第 卷 第 期 年 月 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版!"#$## %&'&! 基 础 研 究 窄 谱 中 波 紫 外 线 通 过 下 调 表 达 促 进 黑 素 细 胞 增 殖 和 黑 素 生 成 董 妍 李 文 彬 郑 雯 王 娟 马 慧 群 曾 维 惠 西 安 交 通 大 学 第 二 附 属 医 院 陕 西 西 安 $ 陕 西 省 中 医 医 院 皮 肤 科 陕 西 西 安 摘 要 目 的 研 究 窄 谱 中 波 紫 外 线 %&'& 对 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 酪 氨 酸 酶 活 性 及 %' 表 达 的 影 响 探 讨 %&'& 与 %' 间 的 关 系 以 及 %&'& 治 疗 白 癜 风 的 可 能 作 用 机 制 方 法 以 $( %&'& 作 用 于 体 外 培 养 的 黑 素 细 胞 观 察 %&'& 对 细 胞 增 殖 酪 氨 酸 酶 活 性 黑 素 生 成 的 影 响 %&'& 作 用 后 检 测 %' 表 达 的 变 化 分 别 转 染 %' 模 拟 物 %' 抑 制 剂 和 %' 突 变 体 观 察 细 胞 增 殖 酪 氨 酸 酶 活 性 黑 素 生 成 的 变 化 使 用 )** 法 检 测 黑 素 细 胞 活 性 左 旋 多 巴 底 物 法 测 定 酪 氨 酸 酶 活 性 %+,- 法 检 测 黑 素 生 成 实 时 荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应.*'/0 检 测 %' 表 达 量 结 果 $( 剂 量 的 %&'& 作 用 细 胞 后 黑 素 细 胞 增 殖 酪 氨 酸 酶 活 性 增 大 黑 素 合 成 显 著 增 加 %&'& 作 用 后 %' 表 达 量 显 著 低 于 下 调 %' 表 达 后 黑 素 细 胞 增 殖 酪 氨 酸 酶 活 性 黑 素 合 成 增 加 过 表 达 ' %' 后 黑 素 细 胞 增 殖 酪 氨 酸 酶 活 性 降 低 黑 素 生 成 减 少 过 表 达 %' 后 部 分 抑 制 了 %&'& 对 黑 素 细 胞 的 作 用 结 论 %&'& 可 能 部 分 通 过 下 调 黑 素 细 胞 %' 的 表 达 促 进 黑 素 细 胞 增 殖 增 加 酪 氨 酸 酶 活 性 及 黑 素 生 成 关 键 词 窄 谱 中 波 紫 外 线 %' 黑 素 细 胞 黑 素 生 成 中 图 分 类 号 1$ 文 献 标 志 码!"!#$%&!%!""$%'!##!$% &'%!&#$%&!!!""%%$%!#$%(!",% +! #!'! 2-3% #! %("+! ) -"'."! 23% #'" #4#5!67+#-58+7569:+!(+55!;!#89:+!$ #+#!56#+575;4++!*0) -58+79:+!0!+ )*+* # " % '% (# )()"##" (*'+,),)) '%" (*'+") (#( '%(&!##""$(#( "'%#'%# )# " (#"&+'%( # '% (*'+,) (# "#"&!# #" (*'+((#(*'+" (*'+ ()# ##) # "(#"&- "#"! ("& #("")&'./ ""#(#& *(0) (## 0*1-* ""#(*'+,)& +'%$(#( ""##" (# #" (# # #" &&+ '%( (*'+,)# #) &&+#" (*'+#)(##"(##",) (*'+ "#" # ) # " ( )"#& 收 稿 日 期 修 回 日 期 通 讯 作 者 曾 维 惠 &(11&#( 优 先 出 版 ) &#&#("&&*&$&&$&($!"#"!
