微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn 研究报告 JUL 20, 2011, 38(7): 1022 1030 2011 by Institute of Microbiology, CAS 对蜱致病性球孢白僵菌培养条件的优化 * 孙明任巧云关贵全刘志杰李有全马米玲刘爱红牛庆丽杨吉飞殷宏 * 罗建勋 ( 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃 兰州 730046) 摘要 : 对前期筛选得到的具有生防潜力的杀蜱真菌 Beauveria bassiana AT17 菌株进行相关生物学性状的研究, 建立一套规范的实验室培养的技术和方法, 同时对其液固双相发酵技术进行优化, 在于提供优质高效的生防材料, 为其真菌制剂的规模化生产提供实践和理论基础 通过采用单因素筛选方案对其最适基础培养基 温度 ph 值 碳源 氮源 微量元素及液固双相发酵配方进行研究, 发现该菌株在 PDA PPDA PDAY SDAY SMAY 5 种培养基上均能较好生长, 在 PDA 上生长最快, 在 PDAY 上最大 温度对菌丝的生长和产孢影响显著, 25 C 菌丝生长最快, 且最大 B. bassiana AT17 菌株在 ph 4 10 范围内均可生长, 在偏碱性环境内生长最快, 在 ph 5 6 的偏酸性环境内最大 综合评价真菌各项指标后, 葡萄糖和酵母粉为菌丝生长和产孢的最佳碳源和氮源, 固体物料麦麸 + 玉米粉 + 米粉与基础培养液 3/4 SDAY 按 2:1 均匀混合后, 添加 0.05% K + 可作为菌株固体发酵的最佳物料配方组合 关键词 : 球孢白僵菌, 培养条件, 优化, 蜱 Optimization of cultural conditions of Beauveria bassiana pathogenic for ticks SUN Ming REN Qiao-Yun GUAN Gui-Quan LIU Zhi-Jie LI You-Quan MA Mi-Ling LIU Ai-Hong NIU Qing-Li YANG Ji-Fei YIN Hong * LUO Jian-Xun * (State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Key Laboratory of Animal Parasitology of Gansu Province, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, Gansu 730046, China) Abstract: The aim of this study was to establish and optimize standard laboratory techniques for cultivation and fermentation of a strain of Beauveria bassiana (B. bassiana AT17), which has shown potential biological activity against ticks. This will provide practical and experimental supports for the fur- 基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (No. 2007BAD40B06, 2007BAD40B02); 国家 863 计划项目 (No. 2006AA10A207) * 通讯作者 : 罗建勋 : Tel: 86-931-8342551; : ljxbn@163.com 殷宏 : Tel: 86-931-8342515; : yinhong@caas.net.cn 收稿日期 :2010-11-03; 接受日期 :2011-01-30
孙明等 : 对蜱致病性球孢白僵菌培养条件的优化 1023 ther research on preparation of biocontrol agents. Condition optimization was conducted by single factor experiment. The factors studied were basic culture medium, temperature, ph, carbon sources, nitrogen sources, microelements and liquid fermentation medium. The results showed that B. bassiana AT17 