科技导报 2016,34(2) 细粒棘球绦虫新疆株胆汁酸钠协同转运蛋白基因的克隆及序列分析 1,2 杨梅, 梁小弟 2, 李军 3, 李亮 3, 张富春 1 3, 张文宝 1. 新疆大学生命科学与技术学院, 新疆生物资源基因工程重点实验室, 乌鲁木齐 830046 2. 新疆医科大学基础医学院, 乌鲁木齐 830011 3. 新疆医科大学第一附属医院, 新疆重大疾病医学重点实验室 省部共建国家重点实验室培育基地, 摘要 乌鲁木齐 830011 从新疆株细粒棘球绦虫 (Echinococcus granulosus,eg) 原头蚴中克隆胆汁酸钠协同转运蛋白 (sodium-bile acid co transporter,egsbact) 基因, 进行序列测定和生物信息学分析 首先设计 EgSBACT 基因特异性引物, 用 RT 及 PCR 方法从新 疆株细粒棘球绦虫原头蚴提取总 RNA, 将其反转录成 cdna 后扩增 EgSBACT 基因并将其克隆至原核表达载体 pet30a 中, 测序 鉴定序列并进行生物信息学分析 结果显示,RT-PCR 扩增出一长度约 650 bp 的基因, 测序显示其长度为 654 bp, 序列与 Gen bank 公布的 EUB59978.1 完全一致, 其编码 217 个氨基酸, 预测其等电点为 9.28 同源性分析发现,EgSBACT 蛋白序列与中华 枝睾吸虫 SBACT(GenBank:GAA57409.1) 同源性最高, 达到 43% 进化树分析表明, 细粒棘球绦虫的 SBACT 蛋白与吸虫纲的 SBACT 相聚集, 在进化树上处于一枝, 而与其他物种亲缘性较远 由此表明, 本研究成功克隆出细粒棘球绦虫 EgSBACT 基因 关键词 细粒棘球绦虫 ;EgSBACT; 序列分析 包虫病是由细粒棘球绦虫 (Eg) 引起, 可导致人类相当高的致病率和死亡率, 这种全球性的疾病是很难诊断 治疗和 [1] 控制的 中国西北广大农牧区是细粒棘球蚴所致囊型包虫 [2] 病 (cystic echinococcosis,ce) 的主要流行区 细粒棘球绦虫生活史经历虫卵 六钩蚴 原头蚴 成虫等多个阶段, 原头 [3] 蚴发育阶段是引起人体包虫病的关键环节 细粒棘球绦虫生物学的一个显著特征是原头蚴有双向发育的潜能 幼虫被狗摄食后将在其肠中向有性方向发育以形成成虫 与此相反, 如果一个包虫囊泡在中间宿主或人体内破裂, 每个释放的原头蚴能够无性分化成一个新的包虫囊泡, 意味着二级囊泡的结果 在包囊中的幼虫具有一个独一无二的特征是双向发育的能力, 在狗的胃肠道发育成成虫或者在中间宿主 ( 人 ) 发育成二级包囊, 发育成成虫是受胆汁 [4] 酸引发的过程 已显示胆汁酸在原头蚴向成虫分化中有重要作用, 并且细粒棘球绦虫可表达胆汁酸受体和转运蛋白来刺激相关通路 已确定了几种胆汁酸通路的下游信号转导 成分, 在细粒棘球绦虫基因组或者转录组没有发现 TGR5 类 似的受体, 但确定了 4 个基因作为胆汁酸信号的核激素受体 候选基因 (EG_00119 EG_00780 EG_04405 和 EG_08428), 它 们编码的蛋白与法尼酯 X 受体 (FXR) 和维生素 D 受体 (VDR) 有超过 20% 的氨基酸一致性并且包含一个 DNA 结合结构域 和一个配体结合结构域 还发现了编码 5 种胆汁酸钠协同转 运蛋白和 7 种多药拮抗蛋白 (MRPs) 的基因 [5], 还有胆汁酸代 谢相关基因, 包括固醇调节元件结合蛋白 1 和胆汁酸葡萄糖 苷酶相关蛋白 蜕皮激素或其他性类固醇激素可以在寄生 [6,7] 线虫通过核激素受体调节蜕皮, 因此假设从宿主来的外在 胆汁酸以一个类似的方式在细粒棘球绦虫发育中起重要作 用是合理的 [1] 胆汁酸在原头蚴分化中发挥作用, 首先转运进入细胞, 胆汁酸钠协同转运蛋白是关键蛋白 本研究从新疆株细粒 棘球蚴中克隆出一种胆汁酸钠协同转运蛋白基因 EG_05139 (GenBank: EUB59978.1), 并进行序列测定 生物信息学分析 收稿日期 :2015-04-13; 修回日期 :2015-06-16 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (31260272); 新疆医科大学科研创新基金项目 (XYDCX201423) 作者简介 : 杨梅, 博士研究生, 研究方向为新疆重大疾病的分子生物学机制, 电子信箱 :768144163@qq.com; 张文宝 ( 通信作者 ), 研究员, 研究方向为包虫病的防控, 电子信箱 :wenbaozhang2013@163.com; 张富春 ( 共同通信作者 ), 教授, 研究方向为包虫病的防控, 电子信箱 :zfcxju@xju.edu.cn 引用格式 : 杨梅, 梁小弟, 李军, 等. 细粒棘球绦虫新疆株胆汁酸钠协同转运蛋白基因的克隆及序列分析 [J]. 科技导报, 2016, 34(2): 215-220; doi: 10.3981/ j.issn.1000-7857.2016.2.036 215
