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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (11): 1765 1769 1765 UHPLC-MS/MS 法同时测定人血浆中 7 种苯二氮䓬类镇静催眠药的浓度 于红燕, 刘国如, 崔玉静, 王 * 伟, 李清艳 ( 中国民用航空局民用航空医学中心, 民航总医院, 民航医学研究所, 北京 100123) 摘要 : 建立同时测定人血浆中 7 种苯二氮䓬类镇静催眠药浓度的方法 以西酞普兰为内标, 血浆经乙腈沉淀蛋白后进样分析 色谱柱为 CORTECS UHPLC C 18 柱 (2.1 mm 100 mm, 1.6 μm), 流动相为含 0.01% 甲酸水溶液 含 0.01% 甲酸甲醇溶液, 流速为 0.3 ml min 1, 电喷雾离子源, 用多反应监测, 结合正离子分段扫描分析 咪达唑仑 硝西泮 艾司唑仑 氯硝西泮 劳拉西泮 三唑仑和地西泮浓度分别在 1.05~840 (r = 0.999 4) 2.06~824 (r = 0.998 1) 2.02~1 616 (r = 0.994 7) 6.18~2 472 (r = 0.997 9) 6.12~2 448 (r = 0.997 4) 3.02~2 416 (r = 0.990 2) 1.02~816 (r = 0.998 8) ng ml 1 内线性关系良好 最低检出限分别为 0.02 0.52 0.51 1.55 0.77 0.76 和 0.02 ng ml 1 日内 日间精密度 (RSD) 均 < 10.81%; 提取回收率均在 81.46%~106.53% 内 该方法成功用于临床患者血液样本分析 关键词 : 苯二氮䓬类药物 ; 人血浆 ; UHPLC-MS/MS; 血药浓度 ; 含量测定中图分类号 : R917 文献标识码 : A 文章编号 : 0513-4870 (2016) 11-1765-05 Simultaneous determination of 7 benzodiazepines in human plasma by UHPLC-MS/MS YU Hong-yan, LIU Guo-ru, CUI Yu-jing, WANG Wei, LI Qing-yan * (Institute of Aviation Medicine, Civil Aviation Medicine Center, Civil Aviation Administration of China, Civil Aviation General Hospital, Beijing 100123, China ) Abstract: The study was designed to develop the method for determination of 7 benzodiazepines concentration in human plasma. UHPLC-MS/MS was adopted to analyze plasma with protein precipitated by acetonitrile. Citalopram was used as an internal standard. Plasma samples were separated on CORTECS UHPLC C 18 column with the mobile phase of aqueous solution (0.01% formic acid) methanol (0.01% formic acid) at a flow rate of 0.3 ml min 1. Multiple reaction monitoring (MRM) mode was performed in combiation with electrospray ionization source operating in the positive ionization mode. The liner calibration curve of midazolam, nitrazepam, estazolam, clonazepam, lorazepam, triazolam and diazepam were obtained in the concentration range of 1.05 840 (r = 0.999 4), 2.06 824 (r = 0.998 1), 2.02 1 616 (r = 0.994 7), 6.18 2 472 (r = 0.997 9), 6.12 2 448 (r = 0.997 4), 3.02 2 416 (r = 0.990 2), 1.02 816 (r = 0.998 8) ng ml 1, respectively. The lowest detection limit were 0.02, 0.52, 0.51, 1.55, 0.77, 0.76, 0.02 ng ml 1, respectively. The RSD of inter-day and intra-day were less than 10.81%. The relative recovery was 81.46% 106.53%. The method was successfully applied to clinical analysis of blood samples from patients. Key words: benzodiazepines; human plasma; UHPLC-MS/MS; plasma concentration; quantitative analysis 收稿日期 : 2016-07-22; 修回日期 : 2016-08-27. 基金项目 : 民航科技基金资助项目 (MHRD201235). * 通讯作者 Tel: 86-10-85762630, E-mail: qingyan.ye.li@gmail.com DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-0732