$ 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版 第 卷.,) (*'+ ) " # '% ( (#& '% ( )(#)##"(( ) ",)(*'+(#&,-. /) "% (*'+(#( 白 癜 风 是 由 于 不 同 原 因 所 致 黑 素 细 胞 损 伤 的 获 得 性 疾 病 表 现 为 皮 肤 色 素 缺 失 其 发 病 机 制 目 前 尚 不 清 楚 患 者 体 液 免 疫 和 细 胞 免 疫 失 常 提 示 其 发 病 可 能 与 自 身 免 疫 有 关 阻 止 皮 损 部 位 黑 素 细 胞 的 进 一 步 损 伤 促 进 正 常 黑 素 细 胞 向 皮 损 部 位 迁 移 及 黑 素 细 胞 黑 素 合 成 是 治 疗 白 癜 风 的 关 键 环 节 研 究 发 现 窄 谱 中 波 紫 外 线!+5'+!& %&'& 可 促 进 黑 素 细 胞 黑 素 的 合 成 和 增 加 酪 氨 酸 '$ 酶 活 性 可 有 效 缓 解 白 癜 风 症 状 但 是 其 具 体 机 制 仍 不 清 楚 微 小 %5%% 是 一 类 高 度 保 守 的 内 生 源 性 微 小 非 编 码 % 长 度 为 ' 通 过 特 异 性 结 合 到 目 的 % 的 非 翻 译 区 "!+!87+##;5!* 阻 止 靶 蛋 白 的 表 达 广 泛 参 与 细 胞 的 分 化 增 殖 凋 亡 以 及 肿 瘤 的 发 '1 生 和 免 疫 反 应 等 目 前 关 于 %&'& 的 作 用 机 制 与 % 关 系 研 究 尚 少 我 们 在 研 究 %&'& 对 黑 素 细 胞 酪 氨 酸 酶 活 性 影 响 时 发 现 %&'& 作 用 黑 素 细 胞 后 %' 表 达 降 低 本 文 通 过 研 究 %&'& 和 %' 对 黑 素 细 胞 增 殖 和 黑 素 合 成 的 影 响 探 讨 %&'& 治 疗 白 癜 风 的 可 能 机 制 及 其 与 %' 的 关 系 0 材 料 与 方 法 00 材 料 )$ 培 养 基 胎 牛 血 清 ' 多 巴 黑 素 细 胞 生 长 添 加 物 -) 购 自 5 公 司 二 甲 基 亚 砜 )4, 四 甲 基 偶 氮 唑 蓝 )**; 胰 蛋 白 酶 购 自 4;+ 公 司 人 表 皮 黑 素 细 胞 馈 赠 于 第 四 军 医 大 学 口 腔 医 院 *57 试 剂 盒 美 国!5;#! 公 司 *+.)+!% 检 测 试 剂 盒 和 -;0++' % 逆 转 录 试 剂 盒 美 国 6# *#!575; 公 司 脂 质 体 56#+!# *) 美 国!5' ;#! 公 司 酶 标 仪 美 国 *#537#5! 公 司 紫 外 光 疗 仪 器 & 波 长! 德 国 +7+!! 公 司 0 方 法 00 细 胞 培 养 传 代 待 细 胞 密 度 约 为 1 时 用 ; 胰 蛋 白 酶 消 化 加 入 含 <&4 青 霉 素 和 ; 链 霉 素 的 )$ 培 养 基 终 止 消 化 反 复 吹 打 成 单 细 胞 悬 液 低 速 离 心 去 除 上 清 重 新 加 入 培 养 基 将 细 胞 吹 打 均 匀 并 接 种 于 培 养 瓶 中 于 培 养 箱 中 培 养 0, = 0)** 法 检 测 细 胞 活 性 设 置 实 验 组 对 照 组 和 空 白 每 组 各 设 个 复 孔 将 黑 素 细 胞 以 的 密 度 接 种 于 孔 板 每 孔 空 白 只 加 入 培 养 基 于 = 0, 培 养 箱 中 培 养 $1 后 根 据 文 献 所 示 实 验 组 予 以 $( 的 %&'& 辐 射 不 予 以 辐 射 辐 射 后 分 别 继 续 培 养 于 结 束 前 $ 于 各 孔 加 入 ; 的 )**$ 后 小 心 吸 净 上 清 加 入 )4, 避 光 震 荡! 酶 标 仪 $! 波 长 检 测 吸 光 度 01 酪 氨 酸 酶 活 性 测 定 细 胞 接 种 于 板 实 验 组 予 以 $( 的 %&'& 辐 射 不 予 以 辐 射 刺 激 后 继 续 培 养 弃 上 清 /&4 清 洗 次 每 孔 加 入 *5!9'; 后 >1 = 放 置! 室 温 融 化 每 孔 加 入 ' 多 巴 ; = 孵 育 酶 标 仪 $! 波 长 测 各 孔 重 复 实 验 次 0 黑 素 含 量 测 定 细 胞 接 种 于 孔 板 实 验 组 予 以 $( 的 %&'& 辐 射 不 予 以 辐 射 刺 激 后 细 胞 继 续 培 养 弃 上 清 胰 酶 消 化 细 胞 培 养 基 终 止 消 化 并 吹 打 成 单 细 胞 悬 液! 