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抄兑古
7 years ago
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1 第卷第期 " 年月 # 水 # 产 # 学 # 报 " " 文章编号 $ %& " $ "&' $ ' # '" $% "" 肉桂活性成分肉桂醛杀灭离体多子小瓜虫效果梁靖涵 # 张其中 # 付耀武 # 王 # 彬暨南大学水生生物研究所广东省高校水体富营养化与赤潮防治重点实验室 $ 热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心广东广州 #& % 摘要研究从肉桂中分离纯化出具有抑杀多子小瓜虫活性的化合物以乙醇为提取剂用索氏超声提取法从肉桂中提取浸膏再用石油醚乙酸乙酯甲醇为萃取剂萃取不同有效组分以不同浓度分别进行杀灭离体多子小瓜虫实验发现石油醚萃取物的杀虫效果最优然后对石油醚萃取物采用硅胶层析柱和制备型高效液相色谱进行分离纯化利用质谱和核磁波谱分析最终鉴定其杀虫活性成分为肉桂醛将肉桂醛溶于二甲基亚砜并用二倍梯度稀释法配成不同浓度的药液测试其对离体小瓜虫的杀灭活性结果表明 6 杀灭滋养体和感染性幼虫的剂量分别为 & 和 1 $ 半数有效浓度分别为和 1 $ 使用剂量在 & 1 $ 可完全抑制小瓜虫包囊孵化关键词肉桂醛分离鉴定杀虫活性多子小瓜虫中图分类号 "% "######## 文献标志码 ## 多子小瓜虫.# 属纤毛虫纲 1*)" 凹口科 "*1) 小瓜虫属.# 是淡水寄生纤毛原生动物其生活史分个阶段滋养体寄生阶段包囊离体繁殖阶段和感染性幼虫感染阶段 $ 该虫主要寄生在鱼鳃和皮肤上致使鱼体分泌大量粘液造成鱼呼吸困难同时寄生处上皮细胞增生出现许多小白点因此小瓜虫病又称白点病该病主要危害鱼苗和鱼种严重时可引起病鱼大批死亡造成严重经济损失过去常用的能有效防治多子小瓜虫病的药 " $% 物有汞制剂和孔雀石绿等但是由于这些化学药品的高毒和致癌致畸性在国际上已被明令禁用我国政府也禁用了这些化学制剂而目前预防多子小瓜虫病的疫苗还处在研发阶段 ' 所以安全高效的新型杀小瓜虫渔药的研制迫在眉睫在我国中草药治疗人畜疾病的历史悠久与化学合成药物相比具有毒副作用小安全性高残留少等诸多优点目前已经发现一些中草药植物粗提物具有抑杀多子小瓜虫的作用如辣椒 & #""% 青蒿 #""%%" 大蒜 - " 木瓜 &#. 和剌毛黧豆 +% ##"% 等的粗提物能杀灭离体多子小瓜虫甚至已经从五倍子 ) %"% 博落回 +". #* 和小果博落回 +". ## 中分离纯化出杀虫活性化合物这就为防治多子小瓜虫病开发新型安全环保杀虫剂提供了新思路和新途径肉桂 &%% %"+ 是我国卫生部公布的药食兼用植物材料在临床上具有镇痛 " 解痉解热抗菌抗肿瘤抗溃疡等作用 $& 已有研究表明肉桂提取物对真菌与尘螨具有杀灭作用 % 但是其能否杀灭多子小瓜虫还未见报道本实验以肉桂为材料分离纯化其杀小瓜虫活性化合物并对其抑杀效果进行研究 # 材料与方法肉桂肉桂购于广州市清平中药材市场产地广西收稿日期 &&&### 修回日期 && 资助项目国家高新技术研究发展计划八六三 % 广州市科技计划项目 " 广专项 & 通信作者张其中 &0)180"%- "' 广东省海洋渔业科技推

效组分以不同浓度分别进行杀灭离体多子小瓜虫实验发现石油醚萃取物的杀虫效果最优然后对石油醚萃取物采用硅胶层析柱和制备型高效液相色谱进行分离纯化利用质谱和核磁波谱分析最终鉴定其杀虫活性成分为肉桂醛将肉桂醛