1766 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (11): 1765 1769 苯二氮䓬类药物在临床上具有多种治疗作用, 包括镇静催眠 抗焦虑 肌肉松弛及抗惊厥等, 此类 药物是临床上最常用的镇静催眠药 [1 3], 应用过量会 导致神经肌肉阻滞, 甚至引起死亡, 这增加了自杀以 及潜在的成瘾和滥用的犯罪案件的发生, 是急诊药 物中毒的常见药物, 此外, 此类药物的使用导致行为 能力的下降是影响驾驶安全的主要因素, 同时测定 生物基质中苯二氮䓬类药物一直是临床医生 法医毒 理学家及交通领域学者关注的问题 [4] 目前, 文献报道苯二氮䓬类药物检测方法有 GC-MS 法, 但是, 由于许多苯二氮䓬类药物是极性且 非挥发性化合物, 因此, 不适于采用这种方法进行多 [5 8] 成分分析 ; 也有文献报道采用 HPLC 法 反相高 效液相色谱法 液相色谱 串联质谱法分析该类药物, 其中样本前处理大多采用液液萃取或固相萃取法, 提取过程复杂 费时 本研究拟建立一种样品处理简 便 高灵敏 高准确性的超高效液相色谱 质谱联用 法 (UHPLC-MS/MS), 同时测定血浆中咪达唑仑 硝 西泮 艾司唑仑 氯硝西泮 劳拉西泮 三唑仑和地 西泮共 7 种苯二氮䓬类药物的浓度, 为临床治疗抢救 刑事案件的侦破及药物影响驾驶安全提供参考方法 材料与方法 药品与试剂 氢溴酸西酞普兰对照品 ( 纯度 99.8%, 批号 : 100790-200501) 地西泮对照品 ( 纯 度为 99.9%, 批号 : 171225-201304) 艾司唑仑对照品 ( 纯度为 99.7%, 批号 : 171219-201003) 马来酸咪达唑 仑对照品 ( 纯度为 99.8%, 批号 : 171250-201002) 劳 拉西泮对照品 ( 纯度 99.8%, 批号 : 171253-201102) 氯硝西泮对照品 ( 纯度为 99.7%, 批号 : 171227-201404) 硝西泮对照品 ( 纯度为 99.9%, 批号 : 171227-201403) 三唑仑对照品 ( 纯度为 99.7%, 批号 : 171230-201203), 购自中国食品药品检定研究院 ; 甲醇和甲酸均为色谱 纯 ; 去离子水由美国 Millipore 公司 Milli-Q Advantage A10 超纯水系统制备 仪器 Acquity TM TQ MS 质谱仪 ( 配有三重四极 杆质量分析器 ) 和 Masslynx 4.1 分析软件 ( 美国 Waters 公司 ) Acquity TM UHPLC 超高效液相色谱仪 ( 配有二元梯度洗脱泵, 自动进样器和在线脱气机 ) 色谱条件 色谱柱为 Waters CORTECS UHPLC C 18 柱 (2.1 mm 100 mm, 1.6 μm); 流动相为含 0.01% 甲酸水溶液 含 0.01% 甲酸甲醇溶液 (0~7 min, 60 40 10 90; 7~8 min, 10 90; 8~8.1 min, 10 90 60 40; 8.1~11 min, 60 40); 流速为 0.3 ml min 1 ; 柱温 : 40 ; 进样室温度 10 ; 进样体积 3 μl 质谱条件离子源为电喷雾离子源 (ESI 源 ), 离子源温度 120, 采用多反应监测, 结合正离子分段扫描分析 ; 咪达唑仑 西酞普兰 ( 内标 ) 三唑仑 劳拉西泮 氯硝西泮 艾司唑仑 硝西泮和地西泮的锥孔电压 (cone voltage) 分别为 38 64 54 30 50 46 44 和 48 V, 碰撞能量 (CE) 分别为 26 24 24 20 18 26 24 和 28 V, 正离子扫描分析 ; 用于定量分析检测的离子分别为 m/z 325.98 291.06 m/z 325.13 109.04 m/z 343.01 308.02 m/z 320.98 275.02 m/z 316.01 270.04 m/z 295.04 267.01 m/z 282.05 236.04 和 m/z 285.04 154.04 储备液 工作液和质控样品的制备分别精密称取 7 种对照品约 1 mg 分置于 10 ml 量瓶中, 各加入 10 ml 甲醇制备成质量浓度约为 1.0 mg ml 1 的标准储备液, 精密量取上述各贮备液适量, 置同一量瓶中, 加甲醇定容, 摇匀, 即得混合对照品溶液, 随后用甲醇梯度稀释混合对照品溶液, 制得系列混合标准工作液 另外分别量取上述各贮备液适量, 制备上述对照品质控样品 (QC) 储备液, 然后用甲醇梯度稀释获得低 中 高浓度的 QC 样品 精密称取适量西酞普兰加入甲醇制备成 1.003 mg ml 1 的内标标准储备液, 精密量取内标标准储备液于量瓶中以甲醇稀释至 2.006 μg ml 1 的内标工作液 在空白血浆中加入不同质量浓度的 7 个化合物的对照品溶液和内标液, 配制成一系列质量浓度的质控血浆样品 血浆样品的处理量取血浆样品 200 μl, 置于 1.5 ml 塑料离心管中, 加入内标工作液 5 μl 涡旋混合 30 s 加入乙腈 600 μl, 涡旋混合 60 s, 4 1.2 10 4 r min 1 离心 10 min, 取上清液 3 μl 进行 LC-MS/MS 分析 标准曲线取空白血浆 200 μl, 分别依次加入各浓度混合标准工作溶液 10 μl 和内标液 5 μl, 配制成一系列质量浓度的标准曲线血浆样品 按 血浆样品的处理 项下操作, 以待测物质量浓度 (X) 为横坐标, 待测物和内标峰面积的比值 (Y) 为纵坐标, 其加权 (1/X) 线性回归后, 所得的直线回归方程即为标准曲线 每天建立标准曲线, 连续 3 天 专属性取 6 个不同来源的人空白血浆样品, 混合均匀后取 200 μl, 不加内标, 直接加入乙腈 600 μl, 按 血浆样品的处理 项下操作 另配制 7 种定量下限浓度的血浆样品, 加入内标工作液后同法处理分析 (n = 3), 考察专属性 精密度与准确度取空白人血浆, 配制 7 个化合

