技术手册 上海普洛麦格生物产品有限公司 Eastep Super 总 RNA 提取试剂盒 (Eastep Super Total RNA Extraction Kit) 产品目录号 LS1040
目 录 产品描述... 1 试剂盒组分... 1 储存条件... 1 试剂配制... 1 预防 RNase 污染的注意事项... 2 不同细胞的破碎方法... 2 不同样品最适起始用量... 3 RNA 分离纯化流程图... 4 从动物组织中提取 RNA... 5 从贴壁或悬浮细胞中提取 RNA... 6 从植物组织中提取 RNA... 8 从革兰氏阳性 ( 枯草杆菌 ) 和革兰氏阴性 ( 大肠杆菌 ) 细菌中提取 RNA... 10 不同材料提取 RNA 的得率... 11 常见问题及解决办法... 12 附录... 13 PBS 缓冲液 (10 ), ph7.4... 13 胰蛋白酶 -EDTA 溶液 (1 )... 13 1 TE 缓冲液,pH8.0... 13
产品描述 RNA 的纯度和完整性在 RT-PCR qrt-pcr RNase 保护 Northern Blot 体外翻译和微阵列分析等分子生物学实验中至关重要 近年来,RT-PCR 和 qrt-pcr 已经发展成定性 定量分析某些特定 mrna 的有力工具 随着基因扩增技术的不断成熟, 从组织 培养细胞等小量样本中快速纯化得到无基因组 DNA 污染的高质量 RNA 的需求越来越迫切, Eastep Super 总 RNA 提取试剂盒也因此应运而生 Eastep Super 总 RNA 提取试剂盒 (LS1040) 为客户提供了一套从动物组织 植物组织 培养细胞 细菌中小量纯化高质量 完整总 RNA 的解决方案 该试剂盒采用独特的细胞裂解系统, 无需使用苯酚 氯仿等有害物质, 通过离心柱硅基质膜高效 专一地吸附核酸分子, 再经 DNA 酶处理去除基因组 DNA 的污染, 最终得到高纯度的总 RNA 本产品具有高效 快速 方便的特点, 单个样品提取纯化一般可在 30 分钟内完成 使用该试剂盒纯化获得的 RNA, 不但纯度高, 而且基本无 DNA 和影响下游应用酶反应的杂质残留 试剂盒组分目录号 名称 规格 LS1040 Eastep Super Total RNA Extraction Kit 50 次 试剂盒所包含的试剂, 足够对组织 细胞 细菌样本进行 50 次总 RNA 的提取 组分号 组分名称 规格 SR220A RNA 裂解液 40ml SR221A RNA 稀释液 30ml SR222A RNA 洗液 40ml SR223A 10XDNA 酶 I 缓冲液 0.3ml SR224A 1- 硫代甘油 1ml SR120A DNA 酶 I( 冻干粉 ) 1 瓶 SP119A 无核酸酶水 13ml SR320A 离心柱 / 收集管 (50 套 / 包 ) 1 包 SR321A 洗脱管 (50 个 / 包 ) 1 包 储存条件 : 在收到试剂盒后, 请将其中的 10XDNA 酶 I 缓冲液和 1- 硫代甘油于 4 保存 其它组分于 +15 到 +30 保存 配制好的 DNA 酶 I 分装后于 -20 保存, 加入 1- 硫代甘油 的 RNA 裂解液于 +4 保存 10 周 警告 : 1- 硫代甘油是低毒低挥发液体, 请戴手套并按照安全操作流程进行操作 当处理人 源 感染的组织或者血液样品时, 亦请参照安全操作流程作业并妥善处置有害物质 第 1 页, 共 14 页
试剂配制 溶液准备步聚注意事项 DNA 酶 I 按 DNA 酶 I( 冻干粉 ) 瓶标 所示, 加入 550μl 无核酸酶 水 ( 试剂盒已提供 ) 轻轻地旋转混匀溶液, 不要震荡 我们建议将溶解后的 DNA 酶 I 分装到无核酸酶的 EP 管内 ( 如, 分成 5-10 等份 ) 并于 -20 保存 单次 RNA 的提取需要使用 DNA 酶 I! 不要震荡 DNA 酶 I 溶液! 