2 ### "%% 水 # 产 # 学 # 报卷仪器与材料 1)/ 分析型高效液相色谱仪 1)/ 制备型高效液相色谱仪 +*+/+ " 3% 串联四极杆 $ 线性离子阱质谱仪 ") & 0&3& 型核磁共振仪 #" " 超纯水机实验用制备色谱柱为 - //;& 色谱柱 +& & 柱层析用硅胶目目购于青岛海洋化工厂实验中所用乙醇分析纯石油醚分析纯乙酸乙酯分析纯异丁醇分析纯甲醇分析纯色谱纯购于禹王化工试剂厂色谱级乙腈为 -) 公司产品甲醇 &" 为 1&"- 公司产品 ' 植物杀虫活性化合物分离鉴定肉桂 & 1 烘干粉碎每次用 &6 乙醇 & 在 ' > 水中超声提取重复次抽滤分离提取液合并滤液滤液在旋转蒸发仪中减压浓缩干燥将酒精提取物和水 4,6, 悬溶然后依次用石油醚乙酸乙酯和甲醇萃取将萃取物减压浓缩干燥用二甲基亚砜促溶配成药液对各萃取物做离体杀灭小瓜虫实验确定石油醚萃取物杀虫效果最好然后将石油醚萃取物经过硅胶层析柱用异丁醇异丁醇, 石油醚, 和石油醚种洗脱液洗脱获得 "" 和 " 段提取物各段提取物分别做杀虫活性实验发现 " 效果明显 " 经硅胶柱层析异丁醇石油醚,, 梯度反复洗脱次最终获得化合物化合物经高效液相色谱 % 分析并结合质谱和核磁波谱鉴定其结构和种类药液的配制称取各段萃取物各级洗脱物及活性化合物 & 1 用二甲基亚砜促溶加入 & 蒸馏水配成 % 1 $ 的药液用二倍梯度稀释法依次往下稀释至实验所需浓度以实验用最高浓度药液中二甲基亚砜的含量 6 为标准配制含 6 二甲基亚砜的对照组处理液同时设置只加蒸馏水的空白对照 + 多子小瓜虫的传代培养从广州花地湾花鸟鱼虫批发市场购买患多子小瓜虫病的金鱼将病鱼与健康无损伤体长为 ( - 体质量为 &' ( 1 的草鱼苗混养饲养在实验室 && -+&& -+&& - 的水族箱中温度控制在 " ( & > 每天每箱均更换 $" 经过曝气的自来水当草鱼体表及鳃上出现密集小白点时可收集小瓜虫供实验用在被感染草鱼用完之前投入新的健康个体传接多子小瓜虫杀灭小瓜虫滋养体感染性幼虫和抑制包囊孵化实验滋养体 ## 用吸管吸取经曝气的蒸馏水将寄生于草鱼体表及鳃中成熟的小瓜虫滋养体已经从白点中出来冲洗下来经几次漂洗去除粘液等杂质收集于培养皿中取 " 孔板各孔中加入约含个成熟滋养体的虫液并准确计数各孔滋养体数再分别加入不同浓度的药液使最终药物的浓度依次为 & && 和 1 $ 对照含 6 二甲基亚砜 1 $ 对照仅加蒸馏水各药物浓度个重复实验温度保持为 " ( & >" 倍显微镜下观察记录各孔虫体全部致死时间和 " 的死亡数包囊 # # 在 " 孔板中各孔中吸入约含个成熟小瓜虫滋养体的虫液显微镜下准确计数各孔滋养体数静置 % 待其形成包囊后计数各孔包囊数再分别加入不同浓度的药液使最终药物的浓度依次为 & & &% & 和 1 $ 对照含 6 二甲基亚砜 1 $ 对照仅加蒸馏水各药物浓度设个重复将 " 孔板于 " > 恒温培养箱中静置 % 接着在 " 倍显微镜下观察包囊孵化情况计数各孔孵化幼虫数具体方法为充分混匀幼虫液用移液器取幼虫液加入等体积福尔马林 6 固定幼虫放计数框内在 " + 物镜下计数幼虫数每孔计数 & 个样算平均数并最终计算平均每个包囊孵化的幼虫数平均每个包囊孵化的幼虫数各孔幼虫总数 $ 各孔包囊数幼虫 ## 将培养皿中收集到的成熟小瓜虫滋养体在 " > 恒温培养箱中静置直至孵化释放出感染性幼虫吸出幼虫充分混匀调整虫液浓度约只幼虫取样计数幼虫的平均浓度实验中记录幼虫数均为取样计数其平均浓度取 % 孔板各孔中加入的虫液在各孔中加入不同浓度的药液使最终药物浓度依次为 %"%" & 和 1 $ 对照含 6 二甲基亚砜 1 $ 对照仅加蒸馏水各药物浓度设个重复实验温度保持为 " ( & > 在 " + 物镜下记录不

