2008 年第 66 卷化学学报 Vol. 66, 2008 第 23 期, 2653~2657 ACTA CHIMICA SINICA No. 23, 2653~2657 研究简报 PPEGMEA-g-PMAA 全亲水接枝共聚物包埋甲氨喋呤体外控释的研究 黄晓炜 a 顾丽娜 陆国林 黄啸 *,a 张亚琴 ( a 复旦大学附属肿瘤医院妇科复旦大学上海医学院肿瘤学系上海 200032) ( 中国科学院上海有机化学研究所上海 200032) 黄晓宇 *, 摘要以全亲水接枝共聚物 PPEGMEA-g-PMAA 为载体材料, 以甲氨喋呤 (MTX) 为模型药物, 通过物理包埋和化学键合法制备 MTX 药物缓释体系, 探讨了 ph 值 制备方法等对载药量 (DLC) 包埋率(DLE) 和释药行为等的影响, 两种体系均可以通过改变 ph 值来控制药物的释放和释放速率. ` 关键词全亲水接枝共聚物 ; 药物控释 ; 甲氨喋呤 Studies on Controlled Drug Release in vitro of Methotrexate Loaded y PPEGMEA-g-PMAA Doule Hydrophilic Graft Copolymer HUANG, Xiao-Wei a GU, Li-Na LU, Guo-Lin HUANG, Xiao*,a ZHANG, Ya-Qin HUANG, Xiao-Yu*, ( a Department of Gynecology, Cancer Hospital, Fudan University, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032) ( Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032) Astract Methotrexate-loaded polymeric micelles using PPEGMEA-g-PMAA doule hydrophilic graft copolymer as carrier were prepared y physical entrapping and chemical onding. The effects of ph and preparation method on drug loading content (DLC), drug loading efficiency (DLE) and drug release were studied. Drug release of oth micelles can e controlled y ph. Keywords doule hydrophilic graft copolymer; drug release; methotrexate 控释给药体系 (control release drug delivery system, CRDDS), 是指将药物载体与药物制成一定的剂型, 药物可以从制剂中以受控的形式恒速地释放, 作用到靶位器官而发挥治疗效用. CRDDS 体系可以在最大化药物治疗活性的同时最小化其它的负面效应. 纳米胶体粒子如微球 脂质体和聚合物胶束等常被用作载体实现药物缓释 [1~3], 其中聚合物胶束是最具优势的候选载体 [4,5]. 聚合物胶束的结构在体外和体内都能稳定, 有好的生物相容性, 较小的粒径使胶束可以达到一般药物无法到达的毛细管层, 可以负载疏水性药物. 聚合物胶束作为药 物载体时, 药物可以通过简单的物理包埋 静电作用或共价键键合方法载入聚合物胶束. 如果药物是与形成胶束共聚物的疏水部分通过化学键或静电作用连接的, 它的载药过程与胶束形成过程同时发生, 如果药物通过物理包埋的方法, 载药过程依赖于胶束的制备过程. 构建功能控制给药体系的载体聚合物中, 含有聚电解质链段的全亲水性接枝共聚物占有非常重要的地位, 因为这种聚合物自组装形成的胶束具有高的稳定性, 内涵体效应和受环境条件调控的响应性. 全亲水性共聚物 (doule hydrophilic copolymer, DHC) 是一类特殊的两亲 * E-mail: smilehuangxiao@163.com; xyhuang@mail.sioc.ac.cn Received July 18, 2008; revised August 28, 2008; accepted Septemer 2, 2008. 上海市纳米专项 (No. 0652nm031) 上海市青年科技启明星计划(No. 07QA14066) 中国科学院青年人才领域前沿项目和卫生部笹川医学奖学金同学会科研启动基金资助项目.