科技导报 2016,34(2) 1 材料与方法 1.1 主要材料细粒棘球蚴和 pet30a 原核表达载体由新疆医科大学第一附属医院医学研究中心新疆包虫病基础医学重点实验室提供 总 RNA 提取试剂和反转录试剂盒均购自 Thermo Sci entific 生物技术有限公司 限制性核酸内切酶 DNA 连接酶均购自大连宝生物公司 引物由上海生物工程有限公司合成 其他生物化学试剂均购自上海生物工程有限公司 1.2 方法 1.2.1 EgSBACT 基因全长的查找及引物设计根据 Genbank 中已公布的 EgSBACT(EG_05139,Gen Bank: EUB59978.1) 序列, 用 Primer Premier 5.0 设计引物 合成 EgSBACT 上游引物 P1(5 cgcggatccatgccattgat GCTCTTCATCTACGGCC 3 ) 和下游引物 P2(5 ataagaat GCGGCCGCCTAGGGGATTATCGTTTCAAAATTCTGATCCTT C 3, 斜体字母为酶切位点, 小写字母为保护碱基 ), 上下游引物总长度约 85 bp 依据选用的原核表达载体 pet-30a 的酶切位点图谱, 分析 pet-30a 多克隆位点含有 BamH I 及 Not I 酶切位点, 且酶切效率较高, 在上下游引物 5 端分别有 BamH I 及 Not I 酶切位点及保护碱基, 不会对 EgSBACT 基因进行酶切作用而影响构建和表达 1.2.2 总 RNA 的提取及 cdna 合成从新疆绵羊包虫病肝采集得到细粒棘球绦虫的原头蚴, 迅速置于液氮中冻存 用 Trizol 法提取总 RNA 总 RNA 经核酸蛋白测定仪 ND1000 定量, 由甲醛变性凝胶电泳检测纯度, 以纯度和完整性符合要求的总 RNA 为模板反转录合成 cd NA 反转录之前要将总 RNA 中残余的 DNA 用 DNAse I 消化, 以排除后续 PCR 实验中的 DNA 干扰 此实验步骤基于 Thermo Scientific 公司 kit 1.2.3 EgSBACT 基因的扩增取 2 μl 细粒棘球蚴 cdna 为模板, 以合成的 EgSBACT 上下游引物 P1,P2 为引物,PCR 反应条件为 95 5 min;95 30 s,55 30 s,72 1 min, 共 30 个循环 ;72 7 min PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳检测, 切胶回收目的片段 经 BamH I 及 Not I 双酶切回收的目的片段和 pet30a 原核表达质粒后, 再经琼脂糖凝胶电泳检测及回收, 回收经双酶切的目的片段和 pet30a 质粒, 通过 T 4DNA 连接酶连接成重组质粒, 转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3), 进行 37 液体培养 取 150 μl 转化的大肠杆菌培养液涂板 (Kana+),37 过夜培养, 挑选菌落进行 PCR 检测, 扩大培养阳性克隆, 从阳性克隆菌液中提取重组质粒送测序及进行双酶切鉴定,PCR 鉴定 ( 用 EgSBACT 上下游引物 P1 及 P2 扩增 ) 送菌液及重组质粒 pet30a-egsbact 至上海生工生物工程有限公司和华大生物有限公司测序, 确定其插入片段正确, 测序采用 Sanger 测序法, 使用 pet- 30a 载体引物, 上游引物 T7: 5 ACATC CACTTTGCCTTTCTC 3, 下游引物 T7 TER: 5 TGCTAGT TATTGCTCAGCGG 3, 双向测序 1.2.4 新疆株细粒棘球蚴 EgSBACT 的序列分析基因序列同源性分析采用美国国立生物信息中心 (NC BI) 网站 BLAST(basic local alignment search tool,http://www. ncbi.nim.nih.gov/blast) 程序完成, 进化树分析采用 Mega5 软件完成 2 结果与分析 2.1 EgSBACT 基因的 RT-PCR 扩增经 RT-PCR 扩增, 获得一条长约 650 bp 的特异性扩增条带, 与预期扩增的目的片段大小相符 ( 图 1) M DNA 标准 DL 2000;1 EgSBACT 基因 RT-PCR 产物 ; 2,3,5 阳性基因对照 ;4 阴性水对照图 1 基因的 RT-PCR 扩增结果 Fig. 1 Results of amplification of gene by RT-PCR 2.2 EgSBACT 基因的克隆与鉴定挑取菌落为模板, 采用菌落 PCR 方法进行阳性克隆鉴定, 得到与预期相符的约 650 bp 的特异性片段 重组质粒采用 BamHⅠ 和 NotⅠ 进行双酶切, 酶切结果与预期相符 ( 图 2) M DNA 标准 DL 2000;1 未酶切的重组质粒 pet30a-egsbact; 2 重组质粒的 BamHⅠ/NotⅠ 双酶切鉴定图 2 重组质粒 pet30a-egsbact 的双酶切鉴定 Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pet30a- EgSBACT by enzyme digestion 2.3 EgSBACT 基因的序列测定对鉴定为阳性的重组质粒插入序列进行序列测定, 结果 216