烘干粉碎每次用 &6 乙醇 & 在 ' > 水中超声提取重复次抽滤分离提取液合并滤液滤液在旋转蒸发仪中减压浓缩干燥将酒精提取物和水 4,6, 悬溶然后依次用石油醚乙酸乙酯和甲醇萃取将萃取物减压浓缩干燥用二甲基亚砜促溶配成药

3 期梁靖涵等肉桂活性成分肉桂醛杀灭离体多子小瓜虫效果 ## "%' 同药物浓度中幼虫的致死时间和 I 各孔的死亡数死亡数实验初始幼虫数 $" 各孔存活幼虫数 3 虫体死亡标准每次杀虫实验观察记录以 " 为限 ' 成虫胞质停止流动纤毛停止摆动表示虫体死亡包囊在加药后 " 内未分裂表明包囊死亡幼虫停止游动其纤毛不动或仅微微摆动在药液中 ' 很快变圆或裂解说明幼虫死亡 $ 4 数据处理用 2- 软件计算平均致死率平均每个包囊孵化幼虫数及标准差 (# 用 %% 软件对数据进行统计学处理分析不同剂量浓度实验结果的显著性差异及计算半数有效浓度 & # 结果石油醚甲醇乙酸乙酯萃取物杀虫活性比较以 " 为限观察个萃取组分对多子小瓜虫滋养体和感染性幼虫的杀灭活性结果显示石油醚萃取物的杀虫活性最好乙酸乙酯萃取物次之甲醇萃取物的活性最差 1 $ 时各萃取物中滋养体在 ' ) 内全部死亡当药物浓度在 & 1 $ 时只有石油醚萃取物在 " 内全部杀死小瓜虫滋养体在杀感染性幼虫实验中药物处理浓度在和 % 1 $ 时 " 后乙酸乙酯和甲醇萃取物处理组均有幼虫存活只有石油醚萃取物能全部杀死幼虫且致死时间分别为 ' 和 ' ) 表表肉桂石油醚乙酸乙酯甲醇萃取物杀灭多子小瓜虫的致死时间 % 比较 0$.0$.#%#".05..#" &%..#/0#%.%.0#%.#"32 萃取物 2/"-/ 滋养体实验药物浓度 $ 1 $ -)-)/"/)+,")1 /")/+ & & 幼虫实验药物浓度 $ 1 $ -)-)/"/)+,")1 /")/+ %" % 石油醚 /". /" ( & ( ( * " ( % (& ' (& ' (& 乙酸乙酯 /*-// "% ( %& ( * * "' ( &% (% * * 甲醇 /) ' ( * * * % ( % * * * 注 * 代表 " 小时内虫体没有全部死亡表和表中的注释与此相同 /+ * ""+)/+2+/)-,:/")/+"/")/+,/"" 2+."3)/) /+ ) +/++/+) 石油醚萃取物的 ' 种洗脱成分的杀虫活性比较石油醚萃取物经过硅胶层析柱用异丁醇异丁醇, 石油醚, 和石油醚种洗脱液洗脱所获得的 "" 和 " 段提取物以 " 为限观察其对多子小瓜虫滋养体和感染性幼虫的杀灭活性结果显示 " 的杀虫活性最好 & 1 $ 的 " 可全部杀死滋养体而 1 $ 的 "" 作用 " 仍有滋养体存活在抑杀感染性幼虫实验中 % 1 $ 的 " 能在 ) 内全部杀死感染性幼虫而同样浓度的 "" 处理相同时间仍有幼虫存活表表异丁醇, 异丁醇 B 石油醚 B, 和石油醚,' 提取物杀灭全部多子小瓜虫的致死时间 % 0$.0$.#%#".05.."# /.#$.0".#% &%..#/0#%.%.0#%.#"32 提取物 2/"-/ 滋养体实验药物浓度 $ 1 $ -)-)/"/)+,")1 /")/+ & & 幼虫实验药物浓度 $ 1 $ -)-)/"/)+,")1 /")/+ %" % " 异丁醇 +./) " (' * * * "" (& (% * * " 异丁醇, 石油醚, ' & (" * * * ( '& (%% %' ('% * +./)/". /", " 石油醚 /". /" " ( ' (% &' (" * ' ( ( &"& (& '" ( ' 肉桂醛的分离纯化及鉴定对石油醚萃取物经过硅胶层析柱和制备型高效液相色谱仪分离提纯最终获得纯度达到 6 的化合物呈黄色粘稠状液体 & $0 * * && * * & * " * ' * * $ $