2654 化学学报 Vol. 66, 2008 性共聚物, 由化学结构不同的链段组成, 每一链段都具有水溶性. 在外界环境 ( 温度 ph 离子强度等或与带相反电荷的金属离子 小分子及高分子络合等 ) 的刺激下, 某一链段从亲水性转变为疏水性, 从而形成胶束, 因此该类聚合物具有环境敏感胶束化行为, 在药物传递系统 基因疗法 矿化模板等领域具有潜在的应用价值 [6,7]. 在我们之前的工作中 [8], 利用原子转移自由基聚合 (atom transfer radical polymerization, ATRP) 技术, 通过依次的直接接枝和引发接枝, 合成了结构规整的双亲水高密度双接枝共聚物 PPEGMEA-g-PMAA( 图 1), 该共聚物以聚丙烯酸酯为主链, 以亲水的聚乙二醇和聚甲基丙烯酸作为侧链, 得到了全亲水性共聚物, 实验结果表明该共聚物具有 ph 和盐度响应性. 本文以甲氨喋呤为模型药物 ( 图 1), 对 PPEGMEA-g-PMAA 作为功能药物载体的性能进行了研究. 甲氨喋呤 (methotrexate, MTX) 是一种叶酸类抗代谢药剂, 是常用的抗风湿药物, 也常用于各种恶性肿瘤的治疗 [9]. MTX 在药用上也有许多不利之处, 治疗脑部肿瘤时很少量能通过血脑屏障, 本品可增加肝肾功能毒性. 由于药物作用机理是通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍肿瘤细胞 DNA 的合成, 所以对正常的生物细胞也有药物作用, 毒性反应较大 [10]. 为了提高 MTX 的药物针对性和选择性, 增大治疗效率, 降低毒副作用, CRDDS 体系被用于 MTX 的药剂制备 [11~16]. 由于 MTX 含有较大的共轭基团, 紫外特征吸收明显, 可以方便地通过紫外光谱或液相色谱来确定其浓度, 是典型的 CRDDS 体系研究的模型药物. 1 实验部分 1.1 仪器与试剂紫外分光光度计 : Cary 100, 25 下扫描 MTX 的 200~400 nm 的全谱, 测定 306 nm 处的吸收强度. 聚甲基醚聚乙二醇丙烯酸酯 - g - 聚甲基丙烯酸 {poly[poly(ethylene glycol) methyl ether acrylate]-gpoly(methacrylic acid), PPEGMEA-g-PMAA 1} 运用文献 [8, 17] 的方法合成得到. 甲氨喋呤 ( 浙江康多利海洋生物保健有限公司, 99%), 1- 乙基 -3-(3- 三甲氨丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐 (EDC HCl) 和二甲基甲酰胺 (DMF) 未经处理直接使用. 0.2 mol L -1 PBS 溶液的配制 : 29 g Na 2 HPO 4 12H 2 O, 3 g NaH 2 PO 4 2H 2 O, 高纯水溶解后定容至 500 ml. 1.2 物理包埋法制备聚合物胶束药物载体 2 将 30 mg 接枝共聚物 PPEGMEA-g-PMAA (1) 和 15 mg 甲氨喋呤溶于 DMF (15 ml) 中, 将溶液转移到透析袋中, 置入 ph=5 的 400 ml 水溶液中透析, 每隔 3 h 更换 1 次水. 1 d 后, 将袋中溶液转移到表面皿中, 冷冻干燥得到 30.0 mg 产品. 1.3 化学键合法制备聚合物胶束药物载体 3 将 30 mg 接枝共聚物 PPEGMEA-g-PMAA (1) 和 15 mg 甲氨喋呤溶于 15 ml 磷酸缓冲溶液 (0.2 mol L -1, ph=12), 搅拌 5 h 使样品完全溶解, 再加入 7.6 mg EDC HCl, 室温下搅拌反应 24 h. 将溶液转移到透析袋中, 置入 400 ml 高纯水中透析, 每隔 3 h 更换一次水. 1 d 后, 将袋中溶液转移到表面皿中, 冷冻干燥得到 30.0 mg 产品. 1.4 紫外分光光度法检测药物载体 2 和 3 的载药量 DLC 精密称取 5.196 mg 甲氨喋呤置于 50 ml 容量瓶中, 用 0.1 mol L -1 NaOH 溶解定容. 此溶液用 0.1 mol L -1 NaOH 分别稀释成浓度为 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 mg L -1 的溶液, 在 306 nm 处测定其吸光度. 测得的数据按回归法处理得标准曲线方程, 并绘出吸光度 - 浓度曲线. 精确称取 1 mg 药物载体 2 或 3, 用 0.1 mol L -1 的 HCl 稀释至 10 ml, 溶液放置两天后测定 306 nm 处吸光度, 在吸光度 - 浓度标准曲线上推算其含量浓度. 1.5 药物载体 2 和 3 的体外释药过程 图 1 PPEGMEA-g-PMAA 和 MTX 的化学结构 Figure 1 Chemical structure of PPEGMEA-g-PMAA and MTX 准确称取 5 mg 药物载体 2 或 3, 用 1 ml 高纯水溶解分散. 马上将溶液转移到透析卡中, 将透析卡放入 200 ml 模拟胃液 (ph=1.2 的 HCl 水溶液 ) 或模拟肠液 / 体液 (0.2 mol L -1 的 ph=7.4 的磷酸缓冲溶液, PBS) 中,
