葡萄糖胺衍生物萃取與生醫材料改質應用 Extraction of glucosamine derivatives and the applications on the modification of biomedical materials 研究生 : 張耀中 (Yao-Chung Chang) 指導教授 : 王鐘毅 (Prof. Chung-Yih Wang) 大同大學 生物工程研究所 碩士論文 Thesis for Master of Science Department of Bioengineering Tatung University 中華民國九十七年十二月 Dec 2008
誌謝 感謝指導教授王鐘毅博士及許垤綦博士兩位老師悉心的教導, 並不時的指點我, 使我在這些年中獲益匪淺 另外感謝陳克紹 周秀慧老師大力協助, 因為有兩位老師技術上的幫忙, 才能完成本論文, 也感謝董崇民老師的指導使得本論文能夠更完整而嚴謹 兩年多的日子, 感謝政豐 施施學長 ( 姐 ) 不厭其煩的教導我, 且總能在我迷惘時為我解惑, 也感謝耀輝 惠帆 小麥 伯欣 大智 小黃的幫忙 ( 雖然耀輝此時已在馬祖 ), 還有怡臻 屁欣 安婷 小馬怪 許紋佩 大家的幫忙及搞笑, 有大家的陪伴讓兩年多的研究生活變得多采多姿, 不會感到寂寞無趣, 這段實驗室裏共同的生活點滴, 將是人生中難忘的回憶 父親 母親在背後的默默支持更是我前進的動力, 沒有父母從小到大的體諒 包容 照顧, 也許我無法走到現在這一步, 所以在此我要特別感謝父母對我的栽培 及教導 ii
摘要 本篇目的是利用動物副產物供分離葡萄糖胺類物質, 將價值較低的副產物萃取使其成為有高經濟價值的物質 主要分為三個部分, 第一部分為從雞冠萃取出玻尿酸, 目前連續萃取所得的產率分別為 : 第一次萃取 0.50%, 第二次萃取 0.63%, 第三次萃取 0.13%, 玻尿酸純度則以 HPLC 測試 第二部分為利用蝦殼粉萃取出幾丁質及幾丁聚糖, 結果利用 100g 的蝦殼粉可獲得 6.91g 的幾丁質, 產率為 6.91% 第三部分則是利用猪耳朵 猪氣管來萃取軟骨素, 其產率分別為 7.15% 與 0.70% 萃取完之後, 接下來利用所得到的產物進行改質實驗, 期望能在盡量不改變原本材料性質的前提下, 另外再附加上其他不同的性質, 像是增加抗菌性 提昇細胞生長或是促進凝血等等優點 由於直接以葡萄糖胺 ( 含幾丁質 幾丁聚醣 ) 作為手術縫線, 常因為縫線機械強度不足與耐酸性不佳的問題, 在臨床上並未大量使用 我們將生物可分解縫線經由電漿表面改質處理, 浸泡於幾丁聚醣溶液並以 UV 光照射, 使幾丁聚醣接枝上縫線表面, 最後再測試縫線是否具有抗菌能力, 從實驗的結果得知, 改質接枝後的幾丁聚醣確實可增加縫線本身的抗菌效果 另外我們也試著將所萃取得到的軟骨素接枝至生物高分子孔洞薄膜上 ( 聚羥基丁酯戊酯 ;PHBV), 並與未接枝薄膜 接枝明膠的薄膜進行比較, 結果軟骨素薄膜所培養的細胞數明顯超越其他兩組, 證實軟骨素接枝於高分子薄膜表面可以提高細胞貼附的效率 iii
Abstract This thesis developed the extraction methods for extracting glucosamine from animal by products. Hyaluronic acid was extracted from the comb of roosters. The goal is to enhance production rate as well as the purity of hyaluronic acid. The production rate of hyaluronic acid was 0.50% for the first extraction, 0.63% for the second extraction, and 0.13% for the third extraction. HPLC was used to determine the purity of the hyaluronic acid. Chitin and chitosan from shrimp shell was another source of glucosamine. The production yield was 6.91% when extracted with alkaline solution. Chondroitin from pig ears and pig trachea was obtained with acetic acid extraction process. The production yield from pig ears is 7.15% while the production yield from pig trachea is.07%. The glucosamines obtained from animal were used in modification experiments. We used the Plasma treatment method to graft glucosamine onto different materials, including phbv membrane and sutures. The cell proliferation and adherence of phbv (poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate))membrane also can be further improved by plasma treatment. Biodegradable sutures, Polyglactin, grafted with chitosan were tested to determine it s properties. The results indicate that modified sutures has better antiseptic property than unmodified sutures. iv
目錄 謝誌...... ii 中文摘要......iii 英文摘要........iv 目錄..........v 圖目錄.........viii 表目錄........x 第一章前言.......1 1.1 研究背景.. 1 1.2 玻尿酸簡介......2 1.2.1 玻尿酸之結構與來源...2 1.2.2 玻尿酸之特性...6 1.2.3 玻尿酸之製備...9 1.2.4 玻尿酸之應用.11 1.3 幾丁質與幾丁聚醣簡介....15 1.3.1 幾丁質與幾丁聚醣之結構與來源.15 1.3.2 幾丁質與幾丁聚醣之特性.17 1.3.3 幾丁質與幾丁聚醣之製備.19 1.3.4 雞丁質與幾丁聚醣之應用.24 1.4 軟骨素簡介 28 1.4.1 軟骨素之結構與來源.28 v
1.4.2 軟骨素之特性.29 1.4.3 軟骨素之製備.31 1.4.4 軟骨素之應用.31 第二章材料與方法.... 33 2.1 萃取.........33 2.2 高效液相層析 (High Performance Liquid Chromatography)...36 2.3 傅立葉轉換紅外線光譜分析 (FT-IR Analysis).....38 2.4 氧氣電漿反應........39 2.5 紫外光表面接枝........39 2.6 拉伸試驗........41 2.7 抗菌實驗........41 2.8 血小板再鈣化時間測定........42 2.9 紅血球溶解分析測定........43 2.10 具孔洞高分子薄膜製作......44 2.11 接枝反應... 45 2.12 細胞相容性實驗..45 第三章結果與討論... 47 3.1 萃取結果 47 3.2 高壓液相層析 (High Performance Liquid Chromatography)...48 3.3 傅立葉轉換紅外線光譜分析 (FT-IR Analysis).....56 3.4 接枝結果 57 vi
3.5 拉伸試驗........57 3.6 抗菌實驗........58 3.7 血小板再鈣化時間測定 59 3.8 紅血球溶解分析測定 60 3.9 細胞相容性 61 第四章結論......62 參考文獻......65 vii
圖目錄 Fig. 1.1 玻尿酸的雙醣單位...3 Fig. 1.2 雙醣單位之間的醣苷鍵...4 Fig. 1.3 玻尿酸分子在溶液中的三度空間型態...5 Fig. 1.4 玻尿酸不同性質示意圖...7 Fig. 1.5 纖維素 幾丁質及幾丁聚醣的結構式...16 Fig. 1.6 幾丁質與蛋白質和碳酸鈣結合模式.19 Fig. 1.7 幾丁質與幾丁聚醣製備簡易流程圖.21 Fig. 1.8 幾丁聚醣抗菌能力的示意圖.28 Fig. 1.9 硫酸軟骨素結構示意圖.29 Fig. 2.1 玻尿酸萃取流程圖.35 Fig. 2.2 幾丁聚醣接枝流程圖.40 Fig. 3.1 不同玻尿酸濃度比較圖.49 Fig. 3.2 所萃取的玻尿酸與市售玻尿酸比較圖.50 Fig. 3.3 不同濃度幾丁聚醣比較圖.51 Fig. 3.4 幾丁聚醣分析局部放大圖.52 Fig. 3.5 將不同萃取條件所得幾丁聚糖與標準品進行比較.52 Fig. 3.6 不同濃度軟骨素比較圖.53 Fig. 3.7 萃取後軟骨素分析結果圖.54 Fig. 3.8 經由軟骨酵素作用後之軟骨素標準品分析圖.55 Fig. 3.9 經由軟骨酵素作用後之萃取軟骨素分析圖.55 viii
Fig. 3.10 幾丁聚醣 FT-IR 分析比較圖 56 Fig. 3.11 拉伸測試結果圖...57 Fig. 3.12 改質前後縫線的抗菌結果比較圖...59 Fig. 3.13 血小板再鈣化時間測定...60 Fig. 3.14 紅血球溶解分析測定結果...61 Fig. 3.15 改質前後薄膜細胞培養結果...62 ix
表目錄 Table. 1.1 不同濃度與分子量之玻尿酸溶液黏度 (mpas) 8 Table. 1.2 不同去乙醯程度幾丁聚醣之製備條件..23 Table. 1.3 幾丁質與幾丁聚醣的各類應用..27 Table. 2.1 各種 HPLC 分析條件..37 Table. 3.1 玻尿酸 幾丁聚醣與軟骨素萃取結果..48 Table. 3.2 改質前後縫線強度比較表..58 x