离 心! 弃 上 清 /&4 清 洗 次 加 入 57 含 )4, 的 %+,-1 = 水 浴 后 将 溶 液 吸 至 孔 板 每 孔 酶 标 仪 $! 波 长 检 测 重 复 实 验 次 0% 转 染 %' 模 拟 物 %' 抑 制 剂 和 % 突 变 体 阴 性 对 照 均 由 上 海 吉 玛 公 司 合 成 用 脂 质 体 按 照 说 明 书 操 作 将 以 上 核 酸 转 入 黑 素 细 胞 后 更 换 培 养 基 进 行 后 续 实 验 0#+7'#/0 检 测 %' 表 达 分 别 提 取 %&'& 作 用 后 的 黑 素 细 胞 总 % 采 用 -;0++ % 逆 转 录 试 剂 盒 按 照 说 明 书 进 行 逆 转 录 后 用 *+.)+! % 检 测 试 剂 盒 进 行 实 时 荧 光 定 量 /0 检 测 %' 的 表 达 作 为 内 参 0 统 计 学 分 析 数 据 用 均 数? 标 准 差 表 示 统 计 分 析 使 用 4/44 软 件 对 符 合 正 态 分 布 且 方 差 齐 的 数 据 采 用 4"#!: 检 验 或 者 单 因 素 方 差 分 析 各 组 间 两 两 比 较 使 用 4' 检 验 方 差 齐 性 检 验 使 用 ##!# 检 验 若 数 据 不 符 合 正 态 分 布 或 者 方 差 齐 性 使 用 )+!!'!# 检 验 或 者 检 验!"#"!
期 董 妍 李 文 彬 郑 雯 等 窄 谱 中 波 紫 外 线 通 过 下 调 %' 表 达 促 进 黑 素 细 胞 增 殖 和 黑 素 生 成 $ 为 差 异 具 有 统 计 学 意 义 其 中 方 差 齐 性 检 验 为 差 异 具 有 统 计 学 意 义 结 果 0 对 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 及 酪 氨 酸 酶 活 性 的 影 响 使 用 $( 剂 量 的 %&'& 作 用 后 实 验 组 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 的 生 成 和 酪 氨 酸 酶 活 性 增 高 与 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 表 表 0 窄 谱 中 波 紫 外 线 对 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 及 酪 氨 酸 酶 活 性 的 影 响 *+36#856%&'&5! #7576#+5!#7+!5;#!#' 88+!58!+8#+#8!#7+!5#8? 实 验 组 %&'& 方 差 齐 性 检 验 ##!# 检 验 细 胞 增 殖? $$? $ 1 黑 素 生 成?? 酪 氨 酸 酶 活 性 1?$ $? 1 对 黑 素 细 胞 表 达 的 影 响 使 用 $( 剂 量 的 %&'& 作 用 后 提 取 总 % 反 转 录 并 对 %' 进 行 实 时 荧 光 定 量 结 果 显 示 实 验 组 %' 表 达 量 降 低 与 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 @ 图 1 对 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 及 酪 氨 酸 酶 活 性 的 影 响 将 实 验 分 为 %' 组 %' 抑 制 剂 组 和 % 阴 性 分 别 转 染 %' 模 拟 物 %' 抑 制 剂 和 %' 突 变 体 并 按 照 说 明 操 作 转 染 后 检 测 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 及 酪 氨 酸 酶 活 性 结 果 显 示 与 阴 性 对 照 相 比 %' 组 黑 素 细 胞 增 殖 和 黑 素 生 成 减 少 酪 氨 酸 酶 活 性 降 低 差 异 具 有 统 计 学 意 义 与 阴 性 对 照 相 比 %' 抑 制 剂 组 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 酪 氨 酸 酶 活 性 增 加 差 异 有 统 计 学 意 义 与 %' 组 相 比 %' 抑 制 剂 组 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 及 酪 氨 酸 酶 活 性 明 显 增 加 差 异 有 统 计 学 意 义 表 图 0 对 黑 素 细 胞 表 达 的 影 响 <;36#856%&'&5!