could grow well on PDA, PPDA, PDAY, SDAY and SMAY medium. Comparatively, B. bassiana AT17 had the fastest growth on PDA and the highest spore yields on PDAY. Temperature was the major factor that affects on growth speed and yields of B. bassiana AT17. It showed that 25 C was the optimal temperature for both hyphal growth and the sporulation. B. bassiana AT17 could grow at ph 4 10 with the fastest growth in alkali condition, and produce optimal sporulation at ph 5 6. Based on all of fungal indexes, glucose and yeast were the best carbon and nitrogen sources. The best solid fermentation medium was wheat bran+indian meal+rice flour mixed with 3/4 SDAY containing suitable K + in proportion of 2:1. Keywords: Beauveria bassiana, Cultural conditions, Optimization, Tick 蜱 (Tick) 是一类存在于动物体表的常见外寄生虫, 同时又是森林脑炎 新疆出血热 莱姆病 Q 热 巴贝斯虫病等疾病的传播媒介, 呈世界性分布 由于蜱种类繁多 数量大, 不仅影响动物生产性能, 而且是严重制约畜牧业发展 危害人畜健康的重要因素 [1] 国内外学者已在蜱类防治方面做了大量工作, 虽然蜱的免疫学防治已取得了一些进展, 基于 Bm86 的重组疫苗 Gavac TM 已在古巴等国家注册并商品化, 免疫率可达 55% 100%, 但因目前尚未大面积推广及疫苗生产技术的成本等问题制约了抗蜱疫苗的应用 [2 3] 对蜱的防治仍然是大量重复使用化学杀虫剂, 而生物防治并没有太多报道 目前, 已经研究的能感染蜱的病原微生物主要包括病毒 细菌 真菌及寄生线虫等 4 大类 [4], 其中苏云金芽孢杆菌 白僵菌属 绿僵菌属 斯氏线虫属及异小杆线虫属等被认为是较有前途的病原微生物种类 由于病原微生物具有选择性强 防效高 生产成本低 不污染环境 对人畜无害等特点, 它们越来越多地被研究开发并用于蜱类防治, 尤其病原真菌和寄生线虫为蜱的可持续控制提供了希望 [3] 球孢白僵菌 (Beauveria bassiana) 是寄生昆虫的病原性真菌, 在害虫生物防治上起着重要作用, 可寄生于 15 个目 149 个科的 700 多种昆虫和蜱螨类 [5 6] 继 1986 年首次报道病原真菌可感染微小牛蜱以来, 国外研究学者已利用相关病原真菌对蜱进行了侵染性实验, 并取得可喜的成效 [7 9] 而在国 [10] 内, 除本实验室的任巧云等对白僵菌的杀蜱效果进行研究外, 还未见其他研究报道 笔者等从罹病昆虫 土壤中分离获得 6 株球孢白僵菌菌株, 以浸渍法对小亚璃眼蜱 (Hyalomma anatolicum anatolicum) 和微小牛蜱 (Boophilus microplus) 饱血雌蜱进行毒力测定, 结果表明, 不同菌株对蜱致病力不同, 其中 B. bassiana AT17 菌株在 1 10 7 个 /ml 孢子悬液时, 在 4 12 d 可使所有供试蜱全部死亡, 具有较高的杀蜱毒性 ( 另文发表 ) 另据文献报道, 球孢白僵菌在我国曾有 10 余种商业剂型得到注册, 对农林重要害虫如马尾松毛虫 (Dendrolimus punctantus) 蛴螬 象甲和天牛等已获得较好效果 [11], 尤其我国用于马尾松毛虫的防治每年达到 200 万公顷规模, 并取得了良好的防治效果及显著的经济 生态及社会效益 [12] 我国的白僵菌生产 使用已有 40 年的历史, 产业位居世界第一, 但与世界现有水平相比较仍有一定差距, 尚无现代化程度很高的工业化固态方式生产, 而在当前真菌杀虫剂的生产中, 液固双相培养法由于经济实用 易于操作和生产效率高而被广泛采用 [11,13] 鉴于病原真菌的诸多优点, 对特定的具有良好生防潜力的菌株进行生物学特性的研究可以了解该菌株生长的适宜条件 生存的极限条件及在不同基质上的生长 产孢能力, 同时可作为蜱的天敌微生物资源开发利用 但到目前为止, 国内外尚未研制出用于蜱生物防治的商品化制剂, 因此作者等对前期筛选得到的优势 B. bassiana AT17