第一章前言 1.1 研究背景 許多的生物副產物, 如皮膚 雞冠 軟骨 蝦蟹殼和動物眼球中的玻璃體 (ex: 猪隻眼球 ), 在一般的情況下, 鮮少有人會將其當作食品或食材料理食用, 而由於人 們的消費習慣逐漸以分切後並包裝好的肉類冷凍食品為主流 (ex: 雞肉 猪肉...), 所 以這些部位幾乎都被當作廢棄物來處裡 近幾年來不論在市場上或電視報章雜誌上, 皆可看到許多的健康食品及美容產 品, 其中絕大多數為葡萄糖胺類物質 ( 例如軟骨素 玻尿酸 ), 另外還有幾丁質與幾 丁聚醣, 這些物質除了在研究報告中所指出對人體有益之外, 也應用於許多不同的 領域 但是因為這些物質的取得步驟繁雜且不易, 純化產率又低, 使得它們的價格 十分昂貴, 單單以玻尿酸來說, 從雞冠中萃取純化出來的玻尿酸每 100mg 價格就大 約為 2200 多台幣, 不過這些物質來源卻可以從前面提到的廢棄物中所萃取出來, 如 果能將這些雞冠 軟骨等等的生物廢棄物加以回收利用, 將可提供國內畜產界另一 種廢物利用的作法, 除此之外, 如何開發新的應用方式也是一項十分重要的課題 台灣地區之雞肉消費分為白色肉雞與有色肉雞, 另外還有專門用於生產雞蛋的 蛋雞 而淘汰蛋雞因體內荷爾蒙的關係, 所以其雞冠也會長大 如能將這些雞冠收 集起來, 則有相當可觀的量 以淘汰蛋雞為例, 台灣去年平均每月淘汰 1,219,358 隻 蛋雞 ( 葉,2002), 如以每隻雞的冠重 20g 來計算, 每月約可產生 24 餘噸的雞冠 1
依農業統計年報指出, 台灣 2001 年猪隻屠宰頭數為 8,332,070 頭, 如以每頭猪眼球 重 15g 來計算, 一年估計約可回收 125 公噸的眼球 1.2 玻尿酸簡介 : 1.2.1 玻尿酸之結構與來源 在西元 1934 年,Karl Meyer 和 John Palmer 兩位科學家發表了一種可以從牛眼 球玻璃體中萃取新型胺基葡聚糖 (glycosaminoglycan) 的方法 從他們的報告中指出, 此物質經過分析後發現, 其中含有糖醛酸 (uronic acid) 及胺基糖 (aminosugar), 但不 含硫酯類, 因而將此物質命名為 玻尿酸 (hyaluronic acid), 其名稱即是由 玻璃 體 (hyaloid) 及 糖醛酸 (uronic acid) 個名稱組合而來 玻尿酸是由胺基糖衍生出的重複雙糖單元所構成, 為一種線性無分支的高分子 黏多醣 (Singla, 1987) 關於玻尿酸結構的詳細描述如下 : 一級結構 在 Meyer 等人發現玻尿酸後, 經過了 20 年, 科學家們才確定其基本的分子結 構為雙醣所構成,Meyer 等人於 1954 年利用化學與酵素的方法, 發現玻尿酸的雙醣 結構中, 糖醛酸單位與胺基糖單位為 D- 葡萄糖醛酸 (D-glucuronic acid) 及 D-N- 乙醯葡 萄糖胺 (D-N-acetylglucosamine), 這兩種單醣為玻尿酸的一級結構 (fig. 1.1) 2
二級結構 Rapport et al. (1951) 發現這兩種單醣會以等莫耳比經由 ß-1-4 與 ß-1-3 糖苷 鍵 (Glycosidic bond) 互相連接, 重複結合而形成一條直鏈的分子, 此為玻尿酸的二級 結構 (fig. 1.2) 一個玻尿酸分子中雙醣單位的數目, 可以達到 1000 以上, 而分子量 也可達 4MDa( 一個雙醣單位的分子量約為 400Da) 一個雙醣單位的平均長度約為 1 nm, 所以一個玻尿酸分子如果含有 1000 個雙醣單位, 其長度可達 10μm( 大約等於 一個人類紅血球的直徑 ) (Meyer and Weissmann,1954) 3
三級結構 - 玻尿酸在水溶液中的網狀結構 由於玻尿酸分子中含有大量的羧基和羥基, 因此當玻尿酸分子存在生理等張溶 液中時, 會形成分子內和分子間的氫鍵, 此時雙醣單位會因形成平行於分子軸鏈的 氫鍵而結合, 但因為其間的羧基會彼此排斥, 而產生許多不規則的局部螺旋 (Helix) 且近年來發現玻尿酸分子的二級結構中存在一疏水區域, 即軸向的 8 個 CH 基, 其中的 8 個氫所組成一疏水結構, 使得玻尿酸分子全鏈形成纏繞 (Coil), 而形成一種 網狀的結構 (Bothner and Wilk, 1987), 這種形式有助於其分子結構的穩定 (fig.1.3), 4
所以氫鍵對於玻尿酸分子在水溶液中的結構具有非常大的影響 這種螺旋狀的巨大 分子, 在水溶液中會佔有一個很大的領域 (domain) 以 1 條分子量為 4 106 的玻尿 酸分子而言, 其長度約為 10-5 m, 在水溶液中的迴旋半徑可達 2 10-7 m, 水合體積 為原來的 1000 倍 (Laurent and Fraser, 1992) 但這個領域中玻尿酸實際的濃度非常的 低, 大約只有 1mg/mL 所以當玻尿酸溶液的濃度大於 1mg/mL 時, 玻尿酸分子所佔 的空間會互相重疊, 分子間也開始互相糾纏, 而形成一種網狀的結構 (Bothner and Wik, 1987) 這種網狀結構在玻尿酸的生理功能中扮演很重要的角色 5
1.2.2 玻尿酸之特性 玻尿酸分子量之影響 早期的一些科學家曾使用光散射 沈降 擴散 黏度等方法來推算玻尿酸的分 子量 (Laurent and Fraser, 1992) 而近年來的科學家則是利用 HPLC 毛細管電泳 (Hayase, 1996) 等方法來測得更精準的玻尿酸分子量 玻尿酸在不同的動物組織中分 子量與濃度都不相同, 甚至在同一部位玻尿酸的濃度與分子量, 也都會因動物的生 理狀況不同而有所改變 (Laurent and Fraser, 1992) 當玻尿酸的分子量越大, 其水溶 液在低剪切速率 (Shear rate) 下之黏度也隨之增大 (Bothner and Wilk, 1987), 因此對於 組織中的生理功能如支撐 潤滑 滲透壓控制等會產生不同影響 (Ghosh, 1994), 尤 其高分子玻尿酸的黏度是臨床使用價值的保証, 特別是作為眼科手術黏彈性保護劑 時更加重要 玻尿酸的黏彈性質 當溶液中玻尿酸分子達到 0.1% 以上的濃度時, 在氫鍵及疏水區的作用下, 其分 子間即會開始糾纏而形成三級網狀結構, 而這三級網狀結構在受力時會表現出不同 的性質, 如果提高玻尿酸分子的分子量, 亦有助於此網狀結構的產生 (Scott, 1998) 此網狀結構之形成, 對於玻尿酸分子在溶液中的兩種特性即彈性 (elastic properties) 與黏性 (viscous properties) 有很大的影響 : 當一急速流動液體瞬間經過玻尿酸分子 時, 由於玻尿酸分子間與分子內的作用力 ( 氫鍵 疏水力等 ), 使得玻尿酸網狀結構 6
產生一股力量來抵抗外力, 才能維持其結構, 即稱為彈性 ; 而當一緩慢流動液體經 過糾纏的玻尿酸分子時, 會因為玻尿酸分子巨大的結構產生阻力, 使液體的流動減 緩, 玻尿酸結構逐漸被拉直且無法回復, 此即為黏性 (fig.1.4) (Hascall and Laurent, 1997) 另外, 假如觀察不同濃度與分子量的玻尿酸溶液在低剪切速率下之黏性, 可 以發現不管是溶液濃度增加還是玻尿酸分子量提高, 都會使溶液的黏度增加 (table.1); 其中分子量對溶液黏度的影響比濃度所帶來的影響大 7
玻尿酸的排除效應 (Exclusion effect) 玻尿酸分子所形成的三級網狀結構能夠排除大分子物質進入其所佔據的空間, 也會對水等其他小分子造成很大的阻力, 具有濾器或分子篩般的作用, 此排除現象 可影響玻尿酸高分子的溶解度 變換高分子的構形 影響其化學平衡及決定系統的 滲透壓 玻尿酸所產生的滲透壓, 會隨著濃度的增加而以指數方式遞增, 因此可作 為滲透壓緩衝物質 而玻尿酸等多醣類所形成的網狀結構, 也可作為其它分子的篩 網, 例如調節血管與細胞間物質的輸送 防止感染物質的擴散及引導細胞分泌物, 如膠原蛋白的沈積等 (Laurent, 1987) 玻尿酸鈉鹽水溶液的熱穩定性 當溫度上升時, 玻尿酸鈉鹽水溶液的黏度會隨著上升的溫度而受到破壞, 也就 是說溫度越高玻尿酸溶液的黏度越低 在 90 時, 不到一個小時的時間黏度即可 8
下降約 10 %; 而在 25 下時, 黏度要下降 10 % 所需時間則達到數千小時, 因此 玻尿酸鈉鹽水溶液應儘量儲存於 25 之下, 若將水溶液儲存於 0 ~ 5 更可提 高的保存期限 1.2.3 玻尿酸的製備 萃取 玻尿酸一般都是從動物組織中所萃取出來, 譬如雞冠 鯨魚軟骨 牛的膝關節 透明軟骨 小牛的氣管 牛的玻璃體以及人類臍帶等等的組織, 但是組織中之玻尿 酸與某些蛋白質或其它黏性多醣類會形成複合物, 因此萃取過程中需要繁複的分離 及純化步驟 玻尿酸的萃取方法是由 Balazs 所發明及申請專利 (1979), 公雞喙部 下方的肉垂與雞冠的構造類似, 因此 Nakano 等人 (1991) 曾經對雞冠與肉垂中的玻尿 酸含量進行比較, 結果發現雞冠中玻尿酸的含量較高, 另外 Tufvesson 等人 (1999) 也曾利用育種選拔的方法, 挑選出具有不同大小雞冠的公雞來進行比較, 想研究公 雞雞冠大小與形狀是否對其中的玻尿酸含量差異有影響 結果發現公雞雞冠的尺寸 與形狀, 對於玻尿酸的含量並沒有很顯著的關係 由於公雞雞冠是所有動物組織中 玻尿酸含量最高的部位, 因此 Balazs 便使用公雞雞冠作為最主要的萃取原料來源 在雞冠中, 玻尿酸會和醣蛋白結合, 使得分離純化的步驟變得複雜同時也提高了操 作成本 此外在大部分的情況下, 萃取的混合物中都會含有玻尿酸分解酵素 9
(Hyaluronidase), 可能在萃取與純化的過程將玻尿酸分解而降低分子量, 使得玻尿酸 之黏度及含水能力下降 從動物組織中所萃取得到的玻尿酸雖然品質良好, 但是因 為原料的提供有限與取得不易, 再加上萃取分離的步驟繁多, 使得成本提高, 所以 玻尿酸產品的價格並不便宜 ( 黃,2001) 醱酵純化 玻尿酸除了可以從動物組織中萃取外, 也能利用微生物來醱酵生產, 因為後來 某些學者發現在一些致病的鏈球菌, 如 Streptococcus zooepidemicus S.pvogenes S.dvsgalactiae Strepyoccocal A and C groups 等, 其細胞外基質中也可萃取出玻尿 酸 (Weigel, 1998), 所以利用微生物醱酵來生產玻尿酸的方式, 已經逐漸取代直接從 動物組織中萃取 近十幾年來, 科學家利用基因突變的方式來篩選出無溶血性且具 黏質的菌株來培養, 並發展出具工業規模的發酵程序 (O Regan et al.,1994) 用來進 行醱酵生產玻尿酸的鏈球菌大多屬於藍氏 (Lancefield)A C 群鏈球菌, 玻尿酸為鏈球 菌胞外莢膜組成的成分, 在醱酵的過程中會直接釋放到醱酵液中而成為胞外產物, 雖然要從醱酵液中得到高純度的玻尿酸產物仍然需要許多純化的步驟, 但是與直接 從動物組織中萃取純化的步驟比較, 醱酵純化所需步驟較為簡便, 且使用非致病性 的變異菌株也可確保不會產生具有毒性的物質 早期微生物醱酵所得到的玻尿酸因 為分子量不夠大, 且可能具有致病性, 所以只能用在化妝品方面, 但隨著發酵技術 的進步以及化學修飾方法的應用, 現在微生物醱酵所得的玻尿酸已經可達到醫藥用 的等級 一般來說, 從動物組織中萃取玻尿酸, 優點為產品分子量大, 且生物相容 10