于红燕等 : UHPLC-MS/MS 法同时测定人血浆中 7 种苯二氮卓类镇静催眠药的浓度 1767 物的定量下限 低 中 高质量浓度的 QC 样品, 按 血浆样品的处理 项下操作 每质量浓度 5 份同日测定, 连续测定 3 天 以当日的随行标准曲线计算样品的测定质量浓度, 与配制的质量浓度对照, 求得本方法的精密度与准确度 基质效应取 6 种不同来源的空白人血浆 200 μl, 经乙腈沉淀蛋白得到空白血浆提取液, 分别向其加入 7 种化合物对照品溶液适量和内标溶液 (2.006 μg ml 1 西酞普兰, 5 μl), 制备成低 中 高质量浓度的质控样品, 得到的色谱峰面积与相应质量浓度的标准溶液直接进样获得的色谱峰面积比较, 计算本方法的基质效应 提取回收率取空白人血浆, 配制 7 个化合物的低 中 高质量浓度的质控样品, 按 血浆样品的处理 项下操作 每质量浓度 5 份同日测定, 连续测定 3 天 将质控样品与空白血浆提取后加入对照品溶液 后进样测得的峰面积相比, 考察方法的提取回收率 稳定性配制 7 个化合物低 中 高浓度的质控样品, 考察室温 (24 ) 放置 8 h 冰箱 (4 ) 放置 24 h 20 冰箱冷冻放置 30 天 反复冻融 3 次 ( 20 ) 和进样器内 (10 ) 放置 24 h 等 5 种条件下的稳定性, 每次处理均对低 中 高 3 种质控浓度各 5 份样品进行分析 方法学应用临床试验经民航总医院伦理委员会批准, 受试者签署知情同意书后, 对 2 例服用镇静催眠药的临床患者血液样本进行了分析 以当日的随行标准曲线计算样品的测定质量浓度, 再换算成样品的血药浓度 结果 1 质谱分析苯二氮䓬类镇静催眠药结构中含有碱性氮原子, Figure 1 The chemical structures, parent ion and product ion spectra of midazolam (A), citalopram (B), triazolam (C), lorazepam (D), clonazepam (E), estazolam (F), nitrazepam (G) and diazepam (H)

1768 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (11): 1765 1769 质谱电离时易获得质子, 优先选择正离子监测模式, 在此模式下, 咪达唑仑 西酞普兰 三唑仑 劳拉西泮 氯硝西泮 艾司唑仑 硝西泮和地西泮主要生成 [M+H] + 峰, 分别为 m/z 325.98 325.13 343.01 320.98 316.01 295.04 282.05 285.04 选择性对 [M+H] + 峰进行产物离子扫描分析, 生成的主要碎片离子分别为 m/z 291.06 109.04 308.02 275.02 270.04 267.01 236.04 和 154.04 ( 图 1) 在此基础上, 对碰撞能量和锥孔电压进行优化 2 方法学验证 2.1 专属性西酞普兰 咪达唑仑 硝西泮 艾司唑仑 氯硝西泮 劳拉西泮 三唑仑和地西泮的保留时间分别为 1.79 2.13 3.15 3.45 3.19 3.73 3.68 和 4.61 min; 血浆中内源性物质不干扰以上化合物的测定, 见图 2 2.2 标准曲线与定量下限咪达唑仑 硝西泮 艾司唑仑 氯硝西泮 劳拉西泮 三唑仑和地西泮的回归方程分别为 Y = 0.021 X + 0.004 8 (r = 0.999 4) Y = 0.025 X + 0.000 32 (r = 0.998 1) Y = 0.017 X 0.020 (r = 0.994 7) Y = 0.007 0 X 0.003 2 (r = 0.997 9) Y = 0.007 0 X 0.020 (r = 0.997 4) Y = 0.018 X 0.031 (r = 0.990 2) Y = 0.026 X + 0.001 2 (r = 0.998 8) 其质量浓度分别在 1.05~840 2.06~824 2.02~1 616 6.18~2 472 6.12~ 2 448 3.02~2 416 和 1.02~816 ng ml 1 内线性关系良好, 定量下限分别为 1.05 2.06 2.02 6.18 6.12 3.02 和 1.02 ng ml 1 最低检出限分别为 0.02 0.52 0.51 1.55 0.77 0.76 和 0.02 ng ml 1 2.3 精密度与准确度本方法的精密度与准确度结果见表 1 2.4 基质效应结果表明, 各待测化合物低 中 高质量浓度的的基质效应均在 82.34%~109.87%, RSD < 9.36%; 内标西酞普兰的基质效应值为 (112.45 ± 10.08) %, RSD 为 8.96% 2.5 提取回收率结果表明, 7 个化合物的相对提取回收率均在 81.46%~106.53%; 