科技导报 2016 34 2 表明 测序结果与 Genbank 已公布的 EUB59978.1 序列完全一 扁形动物门 人类的一种 SBACT5 与绵羊的预测 SBACT5 相 氨基酸残基 预测该蛋白相对分子量约为 24 kd pi 为 9.28 的预测 SBACT4 同源性相对较近 犬属的回肠 SBACT 与绵羊 致 图 3 该基因的开放阅读框由 654 bp 组成 编码 217 个 聚集 在进化树上处于一枝 犬属的预测 SBACT1 同型与绵羊 的预测回肠 SBACT4 相聚集 在进化树上处于一枝 同源性相 对较近 脊椎动物与昆虫及寄生虫类动物的亲缘关系较远 人的 SBACT 与绵羊 犬科动物的 SBACT 家族成员相接近 但 与 EgSBACT 亲缘性较远 3 讨论 包虫 棘球蚴 病是由 Eg 引起的重要的人畜共患寄生虫 病 呈世界性分布[8] 中国是包虫病的重灾区 全国 23 个省 自治区人畜间原发性流行 发病面积占全国总面积的 86.9 [9] 西北地区人群平均患病率为 1%~2%[10] 藏族人群的患病率可 达 12% 人体包虫病以慢性消耗为主 晚期患者常常丧失劳 动能力 包虫病目前的治愈手段为手术摘除包囊 国外手术 死亡率为 1.7 ~10.9 不等[11] 中国手术死亡率为 0.16 但 因包虫囊结构的多样 生长的多部位性和幼虫原头蚴可在病 人体内继发性感染 手术后有 12.8%~20.2 的患者复发 包 虫病手术及治疗费很高 一般肝包虫外科手术每例约需 8000 元以上 由于包虫病在中国西部地区流行非常严重 国家已 将该病列入免费治疗救助计划 并给予专项经费用于防控 但几年的实践表明包虫病的控制非常困难 急需技术措施的 突破 控制包虫病 各国流行都以 切断病原循环链 为方针 从管理 教育和实施必要技术措施 3 个方面开展综合控制 其 内容包括宣传教育 严格的牲畜屠宰管制和对犬的一年 8 次 定期驱虫 经过 30~40 年的努力 冰岛 新西兰和澳大利亚的 塔斯马尼亚岛对包虫病取得了控制 但在其他国家包虫病仍 然高发流行 在中国 由于该病的流行涉入了许多社会因 素 比如居民自宰自食的生活习惯等 以及庞大的中间宿主 群 羊 使得这些措施很难实施 由于犬的数量远远少于中 间宿主的数量 对犬进行免疫预防可以大大简化控制措施[12] 综合防治试点已经证明在病原循环链中切断终末宿主这个 环节是可以控制并消灭棘球蚴病的 [13] 进行犬抗 Eg 疫苗研 制首先必须对 Eg 成虫的发育机制 尤其对分子调控机制作深 图3 Fig. 3 Query Genbank 已公布的 EUB59978.1 序列 入的研究 才能取得突破 成虫分化最重要的一个培养条件 Sbjct 插入序列(测序结果) 是培养基是否有犬胆汁 加入胆汁原头蚴则向成虫发育 重组质粒 pet30a-egsbact 的插入基因序列测序结果 无胆汁原头蚴则发育为包囊 而犬胆汁的主要成分是胆汁 Sequencing results of the insertion gene sequence 酸 胆汁酸经常以钠盐的形式存在 故也称胆汁酸盐 并且 of recombinant plasmid pet30a-egsbact 已经预测到了 Eg 专门运输胆汁酸盐的蛋白基因和胆汁酸盐 作用的靶蛋白基因[1] 2.4 EgSBACT 蛋白的进化树分析 人类胆汁酸池容积为 2~4 g 肝脏合成的胆汁酸分泌进 采用 Mega 5 软件对用 ncbi.nim.nih.gov/blast 所选择物种 入肠道后大部分被重吸收 但每天仍有约 600 mg 的胆汁酸经 球绦虫的 SBACT EgSBACT 与吸虫纲的 SBACT 相聚集 在进 600 mg 的胆汁酸[14] 在肝脏胆固醇是合成胆汁酸的原料 也 的 SBACT 蛋白进行进化树分析 图 4 从进化树看出 细粒棘 化树上处于一枝 而与其他物种亲缘性较远 这与动物分类 学相一致 细粒棘球绦虫属绦虫纲 绦虫纲与吸虫纲同属于 大便排出 为了维持胆汁酸池的平衡 肝脏每天合成大约 是体内胆固醇的主要消除方式 人体肝细胞合成胆汁酸主要 有两条途径 经胆固醇 7α-羟化酶 cholesterol 7α-hydroxy 217