性高, 但缺點為純化步驟繁雜 耗時 原料少或取得不易導致成本升高, 使得產量 供不應求 ; 利用微生物醱酵法來生產玻尿酸, 其優點為產量大 成本較低, 但缺點 就是所獲得玻尿酸分子量小, 需要其他步驟來加以修飾才能使產品到達醫藥級 不 論是使用哪種方法, 其原料中都可能含有玻尿酸分解酵素, 影響所生產玻尿酸的分 子量, 所以每一批生產出來的玻尿酸產品, 其分子量分佈均有差異性存在 化學合成 由於玻尿酸分子上的 D- 葡萄糖醛酸 (D-glucuronic acid) 和 N- 乙醯基 -D- 葡萄糖 胺 (N-acetyl-D-glucosamine) 是由葡萄糖六磷酸鹽及果糖六磷酸鹽而來, 因此如果藉由 幾個化學步驟將葡萄糖六磷酸鹽轉化成 UDP- 葡萄糖醛酸, 而將果糖六磷酸鹽轉化 成 UDP-N- 乙醯基 -D- 葡萄糖胺, 最後再利用玻尿酸合成酵素 HasA 作用即可合成製 造玻尿酸 1.2.4 玻尿酸之應用 玻尿酸的生理功能與其分子量有很大的關係, 所以分子量越高, 其可應用的範 圍與價值也越大 ( 王,1994) 用於醫藥方面的玻尿酸, 除了純度要高, 分子量也要 大於 1MDa, 才能提供其獨特的黏彈性功能 分子量較小的玻尿酸, 因為具有卓越的 吸水能力, 可提供保濕 滋潤等功效, 所以常被利用於化妝品工業 ( 黃,2001) 此 外, 不同來源的玻尿酸, 其分子中彈性結構的數量也會不同, 所呈現的彈性也會有 所改變 (Bothner and Wik, 1987) 11
醫療方面應用 動物體內即具有玻尿酸, 而不論任何物種所具有的玻尿酸結構都一樣, 所以並 不會引起免疫反應, 且因為玻尿酸具有特殊的生理功能, 目前已廣泛地使用於臨床 醫學方面 眼科手術方面的應用 玻尿酸為一透明 吸震的物質, 相當適合做為人工水晶體的材料, 但由於玻尿 酸很容易被分解掉, 所以後來又研發出以二乙烯基硫 (divinyl sulfone) 作為交聯劑的 玻尿酸水膠, 以提供更好的機械強度 ( 王,1997) 此外, 玻尿酸也可用於白內障 青光眼 角膜移植等眼科手術方面, 作為充填材料 ( 黃,2001) 關節炎方面的應用 玻尿酸首次應用於醫療方面, 即是用來取代關節滑液, 以減緩關節炎患者的疼 痛, 並改善關節的活動性 (Balazs,1990) 但將玻尿酸溶液注射至關節中, 只能短時間 提高關節的潤滑度, 而無法持續地增加患者關節中玻尿酸的濃度 這是因為在患者 的關節中, 玻尿酸的合成分解平衡被破壞, 導致玻尿酸被去聚合化 (depolymerization) 的量高於合成的量 所以近來已使用經過交聯作用之玻尿酸水膠來作為患者關節的 黏性補充劑, 可延長其在關節中的潤滑效果 (Balazs, 1990) 傷口癒合方面的應用 12
傷口在恢復的時候, 玻尿酸會與纖維蛋白會傷口上形成一種支持細胞的基質, 來促進纖維母細胞 (fibroblast) 的增生與遷移 纖維母細胞在傷口會開始分泌膠原蛋白 (Daly, 1990) 而玻尿酸分解酵素也會將玻尿酸降解成會誘使血管增生的小分子 (Carbrera, 1995), 來修補傷口 動物一生中玻尿酸的濃度最高的時期為嬰兒期, 所 以幼時傷口較易完全復原 (Okscala, 1995), 但隨著年紀的增加, 動物血中玻尿酸的濃 度也跟著下降, 傷口越來越難癒合 (West et al., 1985), 所以使用玻尿酸製成傷口敷 料, 可促進傷口癒合之速度 ( 陳,1996) 藥物輸送方面應用 由於玻尿酸具有很好的生物相容性, 而且為體液成分, 不會引起免疫反應, 在 體內以自然的生物降解方式代謝, 對於藥物載體的應用具有廣泛的前景 作為大分 子物質, 玻尿酸與玻尿酸衍生物不僅為藥物提供了緩釋作用, 並且利用其可與細胞 的玻尿酸受體相結合的特點, 可調整使其被特定的組織如淋巴結 肝臟攝取, 或攜 帶藥物至特定部位進行釋放 化妝品方面應用 玻尿酸屬於高分子聚合物, 具有很強的潤滑感和成膜性, 又由於玻尿酸有良好 的保濕作用, 也是皮膚和其他組織中廣泛存在的天然生物分子, 大約從 80 年代開 始用於化妝品中, 被譽為理想的天然保濕因子, 而其保濕性與分子量有關, 分子量 越高, 保濕性能就越好 ; 此外, 分子量較小的玻尿酸可滲入皮膚表皮層, 促進表皮 13
細胞的增殖和分化, 以及清除氧自由基的作用, 提供皮膚養分和廢物的排泄, 進而 防止皮膚老化, 達到美容和養顏的效果 ; 所以, 一般化妝品用的玻尿酸分子量介於 100,000~2,000,000 Da 左右 另外, 雖然玻尿酸的含量中有蛋白質 多肽 核酸 硫 酸軟骨素和硫酸皮膚素等雜質, 但這些雜質的存在, 並不影響玻尿酸在化妝品中的 應用, 因為人體皮膚中本來也含有這些物質, 對皮膚反而有營養的作用 此外, 玻 尿酸也可用於整型外科, 如臉部整形的填充物 (Duranti et al., 1998) 保健食品方面的應用 使用於保健食品美容方面的玻尿酸一般大多是由雄雞冠萃取製備, 純度要求不 是很高, 通常只需要在 10 % 以下, 因另外含有膠原蛋白 硫酸皮膚素和硫酸軟骨素 等組成細胞外基質的成分, 稱之為複合黏多醣 這方面的玻尿酸分子量較低, 經由 口服後便於消化吸收, 可增加體內合成玻尿酸的前驅物, 使皮膚與其他組織中合成 玻尿酸的量增加, 進而使皮膚的保濕性能提升, 皺紋減少, 富有彈性 ; 另外相較於 化妝品塗抹局部的作用, 其主要考慮只針對局部表皮的處理, 而對作為皮膚的主要 組成部分之真皮無作用, 但口服的玻尿酸屬於全身性的作用, 是由真皮至表皮增加 內源性的玻尿酸含量, 使細胞活化, 發揮全身作用, 所以這兩者間有著明顯的不同 因此, 口服的美容保健食品可補充體內的玻尿酸含量, 具有保持表皮濕潤 活化皮 膚細胞及改善皮膚等功效, 表現為由體內至體外全身性的美容與保健, 所以受到越 來越多人們的接受與重視 14
1.3 幾丁質與幾丁聚醣簡介 : 1.3.1 幾丁質與幾丁聚醣之結構與來源 幾丁質 (chitin) 為自然界中含量第二豐富的多醣類, 含量僅次於纖維素, 同時也 是地球上除蛋白質外數量最大的含氮天然有機化合物, 在自然界中通常與其他多醣 類或蛋白質以混合的狀態存在, 當在真菌的細胞壁中幾丁質會與其他多醣相結合 ; 在動物體內則是和蛋白質結合成醣蛋白, 稱為 Artropodin complex ( Carmen and Roland,1997 ) 幾丁質 (chitin) 主要是由 2000~3000 個 N- 乙醯葡萄糖胺 (N-acetyl-D-glucosamine), 以 β-1,4 醣甘鍵結合而成之直鏈狀高分子聚合物, 分 子量約為 2 106 dalton(knorr, 1984) 結構類似纖維素 (Shahidi et al., 1999), 不 同處為在 C-2 位置上所接的是一個胺基 (-NH2) 或乙醯胺基 (-NHCOCH3) 下圖 為纖維素 幾丁質與幾丁聚醣之結構 (fig.1.5) 15
幾丁質存在於無脊椎動物如節肢 軟體和環節類動物與藻類 真菌與酵母菌等菌體 的細胞壁中, 螃蟹等甲殼類外殼的主要成分便是幾丁質 幾丁質可從蝦或蟹的外殼 中分離出來, 而目前生產幾丁質所使用之原料大多來自蝦 蟹外殼等水產廢棄物, 經高溫 高濃度鹼液和酸液加工處理而得, 預估將來經由醱酵工業廢棄物來生產幾 丁質, 也會成為幾丁質的主要來源之一 16
1.3.2 幾丁質與幾丁聚醣之物理 化學性質 幾丁質 幾丁質之外觀為呈白色無定形之半透明物質, 具有高度彈性及延展性 ( Zhang et al., 2002 ), 幾丁質同時也具有強吸濕性, 保濕效果相當良好, 在一般狀態下分子鏈 不易斷裂 不易變性, 具有相當良好的機械強度 幾丁質 ( Chitin ) 最早是在法國 植物學家以氫氧化鈉稀溶液加熱處理洋菇時, 才發現此一不溶於水之物質 幾丁質 不溶於一般的無機酸 有機酸或水溶液中, 也不溶於鹼液, 化學反應性低, 這是由 於幾丁質中的乙醯胺 ( aminoacetyl ) 基容易形成分子內或分子間的氫鍵, 導致細微 結晶區產生所引起, 但含 5 % 氯化鋰 (LiCl) 的二甲基乙醯胺 (dimethyl-acetamide) 則為幾丁質之良好溶劑 ( 陳等人,1999) 幾丁質具有強吸濕性, 保濕效果亦相當 好, 並具有吸附重金屬離子之功能, 在自然狀況下不易變性 ( 陳, 2001) 幾丁 質之分子量約為二百萬左右, 視其來源及製造條件而定, 依其雙螺旋對稱軸分子排 列方向, 分為 α 型 β 型及 γ 型三種 幾丁聚醣 幾丁聚醣 (chitosan) 為幾丁質經過高濃度鹼液和高溫處理, 進行去乙醯化 (deacetylation) 反應後所得到的產物, 藉由反應時間 溫度及鹼液濃度的不同, 可 得到去乙醯程度 65 ~ 99 % 不等之幾丁聚醣, 其中以 70 ~ 80 % 最為常見 17
一般而言, 幾丁質和幾丁聚醣之去乙醯程度並沒有劃分的很明確, 有學者提出, 當總氮量佔整個聚合物重量的 75 % 以上者, 才能稱為幾丁聚醣 (Muzzarelli,1985) 幾丁聚醣是一種無毒 (non-toxic) 白色帶淡黃色之粉末狀固體, 具有生物分解性 (biodegradable) 與生物活性 (biological function) 幾丁聚醣可溶於醋酸 ( acetic acid ) 甲酸 ( formic acid ) 乳酸 ( lactic acid ) 檸檬酸 ( citric acid ) 丙酮酸 ( pyruvic acid ) 鹽酸 硫酸及磷酸中, 其中甲酸為幾丁聚醣最好的溶劑, 約 50% 幾丁聚醣可 溶 ; 而醋酸則常被選為測定幾丁聚醣溶液性質的標準溶劑, 溶解度可達 4% 以上, 除 此之外, 幾丁聚醣不溶於中性及鹼性溶劑 (Knorr, 1984; 吳,2001) 幾丁聚醣溶 於酸性溶劑中會形成黏稠狀的溶液, 而溶液之黏度視幾丁聚醣分子量大小 去乙醯 度 聚合物濃度 溶劑濃度與種類及溫度而定 在酸性環境下, 幾丁聚醣為一線性 且帶有多價正電荷的聚合物 ( linear cation polyelectrolytes), 對含陰離子性吸附質 之處理尤為特出, 可作為吸附劑, 且具有螯合金屬的作用 ( Shahidi et al., 1999) 幾丁聚醣具有良好的熱安定性, 一般的加熱方法如水煮 油炸與燒烤等對幾丁聚醣 結構並不會造成影響, 其粉末在 250 無氧狀態下也無分解現象 ( 林, 1999) 另外, 幾丁聚醣也可利用真菌發酵法生產, 其產品具有品質穩定 純度高及無 蛋白質或重金屬污染的優點 ( 陳,1999), 目前使用的菌株大都屬於 Absidia Rhizopus 和 Maltextract 三個菌屬 18