1024 微生物学通报 2011, Vol.38, No.7 菌株进行了培养条件的研究, 为更好的利用这一 生物资源, 进一步开发应用该菌株的杀蜱制剂奠定 基础 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验菌株 : 试验用菌株 B. bassiana AT17 于 2010 年 4 月在江苏省射阳县周边地区的潮湿土壤中 分离获得, 经形态学和分子生物学方法鉴定为球孢 白僵菌 1.1.2 基础培养基 : 马铃薯汁培养基 (PDA); PPDA 为 PDA 添加 10 g/l 蛋白胨 ; PDAY 为 PDA 添加 10 g/l 酵母粉 ; 萨氏培养基 (SDAY); SMAY 是 SDAY 中用麦芽糖代替葡萄糖 1.1.3 液体培养基 : 采用不含琼脂的萨氏培养基 (SDAY), 按不同比例缩减葡萄糖的含量, 配制 1/4 SDAY 培养基 1/2 SDAY 培养基 3/4 SDAY 培养基 1/8 SDAY 培养基 SDAY 培养基 1.1.4 固相培养基 : 固相培养基以麦麸为基本组 分, 玉米粉 大米粉 苜蓿粉为辅料, 培养基组分及 配比见表 1 Table 1 表 1 固相培养基组分及配比 Constituent and proportion of fermentation medium 培养基组成 Constituent of fermentation medium 各组分配比 ( 质量比 ) Proportion of fermentation medium Wheat bran 100 Wheat bran+indian meal 95:5 Wheat bran+rice flour 95:5 Wheat bran+alfalfa meal 95:5 Wheat bran+indian meal+rice flour 95:3:2 Wheat bran+indian meal+alfalfa meal 95:3:2 1.2 方法 1.2.1 不同基础培养基对真菌生长和产孢的影响 : 分别将 2 μl 浓度为 1 10 6 个 /ml 孢子悬液无菌条件 下接种在 PDA PPDA PDAY SDAY SMAY 培 养基上, 每处理 3 次重复, 置于 25 C, 湿度为 90% 的恒温保湿温箱内培养, 十字交叉法每日测量菌落 直径, 培养 14 d 后用直径为 0.8 cm 的打孔器在菌落 边缘至中心 1/2 处重复打孔 3 次, 并将打孔器打下的 菌碟分别用相同体积的含 0.05% 吐温 80 灭菌水全 部冲洗下来, 借助血球计数板和显微镜计数后除 以菌碟面积得到其单位面积 (cm 2 ) 的平均, 平 均 = 平均每小格孢子数 4 10 6 稀释倍数 / (0.16 π) 1.2.2 不同温度对真菌生长和产孢的影响 : 将 2 μl 浓度为 1 10 6 个 /ml 孢子悬液无菌条件下接种在 PDAY 培养基上, 分别置于 15 C 20 C 25 C 30 C 35 C 共 5 个温度梯度, 湿度为 90% 的条件 下培养 14 d, 每处理 3 次重复, 菌落直径 及测定同上 1.2.3 不同 ph 值对真菌生长和产孢的影响 : PDAY 培养基灭菌后用除菌过滤的 1 mol/l HCl 和 1 mol/l NaOH 调节 ph 值分别为 4 5 6 7 8 9 10 共 7 个梯度, 分别将 2 μl 浓度为 1 10 6 个 /ml 孢子悬液 无菌条件下接种在不同处理培养基中心, 每处理 3 次重复, 置于 25 C, 湿度为 90% 的恒温保湿温箱内 培养, 菌落直径 及测定同上 1.2.4 不同碳源对真菌生长和产孢的影响 : 在 PDAY 培养基上, 用等重量的无水葡萄糖 麦芽 糖 D- 山梨醇 蔗糖代替碳源葡萄糖, 配成含不同 碳源的培养基 无菌条件下分别接种 2 μl 浓度为 1 10 6 个 /ml 孢子悬液, 每处理 3 次重复, 置于 25 C, 湿度为 90% 的恒温保湿温箱内培养, 菌落直径 生 长速率及测定同上 1.2.5 不同氮源对真菌生长和产孢的影响 : 在 PDAY 培养基上, 用等重量的 NaNO 3 (NH 4 ) 2 SO 4 尿素 L 甘氨酸代替氮源酵母粉, 配成含不同氮 源的培养基 无菌条件下分别接种 2 μl 浓度为 1 10 6 个 /ml 孢子悬液, 每处理 3 次重复, 置于 25 C, 湿度为 90% 的恒温保湿温箱内培养, 菌落直 径 及测定同上 1.2.6 不同微量元素对真菌生长和产孢的影响 : 在 PDAY 培养基中分别添加 0.005% 的 Fe 2 (SO 4 ) 3 ZnSO 4 CuSO 4 MgSO 4 KCl, 以不加微量元素的 PDAY 为对照组, 配成含不同微量元素的培养基 无 菌条件下分别接种 2 μl 浓度为 1 10 6 个 /ml 孢子悬 液, 每处理 3 次重复, 置于 25 C, 湿度为 90% 的恒