不要超过 3 次反复冻融 DNA 酶 I 溶液 RNA 裂解液 将 1- 硫代甘油按 2%(V/V) 加入到 RNA 裂解液中 加入 1- 硫代甘油后, 即在瓶子上做好标记 将 RNA 裂解液保存在 4 环境, 保存期 10 周, 每次使用后, 请拧紧瓶盖 RNA 洗液 向 40ml 浓缩的 RNA 洗液中 加入 70ml 无水乙醇 加入乙醇后, 即在瓶子上做好标记 试剂可保存于 15-30 环境中, 请拧 紧瓶盖 在准备提取 RNA 操作之前, 先准备好下列 3 种溶液 预防 RNase 污染的注意事项为防止在提取 RNA 过程中外源 RNA 酶的污染, 必须采取以下措施 : 1 戴一次性干净手套和口罩操作, 防止皮肤 唾液和实验室用品上存在的 RNase 污染 2 使用无菌无 RNase 的塑料制品和枪头 3 若使用玻璃器皿须经过 0.1%DEPC 水在 37 下浸泡 12 小时, 然后经过 120 高压灭菌 30 分钟, 烘干后使用 4 配制相应的试剂必须使用经过 120 高压灭菌的 0.1% DEPC 水 不同细胞的破碎方法为确保 RNA 抽提成功, 选择合适的细胞破碎方法, 保证样品在内源 RNase 作用前得到充分裂解是至关重要的 具体为 : 细菌采用溶菌酶破壁 ; 植物组织要用液氮研磨破碎 ; 动物组织可用组织匀浆器或液氮研磨破碎 而选择液氮研磨是破碎细胞的最佳方案 不同材料的裂解方法详见本手册各章节所描述的裂解物的制备 使用液氮破碎细胞要特别注意 : 在整个液氮研磨过程中, 必须不断添加液氮, 避免样品融化, 在研磨结束样品融化前必须立刻加入裂解液, 用移液枪反复吹打直到裂解物中无明显块状组织 有些样品 ( 如胰脏 ) 含有大量核酸 细胞碎片和蛋白质, 如果加入 RNA 第 2 页, 共 14 页
裂解液后, 裂解混合物很粘稠不易吸取时, 可以使用 20G( 或国产 9 号注射针头 ) 的注射器来回吸放数次, 使裂解物便于吸取即可 匀浆好的裂解物可以保存在 -70 备用 如果收集的样品不马上进行 RNA 的提取工作, 就需要将离体后的组织迅速投入液氮冻住后再保存于 -70 冰箱或直接保存于液氮中直到使用, 防止反复冻融 建议最好使用新鲜样品, 冷冻保存可能会使样品 RNA 产量降低 不同样品最适起始用量样品的起始用量对 RNA 的提取效果有很大影响, 任何裂解系统在接近样品最大起始量时, 抽提效果会明显下降 使用该试剂盒最佳样品起始用量为 : 细胞最佳用量 3x10 6, 植物组织 50mg, 动物组织 20mg 对含基因组 DNA 特别丰富的组织 ( 如 : 脾脏 ) 应减少起始用量 当抽提的 RNA 质量欠佳时, 考虑解决的办法是降低样品的起始用量 如果想获得更多提纯的 RNA, 可以按比例放大样品处理量以及后续各试剂用量, 分批上样过柱 在实验之前, 请参考表一 : 不同样品起始用量与裂解液, 稀释液的使用量进行裂解物的制备 表 1. 不同样品起始用量与裂解液, 稀释液的使用量 样品名称 样品起始用量 裂解液使用量 稀释液使用量 普通动物组织 ( 肝脏 肾脏 心 肺 脑, 等 ) 5-20mg 300µl 300µl 普通动物组织 ( 肝脏 肾脏 心 肺 脑, 等 ) 20-40mg 500µl 500µl 特殊动物组 ( 脾脏等 ) 5-10mg 300µl 300µl 细胞 1.5 10 3-5 10 6 300µl 300µl 植物组织 ( 叶片, 茎 ) 30-50mg 300µl 300µl 植物组织 ( 叶片, 茎 ) 50-100mg 500µl 500µl 细菌,OD600 达 0.6-1.0 时 1ml 150µl 250µl 第 3 页, 共 14 页
RNA 分离纯化流程图 处理好的样品加入 RNA 裂解液, 颠倒离心管 3-4 次, 混匀 加入稀释液, 用移液枪混匀 动物组织 植物组织混匀后直接以最大速度离心 5 分钟 细胞混匀后以 12000-14000 g 离心 5 分钟 细菌裂解物混匀后不要离心 离心后的动植物 细胞上清液中加入 0.5 倍上清体积的无水乙醇, 混匀 细菌裂解物中直接加入 300μl 无水乙醇, 混匀 混合液转移至离心柱,12000-14000 g 离心 1 分钟, 弃滤液 加入 600µl RNA 洗液洗涤,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 加入 50µl DNA 酶 I 孵育液孵育 15 分钟 然后加入 600µlRNA 洗液,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 加入 600µl 洗液, 12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 将离心柱重新放置于收集管上,12000-14000 g 离心 2 分钟 将离心柱安放在洗脱管上, 加入 50-200µl 无核酸酶水,12000-14000 g 离心 1 分 钟, 收集的 RNA 保存于 -70 第 4 页, 共 14 页