1.3.3 幾丁質與幾丁聚醣之製備 幾丁質 蝦 蟹外殼的幾丁質與蛋白質 碳酸鈣及磷酸鈣等緊密結合 下圖為幾丁質與 蛋白質及碳酸鈣結合之模式圖 (Fig.1.6)(Poulicek et al., 1986), 幾丁質被兩層片狀 或層狀且與鈣離子不具親和力之幾丁質蛋白質複合物夾住, 稱為 carrier protein (CP), 而此蛋白質外另有一與鈣離子鍵結較強的蛋白質層, 稱為 mineralization matrix(mm), 可溶於去碳酸鈣溶液, 當礦物質 ( 如 CaCO3) 沉積在兩 MM 層間使 CP 層夾在兩 MM 層而成為穩定之結構 因此從甲殼類動物的殼抽取幾丁質, 要先 去除蛋白質及礦物質 (Knorr,1984) 19
1. 碳酸鈣去除 一般去除碳酸鈣的方法是以無機酸處理, 藉由其與碳酸根反應產生二氧化碳而 去除 最常採用的是鹽酸 (Knorr,1984), 當使用強酸強鹼處理幾丁質時, 會造成 分子間鍵結斷裂及去乙醯化作用, 但是使用的濃度太高或處理時間太長時, 會導致 幾丁質產生降解, 若濃度過低時, 則不易將礦物質去除 因此後來有學者改用亞硫 酸 醋酸等弱酸, 或金屬螯合劑 EDTA 與金屬離子進行螯合等來去除碳酸鈣 (Brine and Austin,1981) 2. 蛋白質去除 蛋白質的去除方法一般分為蛋白酵素處理法 鹼液處理法以及微生物法三種 (Knorr, 1984 ;Brine and Austin, 1981) 鹼液法較為簡便 處理時間短且效果佳, 故最常被使用 但如果以鹼液處理會受到鹼液濃度 處理溫度及處理時間不同而產 生不同的去蛋白質的效果, 並會造成幾丁質去乙醯化, 為了減緩去乙醯化反應的發 生,Stanley 等人 (1975), 採取二段式鹼液處理 ; 先以低濃度氫氧化鈉處理, 去除 大部分蛋白質之後, 再去除碳酸鈣, 接著以高濃度氫氧化鈉處理, 以去除殘留之蛋 白質, 較能獲得近似原始狀態之幾丁質 至於蛋白酵素處理法雖然不會影響幾丁質 分子量降解, 而且可在低溫狀態下作用也不會造成環境污染, 但其反應時間過長且 不容易完全去除蛋白質, 故不常被使用, 下圖為一般由蝦 蟹殼製造幾丁質的方法 (fig.1.7) 20
21
幾丁聚醣 幾丁聚醣是由幾丁質去除部分乙醯基而生成, 去乙醯作用的方法有二 : 1. 化學法 目前工業上大量生產幾丁聚醣之方式, 將蝦或蟹之外殼經高溫高濃度之鹼液和酸液 處理加工而得, 步驟大概包含三部分 : ( 1 ) 高溫鹽酸溶液去鈣鹽 ; ( 2 ) 高溫氫氧化鈉溶液去蛋白質 ; ( 3 ) 高溫高濃度鹼液去乙醯基化反應 影響幾丁聚醣去乙醯的程度的因素有三 ; 一為氫氧化鈉的濃度, 一般採用的濃 度為 40~60 %濃度高會加速去乙醯作用的進行, 可是廢液的處理是一大問題 ( 李, 1988) 第二個因素為反應溫度與時間 ; 幾丁聚醣到達相同去乙醯度在 60 時反應 所需之時間約為用 110 反應的兩倍, 但反應溫度過高會造成分子降解而得到分子量 較低之產品 而反應時間越久去乙醯程度越大, 但並非成正比, 例如以 110 處理一 小時去乙醯程度為 78 %而反應時間延長至四小時去乙醯度僅達 82 % (Mima et al., 1983) 第三項則是反應環境 ; 在空氣中或氮氣中反應, 以在氮氣中有較大之分子 量, 原因可能是在空氣中反應會造成氧化裂解 ( 李, 1988) 將幾丁質粉末以熱 鹼處理而進行去乙醯作用製備幾丁聚醣, 製備條件表示於下表 (table.1.2) 22
2. 酵素法 由 Mucor rouxii 菌系提煉去乙醯酵素來處理幾丁質, 或者將幾丁質投入含有去 乙醯酵素之微生物 (Aeromonas spp.) 培養液中培養八天可達到去 50 %去乙醯程度 ( 陳等,1999) 3. 醱酵法 還有另外一種生產幾丁聚醣的方法, 這方法不需藉由幾丁質來去乙醯化, 就是 23
直接利用醱酵法生產幾丁聚醣, 可使用各種不同之菌株 ( 如 Rhizopus circinans), 或 醱酵製程來生產不同化學 物理特性之幾丁質與幾丁聚醣 如不同分子量 不同去 乙醯度的產品, 可使產品多樣化以滿足不同用途之需求 如果在穩定之醱酵製程調 控下, 更可產生化學 物理特性穩定之高品質產品, 可滿足在醫藥等應用上之要求 此外, 使用蝦蟹殼製造幾丁質易造成大量廢棄物, 造成嚴重的環保問題, 如使用醱 酵法製備加工, 其加工過程之污染程度較輕微, 亦不會造成大量廢棄物 1.3.4 幾丁質與幾丁聚醣之應用 近年來除了對幾丁質與幾丁聚醣特性多方研究外, 也積極探討其實用價值及應 用潛力 由於這兩類多醣聚合物在食品 農業 醫學 紡織纖維 廢水處理 化妝 品 酵素固定及分離等均有應用價值, 是以就其應用性加以論述 在生物醫學材料方面的應用 在生物醫學材料方面的應用很廣, 最重要的應用是在手術縫合線, 傷口癒合, 及藥物控制釋放等, 幾丁聚醣具有幫助傷口癒合 抗癌和抗凝血等功效, 亦可製成 膠囊 人工皮膚等醫療材料, 幾丁質和幾丁聚醣製成的外科手術縫合線, 可增加韌 度 藥物控制釋放近年來逐漸受醫學界之重視, 藉由適當的藥物傳輸方式, 可以將 其有效的應用到所定的目標點 ; 包括適當的時間及量, 不至於在輸送過程中產生分 解或引起不必要的效應 以幾丁聚醣當作藥物膠囊材料, 可以改善崩散性 24
(disintegraton) 及控制藥物之釋出速率 (Knorr, 1984) 由於大多數的藥劑在使用 後, 常因快速的代謝, 導致其藥效的期限相當短, 因而必須多次服用, 不但不經濟 又麻煩且副作用也高 藥物之控制釋放正足以解決此一問題 目前已有許多傳輸系 統的設計與應用 在機能性食品應用 幾丁聚醣在機能性食品上的應用最受到注目, 它雖是食品, 但是具有類似醫藥 品的臨床效果, 可以調節生理機能, 包括無毒性的抗癌效果 改善消化吸收機能 降低脂肪及膽固醇攝取 降低高血壓等 通常造成高血壓及心臟病的原因是脂肪 鹽分的過量攝取, 這也是目前的主要病因 幾丁質及幾丁聚醣就有很好的調節血壓 能力 幾丁聚醣化學結構和植物之纖維素相似, 同樣不被人體消化吸收且具備膳食 纖維之功能, 故可視為動物性膳食纖維的來源, 亦可利用此特性將其添加到食品中 吸附色素而排出, 以降低色素可能造成的毒性 (Knorr,1984) 另外幾丁聚醣帶有 正電荷的分子 可以吸收帶有負電性的脂肪酸 膽固醇 食鹽的氯離子等, 在體內 可調節生理機能, 在臨床醫學已有許多實例 食品加工的應用 幾丁質與幾丁聚醣應用在食品工業上有抗菌 保水 乳化 增稠 降低脂肪吸 收等功能, 在自然界的來源豐富, 為一種天然食品添加劑 (Shahidi et al., 1999), 可作為防腐劑 黏稠劑及澄清劑等, 由於幾丁質與幾丁聚醣均為不被人體吸收之巨 25
大分子, 可開發成高機能性減肥飲料 而其多醣組成具有清爽甜味及保濕性, 在水 中溶解度均比單糖低, 有助於調整食品水活性, 以增進保水性, 同時也有調味及改 善食品品質的功能 幾丁類物質之抑菌機制一般認為是由於幾丁聚醣具多價陽離子之特性, 會干擾 細胞表面之負電荷分子, 以靜電作用互相吸引而附著, 形成凝集作用 而幾丁聚醣 與其他聚胺類 (polyamines) 影響細胞膜之通透性 (Young et al., 1982) 例如, 幾 丁聚醣在 ph5.8 的情況下會誘發 Pythium paroecandrum 菌體內蛋白質漏損 (leakage) (Leuba and Stossel, 1985) 另一可能的機制牽涉到幾丁聚醣與 DNA 結合, 而抑制 mrna 合成 (Hadwiger et al.,1985) 26
Table.1.3 幾丁質與幾丁聚醣的各類應用 應用領域範例抗菌物質細菌真菌測量農產原料之黴菌污染可食用膜工業食品與周圍環境間控制水分傳遞控制抗菌物質之釋放控制抗氧化物之釋放控制養分 香氣與藥劑之釋放降低氧分壓控制呼吸率控制溫度控制水果之褐變還原滲透膜添加物水果與飲料之澄清與去酸天然香氣之擴展乳化劑模擬食品增稠劑與穩定劑色素穩定作用營養品質膳食纖維降膽固醇之影響畜產與魚類飼料添加物降低脂肪之吸收生產單細胞蛋白質抗胃炎劑嬰兒食品成份食品加工廢棄物親和性絨毛作用 (Affinity flocuulation) 回收固形物凝膠分餾法 (Fractionation of agar) 純化水回收金屬離子 殺蟲劑 酚等其它酵素固定化營養素膠囊色層分析分析試劑 27
1.4. 軟骨素簡介 : 1.4.1 軟骨素之結構與來源 在哺乳類中, 主要的醣甘胺基聚醣有兩種 (glycoaminoglycans,gag s), 分別 為硫酸化軟骨素 Chondroitin sulfate (ChS) 和玻尿酸 Hyaluronic acid (HA) 硫酸化軟 骨素 (chondroitin sulfate, ChS) 於 1854 年首先由 Fisher 和 Boedker 所發現, 它是一種 水溶性的黏多醣體, 也是結締組織和軟骨組織中相當重要的結構性物質, 它是由 D-glucuronic 和 N-acetyl-D-galactosamine 不斷重複交替結合所組成, 後者在 C4 或 C6 的位置有硫酸根取代, 若硫酸根在 C4 取代稱為 ChS A; 如果是 C6 取代則稱為 ChS C 結構如圖所示 (fig.1.9) 28
一般的軟骨素皆是由鯊魚軟骨組織萃取精製而成, 但也可從禽類的軟骨或牛支 氣管所得到, 硫酸化軟骨素大致可分為 A B C D E 五種型態, 其中 C 型的硫酸軟 骨素即為構成軟骨的主要成分 1.4.2 軟骨素之特性 硫酸化軟骨素是屬於 glycosaminoglycan ( GAGs ) 的一種,GAGs 共可分為四大 類 : ( 1 ) chondroitin / dermatan sulphate ( 2 ) heparin 和 heparan sulphate ( 3 ) keratan sulphate ( 4 )hyaluronate 或 hyaluronan 29