孙明等 : 对蜱致病性球孢白僵菌培养条件的优化 1025 温保湿温箱内培养, 菌落直径 及测定同上 1.2.7 不同固体配料物对真菌产孢的影响 : 将固料混合物 ( 表 1) 与 50% 的蒸馏水混合均匀后, 装入广口罐头瓶中灭菌 30 min, 冷却后接入 10% 液体菌 ( 该菌液培养条件是 : 1/4 SDAY 液体 ; 接种量 : 1 10 8 个 /ml 分生孢子悬液 1 ml; 培养温度 : 25 C; 转速 : 180 r/min; 培养时间 : 3 d ) 和 20% 的已灭菌蒸馏水, 每处理 3 次重复, 置于 25 C, 湿度为 90% 的恒温保湿温箱内培养观察生长与产孢情况, 在培养 10 12 和 14 d 后将固体混合物置于 37 C 的真空干燥箱内, 同时在箱内放入无水氯化钙, 直到氯化钙无明显吸水现象, 用粉碎机将固体混合物打成孢子粉, 精确称取 0.5 g 孢子粉用 0.05% 吐温 80 的灭菌水适当稀释后, 借助血球计数板计数测定其单位重量的含孢量, 以 100% 麦麸培养基为对照, 从而筛选出最佳比例的配料 每克菌粉含孢量 = 平均每小格孢子数 4 10 6 稀释倍数 / 称取克数 1.2.8 不同液体培养基对真菌产孢的影响 : 将麦麸与基础培养液 (1/2 SDAY 1/4 SDAY 1/8 SDAY 3/4 SDAY SDAY) 按 2:1 均匀混合后, 装入广口罐头瓶中灭菌 30 min, 冷却后接入 10% 液体菌 ( 该菌液培养条件同上 ) 和 20% 的已灭菌基础培养液, 每处理 3 次重复, 置于 25 C, 湿度为 90% 的恒温保湿温箱内培养观察生长与产孢情况, 在培养 10 12 14 d 后用真空干燥箱干燥后测定其含孢量, 以加蒸馏水的麦麸培养基为对照组, 从而筛选出最佳液体培养基 1.2.9 最佳物料配方对真菌产孢的影响 : 在单因素试验基础上, 取最佳固体物料麦麸 + 玉米粉 + 米粉与基础培养液 3/4 SDAY 按 2:1 均匀混合后, 添加 0.05% K + 为真菌菌株固体发酵的物料配方组合 A, 装入广口罐头瓶中灭菌 30 min, 冷却后接入 10% 液体菌 ( 该菌液培养条件同上 ) 和 20% 的已灭菌蒸馏水, 每处理 3 次重复, 置于 25 C, 湿度为 90% 的恒温保湿温箱内培养观察生长与产孢情况, 在培养 10 12 和 14 d 后用真空干燥箱干燥后测定其含孢量, 以不加 K + 的组合 B 为对照, 从而筛选出最佳比例的配料 组合 1.2.10 最佳物料配方组合下孢子萌发率测定 : 取适量培养 12 d 的 A 配方孢子原粉, 用无菌石英砂和含 0.05% 吐温 80 的灭菌水兑成高浓度的孢子悬浮液, 用移液器在无菌条件下加入含 40 g/l 蔗糖和 10 g/l 蛋白胨的萌发液中, 高速蜗旋振荡, 血球计数板计数后稀释成 1 10 6 个 /ml 悬浮液 将孢子悬液在 25 C±1 C 振荡 (100 r/min) 培养 24 h 后镜检计数萌发和未萌发的孢子数 (>100 个 ), 由此计算萌发率, 每个处理设 3 个重复 1.2.11 数据处理 : 数据应用 DPS 数据处理系统进行统计分析 [14] 2 结果 2.1 不同培养基对真菌生长和产孢的影响对所选培养基进行筛选, 结果表明 ( 表 2), B. bassiana AT17 菌株在 5 种培养基上均能较好的生长, 在 PDA 上最快, 在 SMAY 上次之, 但以来看, 该菌株在 PDAY 上较其它培养基大, 差异显著, 适合做菌株的基础培养基 2.2 不同温度对真菌生长和产孢的影响 B. bassiana AT17 菌株在不同培养温度条件下, 分生孢子萌发 及产孢各不相同 ( 表 3), 在 15 C 35 C 时均能生长, 随着温度的升高菌丝生长加快, 在 20 C 30 C 时菌株长势良好, 其中 25 C 下生长最好, 高于 30 C 后, 菌落随温度升高而缓慢生长, 甚至于不生长 在各温度处理中, 菌株和随温度变化差异显著, 25 C 时和均达到最大值, 温度过高或过低, 对真菌生长和产孢均不利 2.3 不同 ph 值对真菌生长和产孢的影响 B. bassiana AT17 菌株在 ph 4 10 范围内均可生长, 在偏碱性条件下, 菌丝生长较好, ph 值为 8 时可达到 5.28 mm/d ( 表 4) 在 ph 5 6 的偏酸性环境下, 球孢白僵菌明显高于偏碱性条件, ph 值为 6 时最大且差异显著, 所以在固体培养时, 培养基的 ph 值为 6 时最适宜 B. bassiana AT17 菌株的生长和产孢