从动物组织中提取 RNA 准备下列材料 : 小型组织匀浆器或研钵及液氮 ( 如,Brinkmann, Tissuemizer 或 Omini Micro homogenizer) 无水乙醇 小型离心机操作方法 1 裂解物的制备按照以下两种方法进行裂解物的制备 : 1 必须使用新鲜或超低温冻存的组织 迅速将组织放入无核酸酶的 1.5ml EP 管或匀浆管中, 按起始量加入 RNA 裂解液 ( 裂解液加入量见表 1), 置冰浴中, 用组织匀浆器破碎细胞 2 必须使用新鲜或超低温冻存的组织 迅速将组织投入到已加入液氮的研钵中进行研磨, 研磨过程中要不断补充液氮, 以防止组织融化, 直至组织完全研磨成粉末状 将研磨成粉末状的样品迅速转稳到无核酸酶的 1.5ml EP 管中称量, 待剩余液氮将要挥发尽时加入裂解液, 用移液枪反复吹打直到裂解物中无明显块状组织 2 向裂解物中加入 RNA 稀释液 ( 稀释液加入量参考表 1), 用移液枪混匀 室温放置 3-5 分钟 提示 : 如果动物组织样品来源比较珍贵, 可以选择裂解物加入稀释液后置 70 加热 3 分钟, 可以提高 RNA 的得率 3 室温以最大离心速度离心 5 分钟 4 小心吸取上清液到新的 1.5ml 无核酸酶的 EP 管中 提示 : 离心后, 如果在上清液表面形成一层固体状物时, 只要在吸取上清前用枪头将固体状物拨到离心管一边即可 5 加入 0.5 倍上清体积的无水乙醇, 用移液枪吹打 3-4 次以混匀 6 根据样品数量, 取出相应数目的离心柱 / 收集管 ( 离心柱已安放在收集管上 ) 7 将混合液转移到离心柱内 ( 如果混合液体积大于 750µl, 需分批加入 每次加入的体积不要超过 750µl) 8 12000-14000 g 离心 1 分钟 弃滤液, 将离心柱重新放回到收集管中 9 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液 ( 已加入乙醇 ),12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 10 DNA 酶 I 消化 DNA 酶 I 要新鲜配制 取一无核酸酶 EP 管, 加入下列试剂 以下是提取一管 RNA 需要的 DNA 酶 I 孵育液的用量 试剂体积 10XDNA 酶 I 缓冲液 DNA 酶 I 无核酸酶水 40μl 第 5 页, 共 14 页
注意 : 轻轻吸放混匀, 不要振荡 11 向离心柱中央加入 50µl 新鲜配制的 DNA 酶 I 孵育液, 室温静置 15 分钟 12 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 13 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 将离心柱重新安置于收集管上,12000-14000 g 离心 2 分钟 14 将离心柱转移至洗脱管上( 试剂盒提供 ), 在离心柱膜中央加入 50-200μl 无核酸酶水, 室温静置 2 分钟,12000-14000 g 离心 1 分钟, 将 RNA 保存在 -70 提示 : 如果将第一次洗脱下来的洗脱液重新加回到离心柱中央, 室温静置 2 分钟,12000-14000 g 离心 1 分钟再次洗脱 RNA, 可以提高 RNA 得率 实验举例 : 应用本试剂盒提取的小鼠肝 肾 肺 脾 脑 心脏组织 RNA M 1 2 3 4 5 6 M:Promega λdna Marker 1 小鼠肝脏; 2 小鼠肾脏; 3 小鼠肺; 4 小鼠脾; 5 小鼠脑; 6 小鼠心脏; 电泳条件 :RNA 上样量 2000ng,1% 琼脂糖凝胶,110V,30 分钟 从贴壁或悬浮细胞中提取 