GAGs 一般大多存在於細胞表面和細胞外基質內, 硫酸軟骨素如果存在中性低溫的環 境下時相當穩定, 可是當溫度超過 60 時便會開始分解成低分子量的碎片以及去硫 酸根的產物 ( Nicola et al.,1999 ) GAGs 是種具有線性結構之大分子雙胜肽類輔聚 合物 ( coplymers ), 因為結構上帶有羧基和硫酸根次單位等陰離子, 所以帶有負電性 GAG 的生物生理學之特性包括 : ( 1 ) 單一獨立性 即每一類的 GAG 皆具有其單一獨特的生物生理特性 ( 2 ) 填補空間之能力 ( 3 ) 結合和組成水性分子 ( 4 ) 排斥負電離子 至於其他化學特性則隨著 GAG 與其他大分子物質, 特別是蛋白質分子, 進行不同 特異性結合而改變 GAGs 大多都具有高黏稠性低摩擦係數的特性, 因此這些物質所 組成的溶液如關節液, 即具有絕佳的潤滑作用, 能夠給予關節潤滑作用, 以減少關 節所受到的傷害 而存在於結締組織中的硫酸軟骨素可以和膠原纖維一起作用形成 網狀結構, 能夠提供一些大分子性的物質如球狀蛋白質於運輸時使用, 所以有許多 的臨床研究報告都認為利用口服硫酸軟骨素來治療骨關節炎的患者, 在關節功能恢 復和疼痛緩解的方面, 可以得到很顯著的改善 ( Morreale et al., 1996;Ronca et al., 1998 ) 存在血漿中的酵素與軟骨素的降解也有相關性, 特別是某些身體組織外膜的 接受體會與硫酸鹽軟骨素結合後, 再與 Chondroitinase ABC 酵素結合 ( Saylers et al., 30
1980 ) 除此之外, 硫酸軟骨素也會提昇關節滑液成分中的玻尿酸濃度, 使其黏稠度 增加 1.4.3 軟骨素之製備 硫酸軟骨素 (chondroitin sulfate,chs) 是從動物喉骨 鼻軟骨 氣管等富含 ChS 的軟骨組織萃取製備的, 是一種重要的酸性粘多糖 它具有多種異構體, 不同的只 是硫酸基位置不同, 另外還發現了一些其它的硫酸軟骨素 ChS 的萃取方法有大略 有以下幾種 : 酵素法 鹼液法 水高溫高壓法 中性鹽溶液法等其他方法, 其中鹼液萃取與 酵素水解法互相結合是製備 ChS 最有效的方法, 而分離純化的方法又有乙醇沉澱 法 離子交換色譜法 吸附法和纖維素分離法等 1.4.4 軟骨素之應用 硫酸鹽軟骨素不論是在體內或體外的實驗結果中皆證實了其確實具有保護軟骨 細胞的功能 ( Anderson, 1999;Cordoba et al., 2003;Lippiello, 2003 ), 在正常情況下 口服, 除了可以增加關節囊液中玻尿酸的濃度和分子量外還可以降低溶解酵素之濃 度 ( Conte, 1995 ), 因此應用在骨關節炎臨床病例方面的治療上, 能有效的改善骨關 節炎病患之臨床症狀 ( Rovetta, 1991 ) 軟骨素亦經常被使用於製藥 化妝品和食品 工業, 在醫療方面常用於眼藥水 治療血管腫瘤 修復皮膚和軟骨上 (Matsushima et al.,2002), 在生醫領域也常以混摻 醯氨化反應或交鏈反應來擴展應用範圍 31
硫酸化軟骨素的研究與應用如下 : 藥物傳遞系統的應用 可與膠原蛋白作成支架 (matrix scaffold), 應用於組織工程上 治療心肌梗塞與心血管疾病 降低血中膽固醇含量 減低腎結石的排出 眼科上的應用 抗凝血作用 傷口癒合 在 60 年代之後, 國外也有將 ChS 用於防治某些心臟疾病, 目前還使用於某些神經性 頭痛 神經痛 關節痛 偏頭痛 動脈硬化等病症, 以及鏈霉素引起的聽覺障礙及 肝炎的輔助治療 第二章材料與方法 2.1 萃取 藥品與儀器 1. 西吡氯銨 (cetylpyridinium chloride,sigma) 32
2. 丙酮 (acetone, 第一化工 ) 3. 37% 甲醛 (formalin,wako) 4. 醋酸鈉 (sodium acetate,merck) 5. 醋酸 (acetic acid,wako) 6. 鹽酸 (HCl,Wako) 7. 氫氧化鈉 (NaOH,Wako) 實驗方法 一 玻尿酸萃取 (1). 將解凍的雞冠切成碎片後, 以 1% 西吡氯銨 (cetylpyridinium chloride) 水溶液清 沖洗, 再以去離子水清洗 (2) 混合 1000g 丙酮 ( acetone ) 37% 甲醛 ( formalin )100g 50g 醋酸鈉 ( sodium acetate ) 和 1000g 碎雞冠, 雞冠混合液 ph 6.7, 在室溫下持續攪拌 24 小時 (3). 以尼龍網過濾混合液, 過濾後雞冠以 500g 丙酮清洗, 接著在空氣中乾燥, 最終重約 500g (4). ( 第一次萃取 ) 取乾燥後雞冠混合去離子水約 2.5 l, 室溫下持續緩慢攪拌 72 小 時 33
(5). 以尼龍網過濾混合液 (6). 將 2 l 濾液混合 4 l 丙酮和 20g 醋酸鈉, 收集所產生的白色膠狀沉澱物 ( 或經 由離心收集 ), 經由冷凍乾燥後可得棉花狀成品 (7). ( 第二次萃取 ) 第 5 步驟的雞冠再加入去離子水至 2.5 l, 室溫下攪拌 48 小時, 重複前述過濾步驟 (8). 重複第六步驟可得玻尿酸鈉 (9). ( 第三次萃取 ) 重複第二次萃取步驟, 可得玻尿酸鈉 二 軟骨素萃取 34
(1). 各部位軟骨切碎後加入 10 倍體積去離子水 (2). 以醋酸將 ph 值調整為 4.5 (3). 在 37 下作用 7 小時 ( 作用時需維持 ph 值為 4.5, 如上升即加入醋酸 ) (4). 作用完後以離心機分離出上清液 (5). 將上清液煮沸並維持在 90 直到乾燥即可獲得軟骨素 ( 或冷凍乾燥 ) 三 幾丁聚醣製備 步驟一 : 去除碳酸鈣 (1). 取 100g 蝦殼粉加入 1L 的 2N HCl (2). 在室溫下攪拌 24hr 讓碳酸鈣與鹽酸作用 (3). 用 4700g 20min 25 的條件離心, 倒掉上清液後水洗 離心重複三次, 收集清洗後的沉澱物進行去除蛋白質的步驟 步驟二 : 去除蛋白質 (1). 將除去碳酸鈣的蝦殼粉加入 1L 的 2N NaOH (2). 隔水加熱 80 24hr, 使蛋白質變性 (3). 用 4700g 20min 25 的條件離心, 倒掉上清液後水洗 離心重複三次 ; 收集清洗後的沉澱物 ( 幾丁質 ) 以 60 烘乾並秤重 35
步驟三 : 去乙醯化 (1). 將幾丁質加入 60% 的 NaOH(20 倍幾丁質重量的體積 )4hr 100 (2). 用 4700g 20min 25 的條件離心, 倒掉上清液後水洗 離心重複三次 ; 收集清洗後的沉澱物 ( 幾丁聚醣 ) 以 60 烘乾並秤重 2.2 高效液相層析 (High Performance Liquid Chromatography) 藥品與儀器 1. 磷酸鈉溶液 (trisodium phosphate,showa) 2. 醋酸鈉溶液 (sodium acetate,merck) 3. 磷酸溶液 (phosphoric acid,showa) 4. 高效液相層析儀 (waters 410) 5. UV 偵測器 (Jasco uv-2075) RI 偵測器 (Jasco RI-930) 6. 分析管柱 SB-803HQ 和 SB-804HQ( 立行科技,Shodex) 實驗方法 (1). 配置好所需移動相溶液, 以 0.2μm 濾膜過濾 (2). 開啟儀器並以移動相溶液進行管柱沖洗步驟 (3). 24 小時後, 開啟偵測器, 通時將溶液流速升至所需流量 36
(4). 待基線平衡穩定後即可開始進行分析 Table.2.1 各種 HPLC 分析條件 玻尿酸幾丁聚醣軟骨素 移動相 50mM 磷酸鈉溶 0.5M 醋酸鈉溶 0.1M 磷酸溶液, 液,pH 6.5 液,pH 3.7 ph 4.5 流速 0.3 ml/min 0.3 ml/min 0.5 ml/min 分析管柱 SB-803HQ SB-804HQ SB-803HQ 偵測波長 UV 206nm RI UV 231nm 樣品濃度 0.2 mg/ml 20 mg/ml 20 mg/ml 2.3 傅立葉轉換紅外線光譜分析 (FT-IR Analysis) 藥品與儀器 1. 傅立葉轉換紅外線光譜分析儀 (Jasco,FT/IR-300E) 實驗方法 (1). 確定儀器腔體內部無其他物質 37
(2). 開啟電源, 並靜待約 10 分鐘使紅外線光源穩定 (3). 啟動電腦連線, 進入 Windows 系統啟動 Jasco FTIR 應用程式 (4). 將樣本少許 ( 約 1mg) 與 KBr 粉末 ( 約 100mg) 放入碼瑙研缽中研磨均勻, 再將 粉末倒入盤中均勻壓平 (5). 將 FT/IR-300E 打開 (6). 將樣本試片夾具放入腔體中 (7). 開始測試 2.4 氧氣電漿反應 藥品與儀器 1. 電漿反應器 (SAMCO,Model PD-2S) 2. Polyglactin 縫線 (Polyglactin 910, 佳合醫材 ) 實驗方法 (1). 腔體破真空, 以酒精擦拭並舖上鋁箔紙 (2). 放入縫線並固定, 避免真空抽取或電漿時影響 (3). 抽真空 30 分鐘 ( 真空度至少 30 mtorr 以下 ) (4). 打入氧氣維持真空度為初始值 +100 mtorr, 維持 10 分鐘 38
(5). 開始電漿處理, 時間為 5 分鐘 (6). 結束後破除真空狀態, 取出樣品 2.5 紫外光表面接枝 藥品與儀器 1. UV 光接枝器 (Hemchman) 2. Acrylic acid (AAc)(Wako) 3. 幾丁聚醣醋酸溶液 實驗方法 (1). 將電漿處理過縫線泡入含有 10% AAc 溶液中 ( 含 25% vit BB2) (2). 放置於冷卻水浴槽中 (3). 打開 UV 光照射器 (4). 照射時間 40 分鐘, 每隔 10 分鐘需暫停 ( 避免過熱 ) (5). 取出縫線以二次水洗淨 (6). 重複接枝步驟, 但溶液換為幾丁聚醣醋酸溶液 39
2.6 拉伸試驗 藥品與儀器 1. 萬能拉伸機 (Lloyd Instruments,LRX) 實驗方法 (1). 取改質與未改質的缝線各裁剪成約 5 公分長短 (2). 將缝線兩端各約 1 公分固定於萬用測定儀, 輸入缝線參數 ( 長度 5 cm 直徑 0.15 mm) (3). 歸零後, 以 20mm/min 的速度進行測試直到縫線斷裂為止 2.7 抗菌實驗 40
藥品與儀器 1. LB 培養液 (DIFCO) 2. LB 培養基 (DIFCO) 3. 綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa )( 食品工業發展研究所 ) 實驗方法 (1). 先以三區劃菌培養單一菌落綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa ), 培養至少 12 小時 ( 以不超過 16 小時為限 ) (2). 挑出單一菌落至 LB 培養液中 (3 ml),37 下震盪培養至少三小時 (3). 取 200μl 菌液均勻塗在 LB 培養基上, 並放入已處裡過縫線 (4). 在 37 下培養經過 1~2 天後進行觀察 2.8 血小板再鈣化時間測定 藥品與儀器 1. sodium citrate (Amresco) 2. CaCl 2 ( 和光 ) 3. 表玻璃 4. 血液試管震盪器 ( 每得科技,VR-01) 41