内标西酞普兰的相对提取回收率为 102.60%, RSD 为 7.25% 2.6 稳定性室温 (24 ) 放置 8 h 冰箱 (4 ) 放置 24 h 20 冰箱冷冻放置 30 天 反复冻融 3 次 ( 20 ) 和进样器内 (10 ) 放置 24 h 条件下的稳定性结果表明, 准确度 RE% 分别在 2.12%~10.93% 2.87%~8.94% 3.77%~2.18% 5.36%~8.74% 2.38%~6.58% 之间 3 方法学应用对两例服用镇静催眠药的临床患者血液样本进 Figure 2 Representative chromatograms of citalopram, midazolam, nitrazepam, estazolam, clonazepam, lorazepam, triazolam and diazepam. A: Blank plasma; B: Blank plasma spiked with citalopram (50 ng ml 1 ), midazolam (LLOQ, 1.05 ng ml 1 ), nitrazepam (LLOQ, 2.06 ng ml 1 ), estazolam (LLOQ, 2.02 ng ml 1 ), clonazepam (LLOQ, 6.18 ng ml 1 ), lorazepam (LLOQ, 6.12 ng ml 1 ), triazolam (LLOQ, 3.02 ng ml 1 ) and diazepam (LLOQ, 1.02 ng ml 1 ) 行了分析 以当日的随行标准曲线计算样品的测定质 量浓度, 再换算成样品的血药浓度 测定结果为 : 咪 达唑仑, 161.79 ± 6.23 ng ml 1, RSD 为 3.85%; 地西泮, 441.75 ± 33.66 ng ml 1, RSD 为 7.62% 讨论 本研究采用乙腈沉降蛋白处理血浆, 处理方法 简单 快速, 测得各化合物的最低检出限均较低, 且 准确度 精密度和提取回收率良好 苯二氮䓬类药物 结构中含有碱性氮原子, 在酸性条件下容易质子化, 本研究在流动相中加入低浓度甲酸, 提高待测物的 质子化效率, 改善峰形 [9] 由于此类药物结构和性质

于红燕等 : UHPLC-MS/MS 法同时测定人血浆中 7 种苯二氮卓类镇静催眠药的浓度 1769 Table 1 The precision and accuracy of midazolam, triazolam, lorazepam, clonazepam, estazolam, nitrazepam and diazepam in human plasma. n = 6, x ± s Compound Concentration/ng ml 1 Precision (RSD)/% Spiked Measured Intra-day Inter-day Accuracy (RE)/% Midazolam 1.05 1.13 ± 0.18 6.24 9.38 7.62 3.15 3.05 ± 0.26 8.49 6.49 3.17 315 306.28 ± 14.01 4.57 10.81 2.77 630 651.36 ± 24.19 3.71 9.02 3.39 Triazolam 3.02 2.94 ± 0.32 5.19 7.23 2.65 9.06 8.86 ± 0.47 5.42 7.76 2.24 906 904.00 ± 32.85 3.63 8.96 0.25 1 812 1 768.85 ± 85.28 4.82 9.01 2.41 Lorazepam 3.06 3.27 ± 0.25 3.49 7.84 6.86 9.18 9.86 ± 0.14 1.43 8.38 7.48 918 946.44 ± 58.67 6.20 8.38 3.10 1 836 1 926.64 ± 39.76 2.06 8.57 4.94 Clonazepam 3.09 2.92 ± 0.18 4.69 6.35 5.50 9.27 9.94 ± 0.47 4.74 5.78 7.23 927 903.46 ± 18.81 2.08 7.69 2.54 1 854 1 831.82 ± 23.54 1.29 6.48 1.20 Estazolam 2.02 1.97 ± 0.16 3.98 7.47 2.48 6.06 6.12 ± 0.22 3.54 7.67 0.99 606 572.62 ± 17.52 3.06 6.89 5.51 1 212 1 269.12 ± 15.27 1.20 7.61 4.71 Nitrazepam 1.03 0.98 ± 0.07 3.28 7.27 4.85 3.09 3.12 ± 0.15 4.75 8.61 0.97 309 303.96 ± 8.17 2.69 8.09 1.63 618 631.2 ± 13.98 2.21 6.82 2.14 Diazepam 1.02 1.06 ± 0.12 3.87 5.92 3.92 3.06 3.02 ± 0.23 7.63 6.34 1.42 306 290.92 ± 4.64 1.60 7.03 4.93 612 622.6 ± 14.99 2.41 5.35 1.73 相似, 保留时间相近, 因此采用梯度洗脱使各化合物 获得良好的峰形和足够的响应 此外, 本研究结合人 [10] 体有效血药浓度确定线性范围, 该范围比 [7] Nakamura 等研究中同类药物的范围宽 本研究也 从专属性 线性关系 回收率 基质效应 稳定性等 各方面对方法进行了验证, 符合生物样品测定相关 要求 [11 13], 可用于临床中毒抢救 刑事案件的侦破及 药物影响驾驶安全研究 