科技导报 2016 34 2 0 EG_05139 217Aa sodium-bile acid cotransporter GenBank: EUB59978.1 1 ileal sodium/bile acid cotransporter (Clonorchis sinensis) GenBank: GAA57409.1 2 sodium-bile acid cotransporter (Schistosoma mansoni) NCBI Reference Sequence: XP_002580711.1 3 sodium-bile acid cotransporter related (Schistosoma mansoni) GenBank: CCD79974.1 4 sodium-bile acid cotransporter related (Schistosoma mansoni)1 NCBI Reference Sequence: XP_002574050.1 5 Hypothetical protein CBG13872 (Caenorhabditis briggsae) NCBI Reference Sequence: XP_002634773.1 6 Protein Y71G10AR.1 (Caenorhabditis elegans) NCBI Reference Sequence: NP_500176.1 7 sodium-bile acid cotransporter, putative (Ixodes scapularis) NCBI Reference Sequence: XP_002400798.1 8 hypothetical protein DAPPUDRAFT_206282 (Daphnia pulex) GenBank: EFX89032.1 9 GJ16857 (Drosophila virilis) NCBI Reference Sequence: XP_002057030.1 10 Ileal sodium/bile acid cotransporter (Crassostrea gigas) GenBank: EKC34011.1 11 hypothetical protein LOAG_02115 (Loa loa) NCBI Reference Sequence: XP_003137701.1 12 GH24476 (Drosophila grimshawi) NCBI Reference Sequence: XP_001991944.1 13 GF21239 (Drosophila ananassae) NCBI Reference Sequence: XP_001963855.1 14 Sodium Bile acid symporter family protein (Brugia malayi) NCBI Reference Sequence: XP_001894577.1 15 Ileal sodium/bile acid cotransporter (Acromyrmex echinatior) GenBank: EGI70330.1 16 hypothetical protein WUBG_05013 (Wuchereria bancrofti) GenBank: EJW84078.1 17 lleal sodium/bile acid cotransporter (Harpegnathos saltator) GenBank: EFN78725.1 18 PREDICTED: solute carrier family 10 member 6-like (Strongylocentrotus purpuratus) NCBI Reference Sequence: XP_781101.3 19 PREDICTED: uncharacterized protein LOC579660 (Strongylocentrotus purpuratus) NCBI Reference Sequence: XP_784857.3 20 PREDICTED: P3 protein-like (Takifugu rubripes) NCBI Reference Sequence: XP_003967039.1 21 sodium Bile acid symporter family protein (Trichinella spiralis) NCBI Reference Sequence: XP_003371191.1 22 hypothetical protein BRAFLDRAFT_68463 (Branchiostoma floridae) NCBI Reference Sequence: XP_002594095.1 23 hypothetical protein, partial (Kyphosus elegans) GenBank: AFE55975.1 24 canalicular multispecific organic anion transporter 2 [Mus musculus] 25 bile acid:sodium cotransporter [Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344] GenBank: CCH38171.1 26 sodium/bile acid