###885!56%'!#7+!5#8 以 作 为 内 参 照 标 准 化 处 理 与 比 较 表 对 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 及 酪 氨 酸 酶 活 性 的 影 响 *+36#856%'5! #7576#+5!#7+!5;#!#88+!58!+8#+#8!#7+!5#8 %' 组 %' 抑 制 剂 组 % 阴 性 方 差 齐 性 检 验 ##!# 检 验? 细 胞 增 殖?? $$?$ 11$ 黑 素 生 成?? $?1 1 酪 氨 酸 酶 活 性 1?? $? 1$ %' 组 与 %' 抑 制 剂 组 比 较 %' 组 与 % 阴 性 比 较 %' 抑 制 剂 组 与 % 阴 性 比 较 转 染 部 分 下 调 了 对 黑 素 细 胞 的 作 用 将 实 验 分 为 %' 组 %' 抑 制 剂 组 和 % 阴 性 按 照 转 染 说 明 操 作 转 染 后 对 各 组 进 行 $( 剂 量 的 %&'& 照 射 继 续 培 养 后 检 测 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 及 酪 氨 酸 酶 活 性 结 果 显 示 %&'& 促 进 了 各 组 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 增 加 了 酪 氨 酸 酶 活 性 其 中 %' 抑 制 剂 组 促 进 作 用 最 为 明 显 与 阴 性 对 照 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 %' 组 作 用 最 弱 与 阴 性 相 比 除 黑 素 细 胞 增 殖 外 其 他 指 标 差 异 均 具 有 统 计 学 意 义 表 表 明 ' %' 部 分 抑 制 了 %&'& 对 黑 素 细 胞 的 作 用 1 讨 论 尽 管 %&'& 已 广 泛 用 于 临 床 白 癜 风 的 治 疗 但 是 其 具 体 治 疗 机 制 还 不 完 全 清 楚 目 前 研 究 发 现 其 机 制 可 能 与 调 节 局 部 免 疫 促 进 黑 素 细 胞 增 殖 及 黑 素 的 合 成 促 进 细 胞 因 子 分 泌 有 关 本 研 究 通 过 观 察 %&'& 照 射 后 黑 素 细 胞 的 增 殖 黑 素 生 成 酪 氨 酸 酶 活 性 以 及 %' 的 表 达 情 况 探 讨 特 异 ' 5% 对 黑 素 细 胞 的 影 响 为 探 索 %&'& 治 疗 白 癜 风 的 机 制 提 供 实 验 依 据 实 验 结 果 表 明 %&'& 可 以 促 进 黑 素 细 胞 增 殖 及 黑 素 生 成 增 加 酪 氨 酸 酶 活 性 进 一 步 研 究 发 现 %&'& 还 可 以 下 调 %'!"#"!
$ 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版 第 卷 表 1 下 调 窄 谱 中 波 紫 外 线 对 黑 素 细 胞 的 作 用 *+%'5!'#;"7+###6#856%&'&5!#7+!5#8? %' 组 %' 抑 制 剂 组 % 阴 性 方 差 齐 性 检 验 ##!# 检 验 细 胞 增 殖 $?$?? $ 黑 素 生 成? $? $1? 1 酪 氨 酸 酶 活 性 $?$ 1?$?$ 1$ %' 组 与 %' 抑 制 剂 组 比 较 %' 组 与 % 阴 性 比 较 %' 抑 制 剂 组 与 % 阴 性 比 较 的 表 达 体 外 转 染 %' 模 拟 物 后 抑 制 了 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 的 生 成 和 酪 氨 酸 酶 活 性 而 转 染 %' 抑 制 剂 后 却 出 现 了 相 反 的 结 果 进 一 步 的 实 验 显 示 当 过 表 达 %' 后 显 著 降 低 了 %&'& 对 黑 素 细 胞 的 作 用 以 上 实 验 结 果 提 示 对 %' 表 达 的 调 控 可 能 是 %&'& 治 疗 白 癜 风 的 重 要 机 制 之 一 黑 素 细 胞 的 功 能 失 调 在 白 癜 风 的 发 病 过 程 中 起 着 至 关 重 要 的 作 用 但 是 其 具 体 的 致 病 机 制 目 前 仍 不 清 楚 我 们 在 研 究 %&'& 对 黑 素 细 胞 的 作 用 时 发 现 %&'& 可 以 抑 制 %' 的 表 达 这 与 (% 等 研 究 结 果 一 致 但 是 %' 的 具 体 作 用 仍 不 清 楚 对 此 我 们 观 察 了 %' 在 黑 素 细 胞 中 的 作 用 发 现 %' 可 以 抑 制 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 和 酪 氨 酸 酶 活 性 推 测 其 作 用 可 能 与 %&'& 治 疗 白 癜 风 有 关 进 一 步 的 研 究 证 实 了 我 们 的 猜 想 当 下 调 %' 表 达 后 显 著 增 强 了 %&' & 对 黑 素 细 胞 的 作 用 而 当 过 表 达 %' 后 部 分 抑 制 了 %&'& 的 作 用 表 明 %&'& 对 黑 素 细 胞 的 作 用 可 能 部 分 是 通 过 调 节 %' 的 表 达 实 现 的 小 眼 畸 形 相 关 转 录 因 子 )*< 是 黑 素 合 成 过 程 中 酪 氨 酸 酶 及 酪 氨 酸 酶 蛋 白 基 因 的 重 要 转 录 因 子 可 以 调 控 酪 氨 酸 酶 活 性 及 黑 素 的 生 成 此 外 )*< 还 参 与 黑 素 细 胞 凋 亡 调 控 它 通 过 促 进 下 游 抗 氧 化 基 因 的 表 达 清 除 细 胞 内 氧 自 由 基 保 护 黑 素 细 '$ 胞 免 受 破 坏 研 究 发 现 白 癜 风 皮 损 区 黑 素 细 胞 )*< 表 达 降 低 而 氧 化 应 激 是 )*< 降 低 的 主 要 原 $' 因 之 一 4- 等 研 究 发 现 氧 化 应 激 不 仅 可 以 使 白 癜 风 患 者 黑 素 细 胞 )*< 的 表 达 降 低 同 时 还 可 诱 导 %' 表 达 升 高 进 一 步 研 究 表 明 %' 可 以 直 接 结 合 于 )*< % 端 非 翻 译 区 * 阻 止 )*< 的 表 达 除 此 之 外 ' %' 还 可 间 接 破 坏 角 质 细 胞 旁 分 泌 减 少 干 细 胞 因 子 40< 和 碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 << 对 黑 素 细 胞 的 保 护 作 用 最 终 导 致 黑 素 细 胞 的 退 化 近 年 的 研 究 发 现 %&'& 可 能 通 过 消 除 白 癜 风 患 者 局 部 皮 损 的 氧 化 应 激 进 而 缓 解 病 情 其 作 用 机 制 可 能 是 %&'& 通 过 调 节 黑 素 细 胞 %' 间 接 调 控 )*< 及 其 下 游 抗 氧 化 基 因 的 表 达 以 及 促 进 角 质 细 胞 分 泌 40< 和 << 间 接 发 挥 作 用 尽 管 我 们 观 察 到 %&'& 及 %' 对 黑 素 细 胞 增 殖 黑 素 生 成 及 酪 氨 酸 酶 活 性 的 影 响 证 明 了 两 者 具 有 相 关 性 但 是 其 具 体 调 控 机 制 仍 然 未 知 特 别 是 %' 调 控 黑 素 细 胞 的 下 游 直 接 靶 点 及 %&'& 与 %' 是 否 直 接 相 关 这 些 仍 需 进 一 步 研 究 综 上 所 述 %&'& 可 能 通 过 下 调 %' 的 表 达 发 挥 其 对 白 癜 风 的 治 疗 作 用 同 时 本 文 也 为 白 癜 风 治 疗 方 法 的 研 究 及 %&'& 治 疗 白 癜 风 的 机 制 提 供 新 的 研 究 方 向 和 思 路 参 考 文 献.''+ %+' '2 $-/11* $& #)""0 &2(& 3.'$3/.'4&"# )(((#)",# (( '5)"#"# ()(,# #() ))"#(#(#() )) ")##((& +#"2(%& *''*!/+*6' %&)#( %"((&1#( 1 11$$& $ 董 妍 曾 维 惠 李 文 彬 等 & 他 克 莫 司 联 合 窄 谱 中 波 紫 外 线 对 黑 素 细 胞 黑 素 合 成 的 影 响 & 西 安 交 通 大 学 学 报 医 学 版 $& $/+6'-./' $!&(#*'+ #&+ *-2& -+*/4 *4$.'/6!*&."(#( (*'+"*'+&-$$& 6 6 2$/+ &!#*'+ "#!+*-$" )())#" )## #&#( ) * -(( 111& 下 转 第 $ 页!"#"!
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