No. 23 黄晓炜等 :PPEGMEA-g-PMAA 全亲水接枝共聚物包埋甲氨喋呤体外控释的研究 2655 于 37 下进行体外药物释放. 定期取出 5 ml 释放液, 紫外测定其中 MTX 浓度, 并同时补充相同体积的缓冲液继续释放. 2 结果与讨论 2.1 PPEGMEA-g-PMAA (1) 对 MTX 的负载 我们按照文献 [8, 17] 的方法合成得到了共聚物 PPEGMEA-g-PMAA (1 ), 主链的重复单元数为 N PEGMEA =20.0, 接枝密度为 75%, 即每条高分子链上含有 15 个 ATRP 引发位点, 而侧链 PMAA 的聚合度为 N MAA =17.6. 该共聚物在水溶液中形成的胶束具有 ph 响应性, 当 ph<4 时, PMAA 之间的强静电斥力使得共聚物以沉淀的形式析出 ; 当 4<pH<6 时, 共聚物形成核 - 壳结构的大胶束 ; 当 ph>6 时, PMAA 链段转变为钠盐, 共聚物能很好地溶解在水中. 因此这种共聚物可望发展成为 ph 响应的功能药物载体, 用于药物负载和控释. 我们以 MTX 为模型药物, 对共聚物 PPEGMEA-g-PMAA (1) 作为功能药物载体的性能进行了研究. 为了测试接枝共聚物对 MTX 包封以及释放的结果, 我们先测定了 MTX 在水溶液中的标准曲线. 用 0.1 mol L -1 NaOH 溶液精确配制 0.625~40 mg L -1 的 MTX 溶液, 紫外分光光度计扫描不同 MTX 浓度的水溶液, 在 306 nm 处测定其吸光度 ( 图 2A). 将测得的数据绘出吸光度 - 浓度曲线 ( 图 2B), 在 0.625~40 mg L -1 的浓度范围内, MTX 在 306 nm 处的吸光度与浓度成线性关系. 按回归法处理得标准曲线方程 ( 式 1), 该曲线有高的相关系数 (R=0.99995) 和低的标准偏差 (SD=0.00725), 说明得到的是一条有效的吸光度 - 浓度标准曲线. As=0.01687+0.04485[MTX] (1) 接着用 PPEGMEA-g-PMAA (1) 对 MTX 进行包埋试验来制备胶束药物载体. 根据 1 的结构, 可以通过两种方法来制备胶束药物载体 : (1) 物理包埋法 : 在我们之前的研究中, 发现 PPEGMEA-g-PMAA 1 在中性或弱酸性条件下, PMAA 侧链疏水, PEG 侧链亲水, 从而自组装形成胶束 [8]. 因此可以在中性条件下, 1 与 MTX 配成 DMF 溶液, 透析除去溶剂 DMF 未被包封的药物以及其它小分子, 就可得到载物胶束溶液, 经冷冻干燥就能得到负载了 MTX 的药物载体 2. (2) 化学键合法 : 将羧基组份和氨基组份混合, 在缩合试剂作用下, 中间体不经分离直接进行反应形成酰胺键是目前应用最广的形成酰胺键的方法 [18,19]. MTX 的结构中含有胺基, 而 1 的侧链 PMAA 含有大量的羧基, 因此在一定的催化剂下它们可 图 2 (A) MTX 的紫外光谱 ; (B) MTX 在 306 nm 的吸光度 - 浓度标准曲线 Figure 2 (A) UV spectrum of MTX; (B) standard curve of MTX at 306 nm 以形成酰胺键, 因此可以通过化学键合法制备载药胶束 ( 图 3). 为了避免引入有毒的有机溶剂, 反应是在 0.2 mol L -1 的 ph=12 的磷酸缓冲溶液中进行, 采用了水溶性催化剂 EDC HCl, MTX 通过胺基与 PMAA 形成酰胺键, 实现了对 MTX 的包埋, 经过透析 冷冻干燥得到药物载体 3. 然后, 用 0.1 mol L -1 的 HCl 溶解一定量的药物载体制得一定浓度的溶液, 溶液放置 2 d 用紫外分光光度计测其在 306 nm 的吸光度 As, 对照标准曲线计算其浓度, 最后算出聚合物胶束的载药量 (Drug Loading Content, DLC) 和药物的包封率 (Drug Loading Efficiency, DLE), 结果见表 1. 从表中可以看出, 接枝共聚物 1 以物理包埋的方式引入药物, 因为 PMAA 链段与 MTX 之间的静电斥力会降低药物在胶束核中的溶解性, 得到的载药量和包封率都比较低, 而 3 是通过化学键合法来引入 MTX, 形成更为牢固的药物 - 载体结合并减少胶束的电荷, 可望提高胶束体系的载药量和包封率. 这一方法确实能提高载药体系的载药量和药物包封率, 但包封效果还不是非常理想, 静电斥力的作用仍对药物负载有很大的作用.