實驗方法 (1). 將新鮮血液與 3.8% sodium citrate 溶液以 9:1 比例混合 (2). 取出 1.5 ml 血液在 4 下以 2000 g 離心 20 分鐘, 保留上清液即為 Platelet-poor Plasma(PPP) (3). 取 5 公分縫線置於表玻璃上, 取 500 ul PPP 和 250 ul 0.05M CaCl 2 溶液混合 (4). 置於 37 水浴中, 偶爾拿出攪拌, 直到產生凝結現象 ( 血纖維蛋白栓 ) (5). 紀錄 CaCl2 溶液混合至凝結開始形成時間即為 PRT 2.9 紅血球溶解分析測定 藥品與儀器 1. sodium citrate (Amresco) 2. NaCl 溶液 (Merck) 3. CaCl 2 ( 和光 ) 4. 血液試管震盪器 ( 每得科技,VR-01) 5. 分光光度計 (ThermoSpectronic Helios beta) 實驗方法 標準曲線 42
(1). 將新鮮血液與 3.8% sodium citrate 溶液以 9:1 比例混合 (2). 取出 50 ul 全血, 加入 2.5 ml 不同濃度 NaCl 溶液內 (0.1% 0.2% 0.3% 0.35% 0.4% 0.425% 0.45% 0.475% 0.9%) (3). 混合均勻,37 下靜置培養每兩小時取出重新混合 (4). 6 小時後, 以 750 g 室溫下 離心 5 分鐘, 取上清液測試 OD545 吸光值 縫線測試 (1). 將新鮮血液與 3.8% sodium citrate 溶液以 9:1 比例混合 (2). 取出 50 ul 全血, 加入 2.5 ml 濃度 0.9% NaCl 溶液內, 同時放入約 30 公分 縫線 (3). 混合均勻,37 下靜置培養每兩小時取出重新混合 (4). 6 小時後, 以 750 g 室溫下 離心 5 分鐘, 取上清液測試 OD545 吸光值 2.10 具孔洞高分子薄膜製作 藥品與儀器 1. poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate);phbv (ENMAT) 2. poly-d,l-lactide-co-glycolide (molar ratio:50:50);plga (Bioinvigor) 實驗方法 43
(1). 以 0.05g/ml 的濃度將重量比例為 80/20=PHBV:PLGA 的藥品放入樣品瓶 中, 並加入氯仿 (2). 再將樣品瓶放入燒杯中隔水加熱, 並控制水溫在 55±5 持續攪拌 5 小時 (3). 接著加入以 60mm 篩網篩過之細鹽, 攪拌均勻後吸取 10ml 置入玻璃皿中 (4). 為避免蒸散速率過快, 操作期間關閉通風系統 (5). 將玻璃皿蓋上鋁蓋, 打開通風系統 (6). 靜置至溶劑完全揮發, 再取出薄膜以二次水浸泡 ( 除去鹽分 ), 即得本實驗所 需高子薄膜 2.11 接枝反應 藥品與儀器 1. N-(3-Dimethylaminopropyl)-N -ethylcarbodiimide hydrochloride(edc)(wako) 實驗方法 (1). 將表面改質過後的膜, 浸泡於 ph 4 0.01 M EDC 溶液 (4 2hr) (2). 接著再浸泡於 2.5mg/ml Chs PH 4 的溶液中 (4,24hr) (3). 取出烘乾 2.12 細胞相容性實驗 44
藥品與儀器 1. Minimum essential medium (MEM)/Alpha medium( HyClone) 2. Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Scharlau) 3. 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) (Sigma) 4. 細胞株 : Name: CCD-966SK Type: Human skin fibroblast (ATCC) 5. 酵素免疫分析儀 (EL311,Bio-Tek) 實驗方法 (1). 取電漿處理後的 PHBV/PLGA 掺合膜, 裁成一定的大小 ( 直徑約 1.5 cm 的 圓 ) (2). 將裁好的膜浸泡酒精 5 分鐘後, 以二次水清洗, 放入紫外光下殺菌一天 (3). 接著將膜放入 24 孔盤中, 種入細胞株 CCD-966SK 於 24 well 連續 4 天 (4). 固定時間移除 well 之中的 medium, 並加入濃度 2-5mg/ml 之 MTT 溶液 250 μl 45
(5). 37 下培養 4H( 可蓋鋁箔或不蓋 ) (6). 移除含 MTT 之 medium 立刻每 well 加入 1ml 之 DMSO (7). 取出 225μl 的混合液到 96well, 並在 570nm 下讀取吸光值 第三章結果與討論 3.1 萃取結果 第一部份為玻尿酸萃取, 首先將從市場買來的雞冠清洗乾淨後切碎, 接著便將 雞冠浸泡在丙酮 醋酸鈉與甲醛混合液中以去除一些不要的雜質, 然後把處理過後 的雞冠以丙酮清洗乾燥, 最後再以水進行萃取, 總共萃取三次, 目前連續萃取所得 的產率分別為 : 第一次萃取約 0.50%, 第二次萃取約 0.63%, 第三次萃取約 0.13%, 三次所萃取的產率總和大約為 1.26% 左右 第二部份為幾丁聚醣, 將清洗後的蝦殼粉與鹽酸 氫氧化鈉反應後, 再以清水 洗淨 烘乾, 結果每 100 公克的蝦殼粉約可得到 16.95 公克的幾丁質, 產率約為 17 % 將萃取得到的幾丁質與氫氧化鈉再次反應可得到 11.4 公克的幾丁聚醣, 由此可 46
知每 100 蝦殼粉約可得到 11.4 公克的幾丁聚醣, 產率為 11.4% 最後的部份為軟骨素萃取, 一樣先將所購得的猪支氣管進行處理, 首先盡量將 支氣管上除了軟骨之外的部份去除, 去除完畢之後將軟骨洗淨切碎, 接著把軟骨浸 入 ph 4.5 的二次水中進行萃取, 之後過濾上清液並乾燥所得產率約為 0.7%, 所得 結果整理於下表 (table.3.1) 3.2 高壓液相層析 (HPLC) (1) 玻尿酸 為了確認萃取出來的物質中是否有玻尿酸, 在此使用高壓液相層析進行測試, 首先分析從市面上所購得的玻尿酸標準品, 從實驗結果得知, 在大約 17 分鐘左右會 有第一個波峰產生, 接著在 33 ~ 34 分鐘的時候產生了第二個波峰, 然後在 39 ~ 40 分鐘左右產生了一個向下凹陷的波峰, 雖然第二個波峰明顯較第一個高, 但是無法 辨識哪個波峰為我們所要的玻尿酸, 所以第二次分析時將玻尿酸濃度減半, 所得到 47
結果如下圖 (fig.3.1),a 和 b 分別為第一次與第二次結果, 進行比較後發現, 在相同 時間皆有波峰產生, 但是只有在 33 ~ 34 分鐘左右產生的波峰明顯不同,a 的濃度為 b 的兩倍, 而 a 的高度大約也為 b 的兩倍, 由此我們可以證明, 在 33 ~ 34 分鐘左右 出現的波峰即為我們所要的玻尿酸 找出玻尿酸波峰出現的時間後, 接下來便分析從雞冠中所萃取出來的物質, 並 與標準品進行比對, 看萃取物中是否含有玻尿酸的成份, 結果如下圖 (fig.3.2),a 為 玻尿酸標準品,b c d 則分別為不同次萃取產物, 從圖中可看到, 三次萃取中所 得到的產物在 33 ~ 34 分鐘時同樣也會出現一明顯波峰, 結果與玻尿酸標準品相同, 藉此我們可得知, 我們所萃取出來的物質中確實含有玻尿酸的成份存在 48
(2) 幾丁聚醣 幾丁聚醣的分析同樣也是使用高壓液相層析, 步驟和進行玻尿酸分析時相同, 首先必須找出幾丁聚醣波峰出現的時間, 結果如下圖 (fig.3.3), 在此我們準備了三種 不同濃度的幾丁聚醣標準品, 分別為 10 mg 5 mg 和 2.5 mg, 從圖中我們可發現, 在 18 分鐘 35 分鐘時會有向上波峰產生, 而 42 分鐘左右會有一向下波峰, 由於第 二個波峰的高低落差無一定規則, 所以推測在 18 分鐘時出現的第一個波峰才是我們 所要的幾丁聚醣 49
但第 18 分鐘所出現波峰有重疊的情形, 於是將圖形局部放大進行比較, 結果如 下圖 (Fig.3.4), 我們可以發現到, 在第 20 分鐘時還會有另一波峰出現, 經由分析後 發現, 第 20 分鐘後所出現波峰為幾丁聚醣 最後再與不同條件所萃取的幾丁聚醣比較, 從圖中可看到 (fig.3.5), 箭頭所指為 標準品, 而在另外三條曲線中, 只有第二條曲線在 20 分鐘時會有波峰出現, 另外兩 條曲線則無, 結果顯示其含有幾丁聚醣成分, 推測會有此種結果的原因是其他兩組 去乙醯化反應時間太短所導致 50
51
(3) 軟骨素 軟骨素的分析比較與前面一樣, 先藉由不同的濃度來找出軟骨素波峰出現的時 間點, 結果如下 (fig.3.6), 在 13 分鐘與 17 分鐘左右分別出現明顯波峰, 經由面積比 較 13 分鐘的波峰面積比例符合濃度比例, 因此證實 13 分鐘出現的波峰為軟骨素 接著進行萃取物質的分析, 但經由分析出來的結果卻發現 (fig.3.7), 由於萃取物 中其他雜質太多, 導致出現許多大大小小不同的波峰, 在第 13 分鐘也無法明顯看出 是否有軟骨素的波峰出現, 因為有其它的波峰重疊 52
所以為了觀察萃取物中是否真有軟骨素成份存在, 另外再加入酵素作用, 待酵 素作用完畢後再進行分析, 分析結果如下, 圖 3.8 為軟骨素標準品經酵素作用後結 果, 在接近 3 分鐘與 5 分鐘左右各會出現一波峰, 同樣經過濃度比較後確認接近 5 分鐘左右的波峰為我們所要觀察的軟骨素波峰 接著再分析反應後的萃取物, 從結 果圖中可看到 (fig.3.9), 接近 5 分鐘時也出現了我們所想要的波峰, 因此證實萃取物 中確實有軟骨素的成份 53
54
3.3 傅立葉轉換紅外線光譜分析 (FTIR) 證實萃取物中確實含幾丁聚醣的成分之後, 接下來為了比較幾丁聚醣標準品與 萃取物之間的差異, 於是我們使用傅立葉轉換紅外線光譜分析 (FTIR) 進行分析, 想知道兩者之間去乙醯程度的差異, 結果如下圖 (fig.3.10), 由上而下的三條曲線分 別為幾丁質標準品 萃取幾丁聚醣 幾丁聚醣標準品, 乙醯基的吸收波長約在 1635 nm, 因此我們便比較三者在此波長的吸光值, 而所購得幾丁質與幾丁聚醣標準品此 處所得到的值再與所萃取幾丁聚醣比較計算後, 推算萃取所得幾丁聚醣去乙醯度約 為 70% 55