件对数据进行统计学处理分析不同剂量浓度实验结果的显著性差异及计算半数有效浓度 & # 结果石油醚甲醇乙酸乙酯萃取物杀虫活性比较以 " 为限观察个萃取组分对多子小瓜虫滋养体和感染性幼虫的杀灭活性结果显示石油醚萃取

4 ### "% 水 # 产 # 学 # 报卷 %' * $ '' * $ ' $ $ 推断其相对分子质量为结合其 & & 确定分子式为 & & 0 # "' & & &% & " &" &% & & & & & 0 # %& '' 0 & '%% 0& '&' 0 && ' '" 0 &% & ' % ' 0 &' %" % 0& 经鉴定化合物为肉桂醛图不同浓度肉桂醛杀灭多子小瓜虫滋养体幼虫的致死时间和致死率剂量 & 或 1 $ 的肉桂醛药液能在 ) 内杀死全部滋养体 1 $ 的肉桂醛能在 & ) 内杀死全部滋养体浓度 & 1 $ 处理 " 对小瓜虫滋养体的致死率为 &6 在杀灭感染性幼虫实验中 1 $ 以上浓度可在 " 内将幼虫全部杀死 " 1 $ 在 " 内对幼虫的致死率为 6 浓度在 1 $ 以下时随着浓度降低杀灭效果下降表图肉桂醛分子结构式,&..#"%%$0 表 ' 不同浓度肉桂醛杀灭多子小瓜虫滋养体幼虫的致死时间和致死率 '.0$.#%%.#"2# #%%..#%#"%%$0 &%..#/0#%.%.0#%.% 05/# 浓度 $ 1 $ -)-)/"/) 滋养体实验 /"/)1 /")//" 全部致死时间 $) " 致死率 $6 /."/) " &"//* 浓度 $ 1 $ -)-)/"/) 幼虫实验 /"/)1 /")//" 全部致死时间 $) " 致死率 $6 /."/) " &"//* # * ( # * ( 6# * ( 6# * ( & * " (%' & * % (& & * & (& - * " (% - & ( * &&& (& (' " * ( " (" - " ( % '" (% (" - %" & (% ( % 注同一列中标有不相同字母的值表示差异显著 ' & # 表示空白对照组为蒸馏水 6 # 表示对照组为含 6 的二甲基亚砜溶液表 & 的注释与此相同 /+.+9/,")/+."+-"/+) /+-.) "+1),-)/*,")/ ' & ) -)/"1". ++/ 9/" # )*)/"-)/"1". -)/)+ 6 /*+.,2 # 3)/) /& +/++/+) + 肉桂醛对小瓜虫滋养体和幼虫的半数有效浓度用概率单位法 %% 计算肉桂醛对小瓜虫滋养体和感染性幼虫的半数有效浓度 & 分别为和 1 $ 表 " 不同浓度肉桂醛抑制小瓜虫包囊孵化活性 & 1 $ 以上浓度的肉桂醛可完全抑制小瓜虫包囊孵化杀灭包囊内虫体 & 1 $ 肉桂醛处理后平均每个包囊仅孵出 " (%% 只幼虫处理浓度为 %& 1 $ 时平均每个包囊孵化 '& ( 只幼虫均显著低于对照组表 & # 讨论本实验采用的研究路线是从肉桂的各个萃取

幼虫实验中 1 $ 以上浓度可在 " 内将幼虫全部杀死 " 1 $ 在 " 内对幼虫的致死率为 6 浓度在 1 $ 以下时随着浓度降低杀灭效果下降表图肉桂醛分子结构式,&.