2656 化学学报 Vol. 66, 2008 拟肠液 / 体液 (0.2 mol L -1 PBS, ph=7.4) 中的药物释放行为, 以累积释药百分数对时间作图得到药物释放曲线, 如图 4 所示. 紫外跟踪的整个体外释药过程中, 药物载体 2 的体系在模拟胃液 (ph=1.2) 中药物的累积释放度一直在 10% 以下, 证明这种药物载体可以在酸性条件下长时间稳定存在, 贮存的药物基本不流失. 在模拟肠液中 (ph=7.4), 药物在很短的时间内就能大量释放出来 (Time=2 h, Drug Released=68.24%). 这样的药物载体比较适合通过口服, 实现对肠道的靶向给药. 图 4 药物载体 2 在不同 ph 值下的体外释放曲线 (37 ) Figure 4 MTX release profiles in vitro of drug carrier 2 with different ph at 37 图 3 PPEGMEA-g-PMAA-MTX 结合物的制备 Figure 3 Synthesis of PPEGMEA-g-PMAA-MTX conjugate 图 5 是药物载体 3 在模拟胃液 (ph=1.2) 和模拟肠液 / 体液 (0.2 mol L -1 PBS, ph=7.4) 中的药物释药曲线. 这两种溶液环境中, 药物载体 3 的体系都能完全释放药物. 化学键合虽然增加了载体的载药量和包封率, 但是也使聚合物胶束丧失了原有的 ph 响应性. 表 1 PPEGMEA-g-PMAA (1) 作为载体的载药量 Tale 1 Drug loading contents using PPEGMEA-g-PMAA (1) as carrier a Entry 药物缓释体系的制备方法 DLC/% DLE/% 2 3 c 物理包埋法 5.512 11.62 化学键合法 6.325 13.50 a 共聚物与 MTX 的重量比为 2 1, MTX 的浓度为 1 mg L -1 ; 在 ph=5 的水溶液中透析 ; c 0.2 mol L -1 PBS 缓冲液为溶剂, 在高纯水中透析. 2.2 药物载体 2 和 3 的体外释药研究药物载体的体外释药曲线一般可分为 3 个阶段 : (1) 突释阶段, 外部环境的突变对药物载体造成冲击, 使药物在很短的时间内快速地释放 ; (2) 缓释阶段, 此时载体与环境的相互平衡载体内外有较为稳定的药物浓度差, 药物匀速缓慢地释放 ; (3) 平衡阶段, 此阶段载体与环境的药物浓度平衡, 药物浓度基本不变, 释药停止. 首先, 研究了药物载体 2 在模拟胃液 (ph=1.2) 和模 图 5 药物载体 3 在不同 ph 值下的体外释放曲线 (37 ) Figure 5 MTX release profiles in vitro of drug carrier 3 with different ph at 37 从图 5 中还可以看出, 酸性环境 (ph=1.2) 中突释阶段 (0~1 h) 和缓释阶段 (1~10 h) 都很短, 突释阶段高的药物释放度 (60.74%) 和缓释阶段低的释放度 (64.2%~ 60.74%=3.46%), 显示了比较差的药物释放控制. 在碱性环境 (ph=7.4) 中, 由于药物与聚合物之间的键合化
No. 23 黄晓炜等 :PPEGMEA-g-PMAA 全亲水接枝共聚物包埋甲氨喋呤体外控释的研究 2657 学键酰胺单元对酸较为敏感, 可控释药有所改善, 突释阶段 (0~4 h, 65.20%) 和缓释阶段 (4~24 h, 8.33%) 的药物释放度都有所增长. 虽然药物载体 3 的体系不能通过调节溶液的 ph 值来实现药物的存储与释放, 但是改变溶液酸碱性却能实现对药物控释速度的控制. 图 6 通过对同一聚合物 PPEGMEA-g-PMAA 1 的不同药物载入方法在模拟肠液 / 体液中的药物释放曲线进行了比较, 可以了解药物载入方式对药物释放过程的影响. 3 的突释阶段和缓释阶段比 2 都长, 突释阶段的药物释放度比较小, 缓释阶段的释放度比较大, 释药速率比较慢, 对药物的控释比较好. 与物理包埋法相比, 化学键合法载入药物后, 药物与载体之间的连接更稳固, 释放过程是化学键破坏的过程, 所以药物释放速率比较慢, 有较好的药物控释作用. 图 6 在 ph=7.4 时药物载体 2 和 3 体外释放曲线的比较 Figure 6 Comparison of release profiles in vitro etween 2 and 3 when ph=7.4 总之, 不同的药物载入方式, 可以导致过程各异的药物释放过程, 满足不同的可控药物释放需求. 