1026 微生物学通报 2011, Vol.38, No.7 Table 2 培养基 Culture medium 表 2 不同培养基对 B. bassiana AT17 菌株生长及产孢的影响 Effect on growth and the spore yields of the B. bassiana AT17 strain in different culture medium PDA 67.11±1.76 a 4.82±0.09 a 2.43±0.23 b PPDA 64.02±0.57 ab 4.72±0.06 a 0.66±0.19 d PDAY 59.16±2.63 bc 4.21±0.21 b 3.19±0.19 a SDAY 58.09±0.13 c 4.17±0.02 b 0.55±0.10 d SMAY 65.07±0.10 a 4.65±0.01 a 1.00±0.20 c 注 : p<0.05, 同列不同行小写字母不相同代表差异显著, 下表同上. Note: p<0.05, followed by same letter(s) in the same column do not differ statistically at 5% significance, the same as follows. Table 3 温度 Temperature ( C) 表 3 不同温度对 B. bassiana AT17 菌株生长及产孢的影响 Effect on growth and the spore yields of the B. bassiana AT17 strain with different temperature 15 32.97±10.84 bc 2.30±0.11 d 4.87±0.52 d 20 50.23±3.29 ab 3.67±0.17 b 6.31±0.99 c 25 67.70±1.08 a 4.66±0.14 a 11.66±0.50 a 30 45.96±11.37 b 3.28±0.13 c 8.52±0.74 b 35 17.50±1.81 c 1.37±0.07 e 1.27±0.07 e ph Table 4 表 4 不同 ph 值对 B. bassiana AT17 菌株生长及产孢的影响 Effect on growth and the spore yields of the B. bassiana AT17 strain in different ph value 4 56.28±1.51 c 3.96±0.06 c 4.76±0.46 b 5 69.42±2.21 ab 4.91±0.16 b 5.52±0.31 a 6 68.47±2.62 b 5.01±0.14 ab 5.88±0.26 a 7 72.77±0.47 ab 5.10±0.19 ab 3.17±0.23 c 8 73.88±1.22 a 5.28±0.04 a 2.53±0.18 d 9 72.89±0.67 ab 5.18±0.06 ab 1.53±0.23 e 10 69.41±2.43 ab 4.87±0.02 b 1.07±0.16 f 2.4 不同碳源对真菌生长和产孢的影响 B. bassiana AT17 菌株生长和产孢能利用几乎 所有的碳源, 但生长状况各有不同 ( 表 5), 以麦芽糖 和 D- 山梨醇作为碳源时, 菌丝生长健壮且菌丝浓 密, 菌落生长较好 以葡萄糖和 D- 山梨醇作为碳源 时, 菌株较好, 而蔗糖作为碳源时, 菌丝稀 疏, 较低, 不适合该菌株的培养 2.5 不同氮源对真菌生长和产孢的影响供试的几种氮源中, 菌株对尿素的利用较差, 菌丝生长较稀, 几乎不能生长, 而且不产孢 ( 表 6) L 甘氨酸作为氮源时, 菌株菌落直径最大, 生长速 率较快, 是菌丝生长最有利的氮源, 但相比有机氮 源酵母粉, 菌株较低 因此, 为有效利用资源 及其易得性, 有机氮源酵母粉相对经济实用 2.6 不同微量元素对真菌生长和产孢的影响微量元素的单因素筛选结果如表 7 所示, 微 量元素对菌株生长与的影响与对照组差异不显著, 相对对照组而言, Mg 2+ 可促进菌丝的生长, 但对产孢有抑制作用 ; Fe 3+ 虽可促进菌株产孢, 但对菌株生长有抑制作用 因此, 在固体培养时, 菌株所需微量元素的筛选仍需进一步实验探索