cotransporter family protein [Brucella melitensis NI] GenBank: AEQ09242.1 27 Sodium/bile acid cotransporter 7-B Na(+)/bile acid cotransporter 7-B; Solute carrier family 10 member 7B; xp7 [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Weltevreden str. 2007-60-3289-1] NCBI Reference Sequence: YP_006886891.1 28 Solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 5 [Homo sapiens] GenBank: AAI36632.1 29 solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 3, isoform CRA_a [Homo sapiens] GenBank: EAW72697.1 30 ileal sodium/bile acid cotransporter [Canis lupus familiaris] GenBank: CAE46079.1 31 ileal sodium/bile acid cotransporter [Canis lupus familiaris] NCBI Reference Sequence: NP_001002968.1 32 PREDICTED: sodium/bile acid cotransporter isoform 1 [Canis lupus familiaris] NCBI Reference Sequence: XP_537494.2 33 PREDICTED: ileal sodium/bile acid cotransporter [Ovis aries] NCBI Reference Sequence: XP_004012282.1 34 PREDICTED: sodium/bile acid cotransporter 5 [Ovis aries] NCBI Reference Sequence: XP_004012080.1 35 PREDICTED: sodium/bile acid cotransporter 4, partial [Ovis aries] NCBI Reference Sequence: XP_004010111.1 图4 Fig. 4 不同物种 SBACT 蛋白的进化树分析 Analysis of phylogenetic tree of SBACT protein from different species lase CYP7A1 的经典途径和 27α羟化酶 27α-hydroxy1ase 肠道胆汁酸结合蛋白 intestinal bile acid binding protein IB 者合成 由于结合胆汁酸以阴离子的形式存在从而不能以 后的胆汁酸经门静脉入肝窦状隙由肝细胞表面具有胆汁酸 CYP27A1 的替代途径 成人体内 90 95 的胆汁酸由前 扩散的形式通过细胞膜 这就需要借助一些转运蛋白的帮助 [15] 来完成整个循环 胆盐输出泵 BSEP 多药耐药性相关蛋 白 2 multidrug resistance-associated protein 2 MRP2 和多药 耐药性 3 multidrug resistance 3 MDR3 将肝细胞内的胆汁酸 ABP 结合 由 OSTα/β异源二聚体介导进入门静脉血液 结合 高 亲 和 力 的 牛 磺 胆 酸 钠 转 运 蛋 白 sodium taurocholate co- transporting polypeptide NTCP 介导进入肝细胞并完成一个 循环[16,17] 在原核和真核生物都发现了溶质运输蛋白家族 10 pro 泵入胆小管 其中 BSEP 主要运输单价胆汁酸 MRP2 运输二 teins of solute carrier family10 SLC10 sodium bile acid co 粒 能将肝细胞合成的胆汁酸转运至胆管 胆汁酸进入肠道 白 Na+/bile acid cotransporters 组成 SLC10A2 SLC10 成员 2 价胆汁酸和胆红素 MDR3 运输胆汁酸与胆固醇的混合微胶 后 大多数在回肠末端依靠顶端胆汁酸钠协同转运蛋白 api cal sodium bile acid transporter ASBT 进入肠上皮细胞后与 218 transporter family SBF 这个家族由 Na +/胆汁酸协同转运蛋 还 称 为 回 肠 Na +/胆 汁 酸 转 运 蛋 白 基 因 ileal Na +/bile acid transporter gene ISBT 或者称顶尖钠依赖的胆汁酸盐转运