RNA 使用下列操作步骤裂解贴壁或悬浮细胞 每一样品细胞量在 1.5 10 3 到 5 10 6 之间 应根据细胞的类型 功能和收获时 RNA 表达水平优化所需的细胞数量 准备下列材料 : 1 PBS 溶液 ( 无菌 ) 无水乙醇 小型离心机 操作方法 1 细胞裂解物的制备 贴壁细胞裂解物的制备 : 贴壁细胞样品可按下列两种方法之一制备 第一种方法用胰 酶 -EDTA 溶液使细胞松动脱落 ; 第二种方法手动刮取细胞 胰蛋白酶处理方法 : 准备试剂 ( 配方见附录 ): 1 胰酶 -EDTA 溶液 ( 无菌 ) 1 PBS ( 无菌 ) 第 6 页, 共 14 页
1 倒掉培养液, 用无菌 1 PBS 溶液洗涤细胞, 然后加入正好能盖住单层细胞的胰酶溶液 : 如 150mm 培养瓶需加入 2ml 胰酶溶液,100mm 培养皿需加入 1ml 胰酶溶液 轻轻晃动器皿使胰酶均匀分布在细胞层上, 直到细胞松动 ( 一般 1-2 分钟 ) 2 一旦细胞松动, 尽快弃去胰酶溶液 ( 倾斜平皿或培养瓶以便用枪头尽量吸去多余的溶液 ), 加入 1 PBS 溶液, 用移液枪吹下贴壁的细胞 3 将细胞连同 PBS 溶液一起收集到无核酸酶的 EP 管中,300-500 g(1100-1500rpm) 离心 5 分钟, 弃上清, 收集沉淀细胞 4 向细胞沉淀中加入 RNA 裂解液 ( 裂解液加入量见表 1), 用移液枪吸放打散沉淀, 混匀, 并将裂解物转移至 1.5ml 无核酸酶 EP 管中 刮取式分离方法 : 对生长在多孔板上的细胞, 根据细胞类型和孔径大小, 每孔细胞数 3.5 10 4 到 1 10 6 个 1 倒掉培养基, 加入适量无菌 1 PBS 溶液, 用移液枪吹打细胞, 直到细胞全部脱离瓶底为止 对于贴壁牢固的培养细胞, 可以用细胞刮勺剥离细胞 2 将细胞连同 PBS 溶液一起收集到无核酸酶的 EP 管中,300-500 g (1100-1500 rpm) 离心 5 分钟, 弃上清, 收集沉淀细胞 3 向裂解物中加入 RNA 稀释液 ( 稀释液加入量见表 1), 用移液枪吸放打散沉淀, 混匀, 并将裂解物转移至 1.5ml 无核酸酶的 EP 管中 悬浮细胞裂解物的制备 : 1 将悬浮的细胞连同培养液一起倒入无核酸酶的 EP 管中,300-500 g (1100-1500 rpm) 离心 5 分钟 使用无菌 1 PBS 溶液洗涤沉淀的细胞,300-500 g (1100-1500 rpm) 离心 5 分钟, 弃上清, 收集沉淀的细胞 2 向细胞沉淀中加入 RNA 裂解液 ( 裂解液加入量见表 1), 用枪头吸放打散沉淀, 混匀, 并将裂解物转移至 1.5ml 无核酸酶的 EP 管中 2 向 300µl 裂解物中加入 300µl RNA 稀释液, 颠倒离心管 3-4 次混匀, 室温放置 3-5 分钟提示 : 如果细胞样品来源比较珍贵, 可以选择裂解物加入稀释液后置 70 加热 3 分钟, 可以提高 RNA 的得率 3 最大速度离心 5 分钟 4 小心吸取上清液到新的 1.5ml 无核酸酶 EP 管中 5 加入 0.5 倍上清体积的无水乙醇, 用移液枪吹打 3-4 次以混匀 6 取出离心柱 / 收集管 ( 离心柱已安放在收集管上 ) 7 将混合液转移到离心柱内 ( 如果混合液体积大于 750µl, 需分批加入 每次加入的体积不要超过 750µl) 8 12000-14000 g 离心 1 分钟 弃滤液, 将离心柱重新放回到收集管中 9 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液 ( 已加入乙醇 ),12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 10 DNA 酶 I 消化 第 7 页, 共 14 页