孙明等 : 对蜱致病性球孢白僵菌培养条件的优化 1027 Table 5 碳源 Carbon source 表 5 不同碳源对 B. bassiana AT17 菌株生长及产孢的影响 Effect on growth and the spore yields of the B. bassiana AT17 strain with different carbon source Glucose 55.91±1.13 c 3.99±0.17 b 4.99±0.55 a Anhydrous glucose 55.89±0.97 c 3.87±0.15 b 4.00±0.13 ab Maltose 71.23±1.22 a 5.13±0.24 a 4.29±0.05 ab D-Sorbierite 67.36±1.57 b 4.95±0.12 a 5.07±0.68 a Sucrose 57.16±0.80 c 4.04±0.13 b 3.61±0.34 b Table 6 氮源 Nitrogen source 表 6 不同氮源对 B. bassiana AT17 菌株生长及产孢的影响 Effect on growth and the spore yields of the B. bassiana AT17 strain with different nitrogen source Yeast 57.52±2.87 b 4.22±0.25 b 4.90±0.24 a Sodium nitrate 65.06±3.84 b 4.55±0.22 b 1.02±0.08 b Ammonium sulfate 44.51±3.27 c 3.25±0.33 c 1.21±0.35 b Urea 11.37±1.33 d 0.83±0.02 d 0.00±0.00 c L-Glycine 74.93±3.00 a 5.33±0.30 a 1.36±0.08 b Table 7 微量元素 Microelement 表 7 不同微量元素对 B. bassiana AT17 菌株生长及产孢的影响 Effect on growth and the spore yields of the B. bassiana AT17 strain with different microelements CK(Contrast) 56.83±0.89 ab 4.10±0.08 ab 5.18±0.56 a Fe 3+ 51.56±2.20 c 3.79±0.26 b 5.49±0.14 a Zn 2+ 54.75±1.55 b 3.89±0.13 ab 5.15±0.75 a Cu 2+ 54.15±0.71 b 3.87±0.05 ab 3.08±0.25 b Mg 2+ 58.43±0.36 a 4.32±0.54 a 3.40±0.51 b K + 55.96±1.81 ab 3.95±0.05 ab 5.22±0.50 a 2.7 固体基础配方对真菌产孢的影响图 1 表明, 以麦麸为载体的各组合均可 达到 2.0 10 10 个 /g 以上, 虽然麦麸培养基通气性能 好 容易操作, 但其营养成分不全, 物料表面容易干 燥, 不高 以单组分成分与麦麸混配的固体 配方与多组分与麦麸混配的配方相比, 其远 远低于多组分配方 麦麸 玉米粉及米粉的配方培养 14 d 后达到最高, 可达 3.86 10 10 个 /g, 这可能是因为玉米粉和米粉作为主要的碳氮源, 同时对物料的保水能力有一定的影响 2.8 不同液体对真菌产孢的影响如图 2 所示, 接种基础培养液及菌种后, 培养 时间的不同, 各处理组也明显增大, 但由于营养含量 ( 含糖量 ) 越高越促进菌丝的生长, 所以在后期的产孢过程中, 营养过于丰富反而使菌株在这些培养基上产生的分生孢子相对较少 液体培养液 3/4 SDAY 配方较其它液体配方差异显著, 可用于菌株液体发酵的营养来源 2.9 复合配方对真菌产孢的影响由图 3 可知, 相对于其它供试配方来说, 以添加 K + 的 A 配方 200 目过筛下第 10 和 12 天达到最大 同时, 为衡量配方所需的发酵时间, 添加 K + 的 A 配方培养 10 和 12 d 的发酵物较高, 可作为发酵培养所需时间的参考
1028 微生物学通报 2011, Vol.38, No.7 图 1 基础物料上 B. bassiana AT17 菌株不同时期内的情况 Fig. 1 The spore yields of the B. bassiana AT17 strain on materiel in difference phase 注 : P<0.05, 同列不同行小写字母不相同代表差异显著. 