3.4 接枝結果 接枝前長度為 50 公分的縫線重量約 25.81mg, 利用幾丁聚醣接枝後重量變為 27.35mg, 由此推斷可得知, 每 1 公分長度的縫線上約可接枝 0.03mg 的幾丁聚醣 3.5 拉伸試驗 在進行完缝線改質之後, 接著進行拉伸測試, 拉伸測試目的是為了觀察改質的步驟是 否會對缝線的強度造成影響, 分析後的結果圖顯示如下 (fig.3.11), 左圖橫軸為應變, 縱軸為 應力, 曲線右邊最高點為缝線斷裂點, 即縫線所能承受的最大拉力, 而圖中箭頭所指切線 斜率為楊氏係數, 楊氏係數定義為應力與應變的比值, 但必須是在可恢復形變的條件之下, 超出材料可恢復範圍的數值不列入計算 56
比較未改質縫線與改質縫線的拉伸結果可發現, 未改質縫線的楊氏係數為 27278 MPa, 而未改質縫線所能承受的最大拉力值為 700 MPa, 如果經過改質後, 縫線的楊氏係數增加至 36969 MPa, 強度也增加為 1413 MPa, 經由比較下可發現, 改質後的缝線強度並未降低, 反而有略微上升的現象, 由此可證實, 改質步驟並不會降低縫線原始的強度, 進而降低縫 線所能承受的力量, 反而能承受更大的力道 3.6 抗菌實驗 進行完電漿改質步驟之後, 接下來為了測試改質後縫線是否真的具有我們所想 要的抑菌效果, 於是我們做了抗菌能力的實驗, 在此所使用的菌種為綠膿桿菌, 會 選用綠膿桿菌的原因就是因為此菌為醫院院內感染最常見到的病菌之一 從實驗結果可發現, 在未改質縫線的部分並無明顯抑制細菌生長的情形發生 (fig.3.12a), 但在以電漿處理過並塗佈幾丁聚醣的縫線中卻可以觀察到 (fig.3.12b), 雖 然綠膿桿菌持續生長, 卻不會生長至縫線上, 反而在縫線周圍產生一明顯的抑制區 57
域, 因此證實改質過後的縫線確實具有較原本良好的抗菌能力 3.7 血小板再鈣化時間測定 當血液暴露於空氣中一段時間後, 便會開始產生凝結現象, 血液的凝結有許多因素, 血小板的鈣化便是其中一項 因此我們在血液中加入縫線以測試其相容性, 如果縫線與血液的相容性良好, 也就表示縫線不會對血液產生影響, 那血小板鈣化的時間將不會有明顯改變 ( 時間延長或縮短 ), 假使與血液的相容性越差, 那便會加速再鈣化的產生, 使得血液再鈣化的產生時間縮短 從下圖結果可得知 (fig.3.13), 原本空白組的血液從液態至形成血小板鈣化所需時間大約為 205 秒, 而標準縫線與改質縫線的血液再鈣化所需時間則分別為 183 秒和 193 秒, 依據此結果判斷, 縫線改質雖然會造成血小板鈣化時間縮短, 但未改質縫線同樣也會縮短血小板鈣化時間, 而且效果更好 58
3.8 紅血球溶解分析測定 首先製作標準曲線, 此標準曲線為不同濃度氯化鈉對於紅血球的影響, 從圖中 可看出 (fig.3.14), 當氯化鈉濃度越低, 所造成紅血球破裂的程度越嚴重, 尤其在 0.4%~0.475% 間, 由於紅血球破裂時會釋放出血紅素, 而所釋放出的血紅素便會使 得吸光值上升, 紅血球的破裂同時也是造成血液凝集的其中一項因素 從下圖結果顯示, 未改質縫線此組血液所得到吸光值約為 0.02, 而改質後縫線 這組的血液吸光值約為 0.08( 介於 0.45%~0.475% 吸光值間 ), 此兩組氯化鈉濃度皆為 0.9%, 如未加任何縫線時血液吸光值為 0.014, 因此可知改質後的縫線會造成紅血球 破裂程度增加, 也就是血液相容性會下降 59
3.9 細胞相容性 將未接枝薄膜 接枝明膠與接枝軟骨素之薄膜進行細胞培養, 再以 MTT assay 測試比對, 結果如下 (fig.3.15), 首先是未接枝薄膜, 可以看到細胞的數量隨著培養 的時間逐漸增加, 但增加的細胞數量很少 ; 接著是明膠薄膜, 在培養到第四天的時 候, 可明顯發現細胞數量上升, 但在培養六天後, 細胞數量卻有漸漸減少的趨勢 ; 最後是軟骨素薄膜, 雖然在第一天的觀察發現細胞數量為最少, 不過在培養至第四 天的時候, 細胞數則明顯超越其他兩組, 在第六天的時候也沒有下降的趨勢, 反而 隨著時間的增長細胞量持續增加 經由以上三組數據結果的比較, 我們可以得知軟骨素薄膜上細胞的貼覆生長效 60
果比其他兩組還要好, 接枝軟骨素後能增加細胞在薄膜上的生長量, 證明了軟骨素 確實對於細胞的貼覆生長有正面的效果 61
第四章結論 首先是玻尿酸部份, 第一次萃取產率約為 0.50%, 第二次萃取約 0.63%, 第三 次萃取約 0.13%, 三次所萃取的產率總和大約為 1.26% 左右, 在萃取完之後利用高 壓液相層析法 (HPLC) 進行分析並與所購買的標準品做比較後, 證實我們的萃取物 中確實含有玻尿酸的成份, 再把萃取物中的玻尿酸濃度與標準品進行比較, 發現萃 物物中所含玻尿酸濃度比所購買的玻尿酸要來的高, 推測可能是由於標準品在加工 過程中的種種步驟, 使得玻尿酸損失而使得含量下降 接著從蝦殼粉中萃取幾丁聚醣, 結果每 100 公克的蝦殼粉約可得到 16.95 公克 的幾丁質, 產率約為 17%, 將萃取得到的幾丁質與氫氧化鈉再次反應可得到 11.4 公 克的幾丁聚醣, 由此可知每 100 蝦殼粉約可得到 11.4 公克的幾丁聚醣, 產率約為 11.4 % 萃取完畢後同樣以高壓液相層析法 (HPLC) 進行分析並與所購買的幾丁聚醣標 準品做比較, 經由比較過後, 證實其中含有幾丁聚醣成份 在確認成份後, 再把萃 取所得的幾丁聚醣拿去用 FT-IR 進行分析, 想得知其去乙醯程度為多少, 經由分析 所得到的結果得知, 萃取出來的幾丁聚醣去乙醯程度大約為 70% 最後為軟骨素萃取, 先將所購得的猪支氣管處理, 利用軟骨進行萃取, 之後過 濾上清液並乾燥所得產率約為 0.7%, 由於直接以高壓液相層析法無法判斷是否具有 軟骨素, 因此另外加入酵素反應後再測試, 結果確實含有軟骨素成份 在進行完數種材料的萃取後, 我們試著將其應用到不同的方面, 首先是將所萃 62
取出的幾丁聚醣與 Polyglactin 縫線進行接枝反應, 先在 Polyglactin 縫線表面進行電 漿表面改質處理, 接著浸泡 AAc 幾丁聚醣溶液進行 UV 光照射使幾丁聚醣接枝上 縫線表面, 接枝完畢後藉由拉伸試驗測試接枝後縫線強度 比較未改質縫線與改質 縫線的拉伸結果, 縫線接枝前後的楊氏係數分別為 27278 MPa 和 36969 MPa, 而所 能承受的最大拉力從改質前的 700 MPa 上升到 1413 MPa, 經由比較下可發現, 改質 後的缝線強度並未降低, 反而有略微上升的現象, 由此可得知, 此改質步驟並不會 造成縫線強度下降, 能承受的力道反而提昇, 因此能保有原本的強度不會影響其使 用 由於原本幾丁聚醣便帶有抗菌能力, 所以在此想測試接枝後的縫線是否也增加 了抗菌性, 於是下一步便將縫線用於抑菌培養, 從實驗的結果可看到, 未改質縫線 的周圍細菌可正常生長 (fig.3.12a), 但在以電漿處理過並接枝幾丁聚醣的縫線中卻可 以觀察到 (fig.3.12b), 縫線的周圍出現顏色較為透明的抑制區域, 綠膿桿菌不會生長 至縫線上, 因此證實改質過後的縫線確實具有比較良好的抗菌能力, 改質接枝幾丁 聚醣可增加縫線本身的抗菌效果 確認本製程能提高縫線抗菌效果與避免降低縫線 強度之後, 接著拿改質後之縫線進行血液試驗, 以便得知縫線改質前後是否會影響 其血液相容性 在血小板再鈣化的實驗中, 空白組的血液形成血小板鈣化所需時間 大約為 205 秒, 而未改質縫線與改質縫線的血液再鈣化所需時間分別為 183 秒和 193 秒, 依據此結果判斷, 縫線改質對於血小板再鈣化時間的影響並不明顯, 雖然有縮 短鈣化時間的效果產生, 但未改質縫線也有此現象出現 而紅血球溶解的部份, 未 63
改質縫線此組血液所得到吸光值約為 0.02, 而改質後縫線的血液吸光值約為 0.08, 兩組的氯化鈉濃度皆為 0.9%, 如未加任何縫線時血液吸光值為 0.14, 因此可知改質 後的縫線會造成紅血球的破裂, 也就是改質後縫線的血液相容性會下降 最後的血 液相容性實驗中, 雖然對於血小板再鈣化無明顯影響, 但卻會促使紅血球破裂, 因 此加速了血液的凝結, 進而能達到止血的效果 另外我們也試著將所萃取得到的軟骨素接枝至聚羥基丁酯戊酯 (PHBV)/ 聚乳酸 - 甘醇酸 (PLGA) 生物高分子孔洞薄膜上, 看對於細胞的增生貼覆會有何影響, 並與 未接枝薄膜 接枝明膠的薄膜進行 MTT assay 測試分析比較 結果經由比較可以得 知軟骨素薄膜上細胞的貼覆生長效果最好, 接枝軟骨素後確實能有效提升細胞貼覆 率, 進而提昇細胞增生數目, 證明了軟骨素確實對於細胞的貼覆生長有正面的效果 64
參考文獻 黃定國 2001 透明質酸之開發與應用 菌種保存及研究簡訊 (14) 3:1-9 王奕嵐 1997 透明質酸還原端氧化衍生物之應用 碩士論文 陽明大學 台灣 台北 陳士軒 1996 透明質酸之製備與傷口癒合應用 碩士論文 陽明大學 台灣 台北 葉力子 2002 讓雞蛋減產真有那麼困難嗎? 畜產報導 19: 22-23 95 年農業統計年報 陳盈州 2001 去乙醯度 濃度及 ph 值對幾丁聚醣流變特性及其肌原纖維蛋白 質交互作用之研究 靜宜大學食品營養研究所碩士論文 陳美惠 莊淑惠 吳志律 1999 幾丁聚醣的物化特性 食品工業 31:1-6 吳家成 2001 幾丁質與幾丁聚醣之理化性質 食品工業 幾丁質 / 幾丁聚醣專輯 新竹 林欣榜 1999 幾丁類物質在食品加工上之應用 食品工業 31(10):26-37 李勳宜 1988 草蝦幾丁聚醣之製備及應用研究 台灣大學食品科技研究所碩士 論文 Singla, S. K.. 1987. Nomenclature of hyaluronic acid. Biochem. J. 242:623. Hascall, V. C., and T. C. Laurent. 1998. Hyaluronan: Structure and physical properties. GlycoForum: Science of Hyaluronan-1. 65