5 期梁靖涵等肉桂活性成分肉桂醛杀灭离体多子小瓜虫效果 ## "% 表肉桂醛对多子小瓜虫滋养体和幼虫的半数有效浓度 $"".2#%%..#% * +7 #" %%$0&%.32.#/0#%..0#%. &6 置信区间 $ 半数有效浓度 $ 类别 1 $ 1 $ /+ &6 -),)- & )/":+ 肉桂醛杀小瓜虫滋养体 1)+//")/+ & 肉桂醛杀小瓜虫幼虫 1)+//")/+ & 表 + 不同浓度肉桂醛抑制小瓜虫包囊孵化活性平均值 = 标准差 +%% #".0#%./# 2 %..##%...0"%. #%%..#%#"%%$0 %= 平均每个包囊孵化幼虫数 $ 只肉桂醛浓度 $ 1 $ ) ).",/")/+ -))*-)-)/"/)+ "+ "/)/ # %" (%' 6# %&& ( % & '& ( & % ( - & " (%% & 部位进行杀虫活性测试筛选活性强的萃取部位指向性地分离纯化杀虫活性化合物通过这种杀虫活性追踪的方法逐步分离提纯活性化合物并鉴定其种类在个萃取部位中石油醚萃取物活性明显优于乙酸乙酯和甲醇萃取物的活性说明肉桂抑杀多子小瓜虫的活性成分主要集中在石油醚萃取物中故对石油醚萃取物进一步分离提纯最后获得化合物经质谱和核磁分析确定该化合物为肉桂醛并且通过活性测试结果显示杀虫效果较初提物显著提高确定肉桂醛为抑杀多子小瓜虫的活性物质肉桂醛对小瓜虫滋养体成虫感染性幼虫包囊的抑杀效果与药物浓度呈正相关浓度越高杀虫效果越好同时小瓜虫生活史各阶段虫体对肉桂醛的敏感度不同寄生的滋养体阶段比感染性幼虫阶段难杀灭全部杀灭感染性幼虫的最低有效浓度为 1 $ 但是全部杀死滋养体的浓度需要达到 & 1 $ 这种现象与现有的同类研究结果类似 $ 本研究显示 & 1 $ 浓度的肉桂醛可完全杀死包囊内幼虫最终无感染性幼虫孵出低于该浓度尽管不能全部杀灭所有包囊但是能显著降低平均每个包囊孵化的幼虫数因此肉桂醛浓度在 & 1 $ 时能中断小瓜虫的生活史起到防治小瓜虫病的作用在石油醚萃取物活性测试中发现在 & 1 $ 时 " 内可将滋养体全部杀死 1 $ 时内致死率达 6 其效果与大蒜提取物杀灭离体多子小瓜虫相当 " 而明显低于热带植物剌毛黧豆的叶粗提液 & 1 $ 和木瓜种子粗提物 1 $ 完全杀灭多子小瓜虫的剂量苦豆子 # "#*" 的甲醇提取物浓度在 " % 1 $ 时作用时间多子小瓜虫的致死率为 '6 6 浓度在 1 $ 时才达到 6 可见肉桂的石油醚萃取物杀虫效果更好从博落回叶的氯仿萃取物分离纯化出的血根碱与肉桂醛相比表现出更强的抗小瓜虫活性 6 杀死各阶段虫体的药物浓度为 ' 1 $ 但是从粗提物杀虫活性来看肉桂石油醚萃取物 & 1 $ 的杀虫效果要优于博落回氯仿萃取物 ' 1 $ 推测肉桂石油醚萃取物中还含有其他杀小瓜虫活性化合物或者肉桂醛含量较高而从小果博落回叶的氯仿粗提物分离纯化出来的二氢血根碱 & & 1 $ 和二氢白屈菜红碱 & " 1 $ 的半有效浓度比肉桂醛 & "' 1 $ 