DNA 酶 I 要新鲜配制 取一无核酸酶 EP 管, 加入下列试剂 以下是提取一管 RNA 需 要的 DNA 酶 I 孵育液的用量 试剂 10XDNA 酶 I 缓冲液 DNA 酶 I 无核酸酶水 体积 40μl 注意 : 轻轻吸放混匀, 不要振荡 11 向离心柱中央加入 50µl 新鲜配制的 DNA 酶 I 孵育液, 室温静置 15 分钟 12 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 13 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 将离心柱重新安置于收集管上,12000-14000 g 离心 2 分钟 14 将离心柱转移至洗脱管上( 试剂盒提供 ), 在离心柱膜中央加入 50-200μl 无核酸酶水, 室温静置 2 分钟,12000-14000 g 离心 1 分钟, 将 RNA 保存在 -70 提示 : 如果将第一次洗脱下来的洗脱液重新加回到离心柱中央, 室温静置 2 分钟,12000-14000 g 离心 1 分钟再次洗脱 RNA, 可以提高 RNA 得率 实验举例 : 应用本试剂盒提取的 1 10 6 培养的 293T 细胞 RNA M 1 2 M:Promega λdna Marker 1,2:293T 细胞 RNA 电泳条件 :RNA 上样量 1800ng,1% 琼脂糖凝胶,110V,30 分钟 从植物组织中提取 RNA 准备下列材料 : 研钵和液氮 无水乙醇 小型离心机 第 8 页, 共 14 页
操作方法 1 植物组织裂解物的制备必须使用新鲜或超低温冻存的组织 迅速将组织投入到已加入液氮的研钵中进行研磨 研磨过程中要及时补充液氮, 以防止组织融化, 直至组织完全研磨成粉末状 将研磨成粉末状的样品迅速转稳到无核酸酶的 EP 管中称量, 按表 1 中指示的理解液的使用量加入裂解液, 用移液枪反复吹打直到裂解物中无明显块状组织 2 按表 1 中指示的稀释液的使用量加入 RNA 稀释液, 颠倒离心管 3-4 次混匀, 室温放置 3-5 分钟 3 室温, 在小型离心机中以最大速度离心 5 分钟 4 小心吸取上清液到新的 1.5ml 无核酸酶 EP 管中 提示 : 离心后, 如果在上清液表面形成一层固体状物时, 只要在吸取上清前用枪头将固体状物拨到离心管一边即可 5 加入 0.5 倍上清体积的无水乙醇, 用移液枪吸放 3-4 次以混匀 6 取出离心柱/ 收集管 ( 离心柱已安放在收集管上 ) 7 将混合液转移到离心柱内 8 12000-14000 g 离心 1 分钟 弃滤液, 将离心柱重新放回到收集管中 9 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液 ( 已加入乙醇 ),12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 10 DNA 酶 I 消化 DNA 酶 I 要新鲜配制 取一无核酸酶 EP 管, 加入下列试剂 以下是提取一管 RNA 需要的 DNA 酶 I 孵育液的用量 试剂体积 10XDNA 酶 I 缓冲液 DNA 酶 I 无核酸酶水 40μl 注意 : 轻轻吸放混匀, 不要振荡 11 向离心柱中央加入 50µl 新鲜配制的 DNA 酶 I 孵育液, 室温静置 15 分钟 12 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 13 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 将离心柱重新安置于收集管上,12000-14000 g 离心 2 分钟 14 将离心柱转移至洗脱管上( 试剂盒提供 ), 在离心柱膜中央加入 50-200μl 无核酸酶水, 室温静置 2 分钟,12000-14000 g 离心 1 分钟, 将 RNA 保存在 -70 提示 : 如果将第一次洗脱下来的洗脱液重新加回到离心柱中央, 室温静置 2 分钟,12000-14000 g 离心 1 分钟再次洗脱 RNA, 可以提高 RNA 得率 M 1 2 3 M:Promega PCR Marker 1,2: 番茄叶片 RNA 电泳条件 :RNA 上样量 1000ng,1% 琼脂糖凝胶,110V,30 分钟 第 9 页, 共 14 页