科技导报 2016,34(2) 蛋白基因 (apical sodium-dependent bile salt transporter gene, ASBT) 定位在人 13q33, 并且这个基因产物在从回肠和肾脏 [18] 吸收胆汁酸上起决定性作用 胆汁是一种向药性的溶液 华支睾吸虫的幼虫表现出向胆汁的趋化性和在胆汁中长成成虫 胆汁的成分被认为激活了华支睾吸虫幼虫的趋化迁移 胆汁对胃肠道寄生虫提供了一个关键的暗示 它激活了代谢通路并且增加了寄生虫的运动性是众所周知的 胆汁的作用方式尚不清楚, 但认为是诱导了非特异性的刺激而导致了肌肉运动 至于华支睾吸虫的情况, 在目前的研究中观察证实胆汁既增强了后囊蚴脱囊也增加了它们的运动力 这些研究结果支持以前 [19] 的观点, 认为胆汁是肠道寄生虫的重要激活剂之一 在细粒棘球绦虫基因组或者转录组中已发现胆汁酸的核受体候选基因和胆汁酸钠协同转运蛋白和多药拮抗蛋白 [1] (MRPs) 的基因 本研究组结合前期工作, 已从新疆株细粒棘球蚴中克隆出胆汁酸核受体基因, 在 Eg, 推测胆汁酸钠协同转运蛋白可将宿主的胆汁酸转运进入 Eg 细胞内, 从而与其细胞内的胆汁酸核受体相结合而发挥调控 Eg 发育分化作用 本研究成功地从新疆株细粒棘球蚴中克隆出 EgSBACT 基因, 测序结果与 Genbank 中已公布的 EgSBACT(GenBank: EUB59978.1) 完全一致 同源性分析发现,EgSBACT 蛋白与中华枝睾吸虫 SBACT 蛋白 (GenBank:GAA57409.1) 同源性最高, 达到 43%(93/214)~61% (131/214), 与曼森氏裂体吸虫次之, 达到 41%(91/223)~60%(135/223); 而与丝虫 线虫 人 及犬 绵羊同源性在 26%~34% 对 SBACT 蛋白进行进化树分析, 从进化树看出, 细粒棘球绦虫的 SBACT 蛋白与吸虫纲的 SBACT 蛋白相聚集, 在进化树上处于一枝, 而与其他物种亲缘性较远, 这与动物分类学相一致, 细粒棘球绦虫属绦虫纲, 绦虫纲与吸虫纲同属于扁形动物门 人的 SBACT 与绵羊 犬科动物的 SBACT 家族成员相接近, 但与 EgSBACT 亲缘性较远, 符合物种进化规律 4 结论从新疆株细粒棘球蚴中扩增出 EgSBACT 基因并克隆至原核表达载体 pet30a 上, 测序结果与 Genbank 中公布的 EgS BACT 完全一致, 显示已成功构建了原核重组表达质粒 pet30a-egsbact 同源性分析发现,EgSBACT 蛋白与中华枝睾吸虫 SBACT 蛋白 (GenBank:GAA57409.1) 同源性最高 蛋白进化树分析,EgSBACT 蛋白与吸虫纲的 SBACT 蛋白在进化树上处于一枝 参考文献 (References) [1] Zheng H, Zhang W, Zhang L, et al. The genome of the hydatid tape worm Echinococcus granulosus[j]. Nature Genetics, 2013, 45(10): 1168-1175. [2] 余森海. 棘球蚴病防治研究的国际现状和对我们的启示 [J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2008, 26: 241-244. Yu Senhai. The international situation on prevention and treatment of echinococcosis and its enlightenment to us[j]. Journal of Parasitic and Parasitic Diseases in China, 2008, 26: 241-244. [3] Eckert J, Deplazes P. Biological,epidemiological, and clinical aspects of echinococcosis.a zoonosis of increasing concern[j]. Clinical Microbiolo gy Reviews, 2004, 17(1): 107-135. [4] Smyth J D. In vitro Cultivation of Parasitic Helminths[M]. Boca Raton: CRC Press, 1990. [5] Hirohashi T, Suzuki H, Takikawa H, et al. ATP-dependent transport of bile salts by rat multidrug resistance-associated protein 3 (Mrp3)[J]. Bi ology Chemistry, 2000, 275(4): 2905-2910. [6] Hernández-Bello R, Ramirez-Nieto R, Muñiz-Hernández S, et al. Sex steroids effects on the molting process of the helminth human parasite Trichinella spiralis[j]. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2011, 2011: 1-10. [7] Tzertzinis G, Egana A L, Palli S R, et al. Molecular evidence for a func tional ecdysone signaling system in Brugia malayi[j]. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2010, 4(3): e625. [8] McManus D P, Zhang W, Li J, et al. Echinococcosis[J]. Lancet, 2003, 362(9392): 1295-1304. [9] Chi P S, Fan Y L, Zhang W B, et al. The epidemic situations of cystic echinococcosis in China[J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 1989, 10(1): 35-38. [10] Coordinating Office of the National Survey on the Important Human Parasitic Diseases. A national survey on current status of the impor tant parasitic diseases in human population[j]. Journal of Parasitic and Parasitic Diseases in China, 2005, 23(Suppl 5): 332-340. [11] Mandal S, Deb Mandal M. Human cystic Echinococcosis: Epidemiolog ic, zoonotic, clinical, diagnostic and therapeutic aspects[j]. Asian Pa cific Journal of Tropical Medicine, 2012, 5(4): 253-260. [12] Craig P S, Larrieu E. Control of cystic echinococcosis/hydatidosis: 1863-2002[J]. Advances in Parasitology, 2006, 61: 443-508. [13] Zhang W, Zhang Z, Yimit T, et al. A pilot study for control of hyperen demic cystic hydatid disease in China[J]. PLoS Neglected Tropical Dis eases, 2009, 3(10): e534. [14] Johnston I, Nolan J, Pattni S, et a1. New insights into bile acid malab sorption[j]. Current Gastroenterology Report, 2011, 13(5): 418-425. [15] Chiang J Y. Bile acids: Regulation of synthesis[j]. Journal Lipid Re search, 2009, 50(10): 1955-1966. [16] KostersA, Karpen S J. Bile acid transporters in health and disease[j]. Xenobiotica, 2008, 38(7/8): 1043-1071. [17] 何静宇, 雷正明, 付文广. AMPK 在胆汁酸代谢中的调节作用 [J] 国际外科学杂志, 2013, 40(1): 54-57. He Jingyu, Lei Zhengmin, Fu Wenguang. Regulation of AMPK in bile acid metabolism[j]. International Journal of surgery, 2013, 40(1): 54-57. [18] Zou X, Wang D, Qiu G, et al. Molecular cloning and characterization of a novel human C4orf13 gene, tentatively a member of the sodium bile acid cotransporter family1[j]. Biochemical Genetics, 2005, 43(4): 165-173. [19] Li S, Kim T I, Yoo W G, et al. Bile components and amino acids af fect survival of the newly excysted juvenile clonorchis sinensis in maintaining media[j]. Parasitology Research, 2008, 103(5): 1019-1024. 219
