昆虫表达系统中高效表达静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白 (Ls-ChP), 经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白 Ls-ChP 进行纯化, 得到其具有活性的五聚体, 并用机器人进行结晶筛选获 得该蛋白晶体 致谢 : 感谢清华大学生命科学学院王新泉教授指导与帮助 参考文献 [1]uchapudi K, Xu X, taian Y, et al. Micromechanical measurement of ChP binding for label-free drug discovery[j]. nalyst, 2011, 137(1):263-268. [2]rejc K, Smit, Sixma TK, et al. Crystal structure of Chbinding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors[j]. Nature, 2001, 411 :269-276. [3]Haga K, Kruse C, sada H, et al. Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist[j]. Nature, 2012, 482(7386):547-551. [4]uchapudi K, Xu X, taian Y, et al. Micromechanical measurement of ChP binding for label-free drug discovery[j]. nalyst, 2011, 137(1):263-268. [5]Kombo DC, Mazurov, Tallapragad K, et al. Docking studies of benzylidene anabaseine interactions with α7 nicotinic acetylcholine receptor(nchr)and acetylcholine binding proteins(chps): application to the design of related α7 selective ligands[j].eur J Med Chem, 2011, 46(11):5625-5635. [6]Turabekova M, Rasulev F, Dzhakhangirov FN, et al. conitum and Delphinium alkaloids of curare-like activity. QSR analysis and molecular docking of alkaloids into ChP[J]. Eur J Med Chem, 2010, 45(9):3885-3894. [7]Hansen S, Talley TT, Radic Z, et al. Structural and ligand recognition characteristics of an acetylcholine-binding protein from plysia californica[j]. J iol Chem, 2004, 279 :24197-24202. [8]Wang D, Zhang S, Li L, et al. Structural insights into the assembly and activation of IL-1 β with its receptors[j]. Nature Immunology, 2010, 11 :905-911. [9]Wang N, Shi X, Jiang L, et al. Structure of MERS-CoV spike receptorbinding domain complexed with human receptor DPP4[J]. Cell Research, 2013, 23 :986-993. [10]Se' astien D, Chris U, Regina, et al. ChP-targeted a-conotoxin correlates distinct binding orientations with nchr subtype selectivity[j]. The EMO Journal, 2007, 26 :3858-3867. [11]Ulens C, Hogg RC, Celie PH, et al. Structural determinants of
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