从革兰氏阳性 ( 枯草杆菌 ) 和革兰氏阴性 ( 大肠杆菌 ) 细菌中提取 RNA 注意 : 对某些葡萄球菌, 要用 60μl 10mg/ml 溶菌酶和 60μl 10mg/ml 的溶葡萄球菌素 (lysostaphin) 的混合液才能有效溶解 不过, 许多革兰氏阳性细菌 ( 如 Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Arthrobacter luteus, Nocardia otitidscaviarum, Rhodococcus rhodochrous and Brevibacterium albidium) 仅需溶菌酶即可进行有效溶解 准备下列材料 : 溶菌酶 无水乙醇 小型离心机 操作方法 1 在合适的培养基 合适的温度中过夜培养细菌 第二天, 按 1:50 的比例接种并培养至 OD 600 达 0.6-1.0, 可能只需要几小时, 如果生长太慢, 可以加大接种量 2 向 1.5ml 离心管中加入 1ml 细菌培养液,12000-14000 g 离心 2 分钟 3 小心地 尽可能多地除去上清, 留下细菌沉淀 4 用 100μl 新鲜配置的含溶菌酶的 TE 缓冲液重悬沉淀 革兰氏阳性细菌可使用 3mg/ml ( 终浓度 ) 的溶菌酶 ; 革兰氏阴性细菌则可采用 0.4mg/ml( 终浓度 ) 的溶菌酶, 轻轻敲打混匀 5 室温孵育, 革兰氏阳性菌孵育 5-10 分钟 ; 革兰氏阴性菌孵育 3-5 分钟 6 加入 200μl RNA 裂解液, 用移液枪吹打混匀 7 加入 300μl RNA 稀释液, 颠倒离心管 3-4 次以混匀, 不要离心 注意 : 这一步不要离心, 否则 RNA 会损失到裂解物中 8 加入 300µl 无水乙醇, 用移液枪吹打 3-4 次以混匀 9 取出离心柱 / 收集管 ( 离心柱已安放在收集管上 ) 10 将混合液转移到离心柱内 11 12000-14000 g 离心 1 分钟, 弃滤液, 将离心柱重新放回到收集管中 12 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液 ( 已加入乙醇 ),12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 13 DNA 酶 I 消化 DNA 酶 I 要新鲜配制 取一无核酸酶 EP 管, 加入下列试剂 以下是提取一管 RNA 需要的 DNA 酶 I 孵育液的用量 试剂 10XDNA 酶 I 缓冲液 DNA 酶 I 无核酸酶水 体积 40μl 注意 : 轻轻吸放混匀, 不要振荡 11 向离心柱中央加入 50µl 新鲜配制的 DNA 酶 I 孵育液, 室温静置 15 分钟 第 10 页, 共 14 页
12 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 13 向离心柱中加入 600µl RNA 洗液,12000-14000 g 离心 45 秒, 弃滤液 将离心柱重新安置于收集管上,12000-14000 g 离心 2 分钟 14 将离心柱转移至洗脱管上( 试剂盒提供 ), 在离心柱膜中央加入 50-200μl 无核酸酶水, 室温静置 2 分钟,12000-14000 g 离心 1 分钟, 将 RNA 保存在 -70 实验例: 应用本试剂盒提取的 E.coli 1 10 9 细胞 RNA M 1 2 M:Promega λdna Marker 1,2:E.coli 细胞 RNA 电泳条件 :RNA 上样量 600ng,1% 琼脂糖凝胶,100V,40 分钟 表 2. 不同材料提取 RNA 的得率 样品种类 样品名称 RNA 收获 A260/A230 A260/280 (µg/mg) 动物组织 小鼠肝脏 3.0-5.5 2.0-2.5 1.9-2.1 小鼠肾脏 1.5-3.0 2.0-2.5 1.9-2.1 小鼠脾脏 1.5-3.5 2.1-2.6 1.9-2.1 小鼠心脏 0.4-1.0 2.0-2.6 1.9-2.1 小鼠肺 0.6-1.2 2.2-3.0 1.9-2.1 小鼠脑 0.4-0.8 2.1-2.7 1.9-2.1 植物组织 番茄叶子 1.0-2.0 2.1-2.6 1.9-2.2 细胞 293T(1x10 6 ) 8-12 2.0-2.3 1.9-2.1 Hela(1x10 6 ) 40 2.0-2.3 1.9-2.1 细菌 E.Coli(1x10 9 ) 30-50 2.2-2.6 1.9-2.1 问题及解决办法 第 11 页, 共 14 页