Laurent, T. C., and J. R. Fraser. 1992. Hyaluronan. FASEB J. 6:2397-2404. Meyer, K. and J. W. Palmer. 1934. The polysaccharide of vitreous humor. J. Biol. Chem. 107: 629-634. Scott, J. E.. 1998. Secondary and tertiary structures of hyaluronan in aqueous solution. Some biological consequences. Glycoforum: Science of Hyaluronan-2. Bothner, H. and O. Wik. 1987. Rheology of hyaluronate. Acta Otolaryngol (Stockh) 442:25-30. Hayase, S., Y. Oda, S. Honda, and K. Kakehi. 1997. High-performance capillary electrophoresis of hyaluronic acid: Determination of its amount and molecular mass. J. Chromatography A 768: 295-305. Ghosh, P.. 1994. The role of hyaluronic acid (hyaluronan) in health and disease: Interactions with cells, cartilage and components of synovial fluid. Clin. and Exp. Rheumatol. 12:75-82. Balazs, E. A.. 1979. Ultrapure hyaluronic acid and the use therefore. US. Pat. 4141973. Nakano, T. and J. S. Sim. 1991. Chemical composition of glycosaminoglycan fractions from the comb and wattleof Single Comb White Leghorn roosters. Poultry Sci. 70: 2524-2528. Tufvesson, B., M. Tufvesson, K. Lillpers, K. Johansson and M. Wilhelmson. 1999. Single-step divergent selection for male comb shape in two White Leghorn lines. Bri. 66
Poultry Sci. 40: 209-216. Weigel, P. H.. 1998. Bacterial hyaluronan synthases. GlycoScience: Science of Hyauronan HA06. O Regan, M., I. M. Martini, F. Cresscenzi, C. Luca and M. Lansing. 1994. Molecular mechanism and genetic of hyaluronan biosynthesis. Int. J. Biol. Macromol. 16: 283. Balazs, E. A.. 1990. Medical applications of hyaluronan and its derivatives. In Cosmetic and Pharmaceutical Applications of Polymers: 293. Plenum Pess, New York. Daly, T. H.. The repair phase of wound healing-re-epitheliaiztion and contraction. Wound Healing: Alternatives in Management: 14. F. A. Davis Press, Philadephia. Carbrera, R. C.. 1995. The in vivo effect of hyaluronan associated protein-collagen complex on wound healing. Biochem. And Molecular Biol. Int. 37: 151-158. Okascala, O. 1995. Expression of proteoglycans and hyaluronan during wound healing. J. Histochem. Cytochem. 43: 125-135. West, D. C., I. N. Hampson, F. Arnoid and S. Kumar. 1985. Angiogenesis induced by degradation products of hyaluroic acid. Science 28:1324. Duranti, F., G. Salti, B. Bovani, M. Calandra and M. L. Rosati. 1998. Injectable hyaluronic acid gel for soft tissue augmentation. Dermatol. Surg. 24: 1317-1325. Knorr, D. 1984. Use of chitinous polymers in food-a challenge for food research and development. Food Technol. 38(1): 85-97. 67
Shahidi, F., J. K. V. Arachchi and Y. J. Jeon. 1999. Food applications of chitin and chitosans. Trends Food Sci. Technol. 10:37-51. Ravindra R., K. R. Krovvidi and A. A. Khan. 1998. Solubility parameter of chitin and chitosan. Carbohydr. Polymers 36(2):121-127. Hadwiger, L. A., D. F. Kendra, B. W. Fristensky and W. Wagoner. 1985. Chitosan both activates genes in plants and inhibites RNA synthesis in fungi. In Chitin in Nature and Technology. Muzzarelli, R. A. A.,Jeuniaux, C., Gooday, C. (ed). Plenum Press, New York. P. 210. Poulicek, M., M. F. Voss-foucart and C. Jenuianx. 1986. Chitinoproteic complexes and mineralization in Mollusk skeletal structures. In: Proceedings of the Third Internation Conference on Chitin and Chitosan. Plenum Press. New York. Brine, C. J. and P. R. Austin. 1981. Chitin variability with species and method of preparation. Comb. Biochem. Physio l. 68:283-291. Young, D. H., H. Köhle, and H. Kauss. 1982. Effect of chitosan on membrane permeability of suspecnsion-cultured Glycine max and Phaseolus vulgaris cells. Plant physiol. 70:1449-1454. Nicola V, Adele M, Luisa S. Note Stability studies of Chondroitin Sulfate.Carbohyd Res 315: 345-349, 1999. Morrela P, Maopulo R. Comparison of anti-inflammatory efficacy of Chs and 68
diclofenac sodium in-patient with knee osteoarthritis. J Rheomat 23: 1385-1391, 1996. Anderson MA, Slater MR, Hammad TA. Results of a survey of small-animal practitioners on the perceived clinical efficacy and safety of an oral nutraceutical. Prevent Vet Med 38: 65-73, 1999. Cordoba F, Nimni ME. Chondroitin sulfate and other sulfate containing chondroprotective agents may exhibit their effects by overcoming a deficiency of sulfur amino acids. Osteoarthr Cartil 11: 228-230, 2003. Lippiello L. Glucosamine and chondroitin sulfate: biological response modifier of chondrocytes under simulated conditions of joint stress. Osteoarthritis and Cartilage 11: 335-342, 2003. Conte A, Volpi N, Palmieri L. Biochemical and pharmacokinetic aspects of oral treatment with chondroitin sulfate. Arzneim Forsch 45: 918-925, 1995. Rovetta G. Galactosaminoglycuronoglycan sulfate ( Matrix ) in therapy of tibiofibular osteoarthritis of the knee. Drug Exp Clin Res 17: 53-57, 1991. 69