科技导报 2016,34(2) Molecular cloning and sequence analysis of sodium-bile acid cotransporter from Echinococcus granulosus in Xinjiang, China YANG Mei 1,2, LIANG Xiaodi 2, LI Jun 3, LI Liang 3, ZHANG Fuchun 1, ZHANG Wenbao 3 1. Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China 2. Basic Medical College, Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, China 3. State Key Laboratory Incubation Base of Xinjiang Major Diseases Research, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China Abstract Sodium- bile acid cotransporter (EgSBACT) functions in the sodium- bile acid transportation in Echinococcus granulosus (Eg) Protoscolex and the sequence is unknown. The specific primers for EgSBACT mrna are designed and the EgSBACT gene is amplified by RT-PCR from Eg protoscolex total RNA. Then the EgSBACT gene fragment is cloned into pet30a vector which is a prokaryotic expression vector for sequencing and analyzing by bioinformatics method. The PCR products of EgSBACT is about 650 bp whose length is 654 bp and encodes a protein containing 217 amino acids and the pi of this protein is predicted as 9.28. Homology analysis shows that there is 43% of similarity between EgSBACT and the trematode SBACT (GenBank: GAA57409.1). Phylogenetic analysis shows that EgSBACT is clustered with Fluke, and has a lower homology to other species. EgSBACT gene is cloned from protoscolex of Echinococcus granulosus in Xinjiang, which lays a foundation for further study of EgSBACT function in the development and differentiation of PSCs into adult worms. This research provides a way to express the EgSBACT protein in vitro and taking advantage of this protein further research can reveal the exact functions of EgSBACT in the sodium-bile acid transportation in Echinococcus granulosus. Keywords Echinococcus granulosus; EgSBACT; sequence analysis ( 责任编辑 吴晓丽 ) 220