1 A 260/A 230 低 A 260/A 230 正常范围 1.8, 低于此值, 则表明有异硫氰酸胍的污染 造成污染的原因可能 : 在操作过程中, 异硫氰酸胍残液沾到离心柱的外壁上清洗不干净而污染 RNA 溶液 LS1040 试剂盒的离心柱和收集管的特别设计的结构, 基本不会出现这种情况 如果 RNA 溶液中存在异硫氰酸胍污染, 将会不同程度影响下游应用时酶的反应效果 解决办法 : 在 RNA 溶液中加入 NaCl 溶液, 最终浓度为 0.1M, 然后加 2.5 倍无水乙醇,-20 30 分钟,4 10000g 离心 15 分钟, 用无核酸酶水重悬 RNA 2 提取的 RNA 发生降解质量较好的 A260/A280 R 值应在 1.9-2.1 之间, 当 R<1.8 时, 溶液中的蛋白质等有机物的污染程度比较明显 ; 当 R 值 >2.2 时, 则表明 RNA 已经降解 则可能的原因是 : 样品不够新鲜, 在加入裂解液前, 样品已经降解 应当使用新鲜的组织材料, 如果不马上进行 RNA 提取, 应将材料在液氮中速冻后置 -70 冰箱保存或直接保存在液氮中 样品在裂解过程中发生降解 操作前请仔细阅读本手册, 选择合适的样品裂解方法, 尤其裂解动植物组织样品时, 请始终保持低温下操作, 裂解过程中操作时间越短越好 在提取 RNA 过程中, 使用的器具或环境不干净, 造成 RNA 酶污染 操作前请参考预防 RNase 污染的注意事项 提取的组织材料中含有大量的 RNA 分解酶 RNA 分解酶较多的组织或细胞应当减少样品起始量 比如提取动物组织的脾脏应减少起始用量 操作前请参考本手册不同样品的最适起始用量 3 A 260 低 ( 得率低 ) 使用 LS1040 试剂盒提取的不同样品的得率请参考不同材料提取 RNA 的得率, 如果 RNA 得率过低, 可能有以下因素造成 : 使用保存在 -70 的样品, 其提取的 RNA 得率要低于新鲜样品 保存时间越久得率越低 样品称量时带入的水份 ( 或液氮 ) 比较多, 导致计算得率时与实际重量之间的误差 样品起始量太多 操作前请参考本手册不同样品的最适起始用量 样用裂解不充分 操作前请参考本手册不同细胞的破碎方法 洗脱液中有乙醇残留 洗脱前要离心 2 分钟, 除去残留的乙醇 4 重复性差 冻存样品和新鲜样品提取 RNA 的得率有差异 样品起始量太多造成的差异 操作前请参考本手册不同样品的最适起始用量 样品裂解不充分, 操作前请参考本手册不同细胞的破碎方法 当裂解物太过粘稠时没有用 20G 或国产 9 号针头的注射器进一步处理 第 12 页, 共 14 页
5 提取的 RNA 中含基因组 DNA 上海普洛麦格生物产品有限公司 本试剂盒提供的方法能够很好地除去样品中的基因组 DNA, 按照手册操作一般不会有 DNA 的污染 如果提取的 RNA 溶液中含有基因组 DNA, 则可能有以下几种原因 DNA 酶活性降低 操作前请按手册要求配制 DNA 酶 I 溶液, 配制时不要震荡 DNA 酶 I 溶液, 不要反复冻融 DNA 酶 I 溶液超过 3 次以上, 建议将配好的 DNA 酶 I 溶液分装到无核酸酶的 EP 管内 样品裂解不充分 样品裂解不充分会造成基因组 DNA 的残留, 操作前请仔细阅读本手册, 选择合适的样品裂解方法, 尤其裂解动植物组织样品时, 请始终保持低温下操作, 裂解过程中操作时间越短越好 样品起始量过多 样品起始量过多超过了离心柱的承载量, 造成基因组 DNA 的残留 操作前请参考本手册不同样品的最适起始用量 对于含基因组 DNA 丰富的组织, 降低样品起始用量是唯一有效解决基因组 DNA 的污染的方法 附录缓冲液和溶液的配方 : 1. PBS 缓冲液, (10 ), ph 7.4 11.5g Na 2HPO 4 2g KH 2PO 4 80g NaCl 2g KCl 溶解在 1 升无菌去离子水中 2. 胰蛋白酶 -EDTA 溶液 (1 ) 0.05% Trypsin(w/v) 0.53mM EDTA 溶解于 1 PBS 3. 1 TE 缓冲液, ph 8.0 10mM Tris-HCl 1mM EDTA 第 13 页, 共 14 页