References [1] McCall WV. A psychiatric perspective on insomnia [J]. J Clin Psychiatry, 2001, 62 (Suppl 10): 27 32. [2] Brett J, Murnion B. Management of benzodiazepine misuse and dependence [J]. Aust Prescr, 2015, 38: 152 155. [3] Chen XQ, Jin YY, Tang G. New Edited Materia Medica ( 新 编药物学 ) [M]. Beijing: People s Health Publishing House, 2002: 169. [4] Jiang ZL, Tan JY, Yao LJ, et al. Screening analysis of benzodiazepine medicines and selected metabolites in plasma and urine using gas chromategraphy with nitrogen phosphorus detection [J]. J Anal Sci ( 分析科学学报 ), 2005, 6: 639 642. [5] Wang LM. Rapid determination of plasma concentrations of four commonly used sedative hypnotics by solid phase extraction- HPLC [J]. Proc Clin Med ( 临床医药实践 ), 2004, 4: 303 304. [6] Liang XH, Dai ZY, Liu WE. Simultaneous determination of 5 sedative hypnotics in human plasma by reversed phase high-performance liquid chromatography [J]. J Cent South Univ (Med Sci) ( 中南大学学报医学版 ), 2009, 7: 689 693. [7] Nakamura M, Ohmori T, Itoh Y, et al. Simultaneous determination of benzodiazepines and their metabolites in human serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a high-resolution octadecyl silica column compatible with aqueous compounds [J]. Biomed Chromatogr, 2009, 23: 357 364. [8] Lee HH, Lee JF, Lin SY, et al. Simultaneous quantification of urine flunitrazepam, nimetazepam and nitrazepam by using liquid chromatography tandem mass spectrometry [J]. Clin Chim Acta, 2013, 420: 134 139. [9] Zhao Y, Wang L, Bao Y, et al. A sensitive method for the detection and quantification of ginkgo flavonols from plasma [J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2007, 21: 971 981. [10] Schulz M, Iwersen-Bergmann S, Andresen H, et al. Therapeutic and toxic blood concentrations of nearly 1 000 drugs and other xenobiotics [J]. Crit Care, 2012, 16: R136. [11] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the the People s Republic of China ( 中华人民共和国药典 ) [M]. Vol II. 2015 ed. Beijing: China Medical Science Press, 2015: Appendix XIX B. [12] US Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation (draft) [S/OL]. 2013 [2016-07-22]. http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecom plianceregulatoryinformation/guidances/ucm368107. [13] European Medicines Agency. Guideline on Bioanalytical Method Validation [S/OL]. 2011 [2016-07-22]. http://www. ema.europa.eu/docs/en_gb/document_library/scientific_guide line/2011/08/wc500109686.pdf.