3 结论 以 MTX 为模型药物, 以全亲水接枝共聚物 PPEGMEA-g-PMAA 为载体, 通过物理包埋和化学键合法制备了 MTX 聚合物胶束药物载体, 它们的药物释放过程与 ph 值和载药方式有关, 可满足不同的可控药物释放要求. References 1 Zhang, X. Z.; Lewisp, J.; Chu, C. C. Biomaterials 2005, 26, 3299. 2 Kim, H. J.; Jones, M. N. J. Liposome Res. 2004, 14, 123. 3 Yokoyama, M.; Satoh, A.; Sakurai, Y. J. Controlled Release 1998, 55, 219. 4 Kwon, G. S.; Kataoka, K. Adv. Drug Delivery Rev. 1995, 16, 295. 5 Kwon, G.. S. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1998, 15, 481. 6 Kaanov, A. V.; Kaanov, V. A. Adv. Drug. Deliv. Rev. 1998, 30, 49. 7 Colfen, H.; Antoniette, M. Langmuir 1998, 14, 682. 8 Gu, L. N.; Shen, Z.; Feng, C.; Li, Y. G.; Lu, G. L.; Huang, X. Y. J. Polym. Sci. Polym. Chem. 2008, 46, 4056. 9 Calaresi, P.; Parks, R. E. The Pharmacological Basis of Therapeutics, Macmillan, New York, 1975, p. 1254. 10 Calaresi, P.; Chaner, B. A. The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eds.: Goodman, L. S.; Gilman, A., Macmillan, New York, 1991, p. 1202. 11 Li, Y.; Kwon, G. S. Pharmcol. Res. 2000, 17, 607. 12 Kang, H.; Kim, J. D.; Han, S. H.; Chang, I. S. J. Controlled Release 2002, 81, 35. 13 Liang, L. S.; Jackson, J.; Min, W. X.; Risovic, V.; Wasan, K. M.; Burt, H. M. J. Pharmcol. Sci. 2004, 93, 943. 14 Patri, A. K.; Kukowska-Latallo, J. F.; Baker, J. R. Adv. Drug Delivery Rev. 2005, 57, 2203. 15 Modi, S.; Jain, J. P.; Dom, A. J.; Kumar, N. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2006, 64, 277. 16 Dhanikula, R. S.; Hildgen, P. Biomaterials 2007, 28, 3140. 17 Peng, D.; Li, Y. G.; Zhang, X. H.; Lu, G. L.; Feng, C.; Huang, X. Y. Acta Chim. Sinica 2007, 65, 2144 (in Chinese). ( 彭丹, 李垚功, 张晓环, 陆国林, 冯纯, 黄晓宇, 化学学报, 2007, 65, 2144.) 18 Yan, Z. Q.; Zhong, Y. G.; Wei, Y. Q. West China J. Pharm. Sci. 1999, 14, 302 (in Chinese). ( 严忠勤, 钟裕国, 魏于全, 华西药学杂志, 1999, 14, 302.) 19 Caldwell, G.; Meirim, M. G.; D Na, D. D.; Neuse, E. W. J. Appl. Polym. Sci. 2006, 100, 3415. (A0807183 QIN, X. Q.)