以下相同. Note: P<0.05, followed by same letter(s) do not differ statistically at 5% significance. The same as follows. Fig. 2 图 2 基础液对 B. bassiana AT17 菌株不同培养时间内的影响 Effect on the spore yields of B. bassiana AT17 strain for basic liquids in difference incubation time 2.10 原粉萌发率的测定通过上表筛选得出, 培养 12 d 的 A 配方为最佳 物料配方, 以营养萌发法测定得到其原粉孢子萌发 率为 84.61% 90.58%, 这可能是由于干燥时间过长, 导致了部分孢子的失活 3 讨论 通过试验发现, B. bassiana AT17 菌株在 PDAY 培养基上长势较好且高 研究结果同时表明, 该菌在 15 C 35 C ph 值为 4 10 的范围内都能生长, 说明该菌对环境条件的适应范围较广 该菌的最适培养温度为 25 C, 温度过低, 该菌的生长及产孢缓慢甚至受到抑制, 而温度过高则对该菌也产生影响, 生长停滞, 甚至于不产孢 球孢白僵菌生长发育需要的营养物质包括碳水化合物 氮素和微量元素, 由表 5 可以看出, 该菌
孙明等 : 对蜱致病性球孢白僵菌培养条件的优化 1029 Fig. 3 图 3 各组合对 B. bassiana AT17 菌株不同时期内的影响 Effect on the spore yields of B. bassiana AT17 strain with different compounds 能利用多种单糖 多糖及醇类做为碳源, 由于不同 碳源价格的差异, 葡萄糖可作为最佳碳源的筛选, 这与程国华等对球孢白僵菌碳源筛选的结果相一致 [15] 氮素是真菌合成氨基酸 蛋白质 核酸和细胞质的主要成分, 尿素对球孢白僵菌菌丝的生长和 [16 17] 产孢有抑制作用, 这与王芊 纪明山等的研究有类似的结果, 在实际生产中应尽量避免尿素作为产孢培养基的氮源 L 甘氨酸作为氮源时菌丝优于其他氮源, 但较少 从表 6 可知, 球孢白僵菌对有机氮源的利用远远高于无机氮源, 酵母粉为最佳氮源的首选 微量元素作为酶的组成部分并维护其活性, 调节细胞渗透压, 氧化还原电位等, 是真菌生长过程不可缺少的成分, 而本实验未能筛选出有效的微量元素, 还有待于进一步实验探索 培养基成分是影响球孢白僵菌的重要因素之一, 固体培养基的优劣及其组配直接决定了菌株产孢能力, 因此对固体培养基的配方进行筛选是十分必须的 本试验采用以麦麸为主, 加入少量的玉米粉 米粉及苜蓿粉的培养基配方初步研究了适合培养 B. bassiana AT17 菌株的液固两相培养基和提高其的相关条件 结果表明 : 3/4 SDAY 可用于液相培养, 麦麸 + 玉米粉 + 米粉组合最高, 可用于固相培养, 适量添加 K + 验证后, 明显 增加, 培养 12 d 后, 原粉高达 1.64 10 11 个 /g, 100 目过筛下可达 2.09 10 11 个 /g, 200 目过筛下可达 2.90 10 11 个 /g, 这与合肥农药厂和江西天人生态工业有限责任公司生产的油悬浮剂和可湿性行粉剂含孢量相差不大 [18], 可以满足工业化生产的需要, 同时为考虑节约成本, 以 10 12 d 为参考培养时间 在固相培养过程中, 麦麸培养基能增加透气性, 提高其他组分的利用率, 添加微量元素 K + 为菌株的生长和产孢提供了良好的营养和空间环境, 这样使农业生产废料变废为宝, 既降低了培养成本, 又能增加孢子产量, 还能适当地缩短生长周期, 为进一步降低球孢白僵菌制剂生产成本提供了一个新的途径 参考文献 [1] Socolovschi C, Doudier B, Pages F, et al. Ticks and human tick-borne diseases in Africa[J]. Médecine tropicale, 2008, 68(2): 119 133. [2] de la Fuente J, Rodríguez M, Montero C, et al. Vaccination against ticks (Boophilus spp.): the experience with the Bm86-based vaccine Gavac[J]. Genetic Analysis Biomolecular Engineering, 1999, 15(3/5): 143 148. [3] 高志华, 刘敬泽. 蜱类防治研究进展 [J]. 寄生虫与医学昆虫学报, 2003, 10(4): 251 256. [4] Samish M, Řeháček J. Pathogens and predators of ticks and their potential in biological control[j]. Ann Rev Entomol, 1999, 44: 159 182.
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