的低但是肉桂醛杀小瓜虫滋养体的半有效浓度只有从五倍子中分离的五没食子酰葡萄糖的该值 & & 的一半说明肉桂醛杀小瓜虫效果较好本研究证实了肉桂中的肉桂醛是杀灭多子小瓜虫的活性物质对小瓜虫滋养体包囊和感染性幼虫都具有较强杀灭作用肉桂醛用于防治小瓜虫病与传统的化学药物相比可以克服残留毒副作用污染环境等缺点具有开发天然绿色环保型渔药的潜在价值同时我国是肉桂的生产大国肉桂资源相当丰富所以肉桂醛在新型环保渔药的开发和应用方面具有广阔前景参考文献 #9))+ )* "0 #,")-+) :".)-/9) /9 +"/*+,.# #+++,8./- "1)++ %% $ ' $

.##%...0"%. #%%..#%#"%%$0 %= 平均每个包囊孵化幼虫数 $ 只肉桂醛浓度 $ 1 $ ) ).

6 ### "' 水 # 产 # 学 # 报卷 ##-"+).# %/" "/+ %"+/+%/1* ) %"/-/)2,"+"%.+)1 && $' # /9+.#.8./ ) -/*/"++) "+9/"3+/+ :)-+) %"+/1* &&& $" " #.-)) 4 )+) % 4".+4 #,-/+, +. "-")/ ) 1"- 2/"-/ ).#/")/+) /-*+/+% -# 2")/+ "/ "-)."), 8.-./." %& $" & #3 -/ " :./), /")/:+ / -/ 1") 2/ + /"./)/,-/*/"++) ")9 /"./ (%#.%. -/*1* $" ' $" % #/".+# ",),--*, /++. ")1)/) /"/)1 -/*/"++) -)) -/,+."),8./-)/ " "& $" ' #')1 ') #. %%"/-/:.)/*,,+ 1)+/.# ),-/) ).- * #,")/3")/--) %""/)+."),/" 8.-./." -/* " " &% $&%% #) # ')1 '2")/+,".1+/,"& :)1 "+/+,.# "+9/"+"+ && $ 陈达丽张其中杀灭离体小瓜虫的药物试验淡水渔业 && $ # ")"* +/.* ) / /"./-,-/,"/+)) ).# ++ ))1 +"+ & 雷曼红青蒿素对小瓜虫病治疗作用初探齐鲁渔业 & #) %04+"0,-/+, -".2/"-/+,+% ##"% - ) &#. "-- 1)+// "/0),+ "+/.# %"+/1* +"- "& % $%% #')1 ;. # 4+.+% :./),) )/"+/- -.) 2/"-/," ) %"% 1)+/,+ "+/.# /")"* %"+/1* $ "& $& #5 5 ) 5 ; "0,-/, +)1.)")," /:+,+". #* 1)+/.# ) 1"++ -" &"%#.%*% *" %"+/1* +"- '& & $ " #5 5'. ' ;"0)/"+/-,--*,*"+)1.)")) *"-"*/")," +". ## 1)+/.# ) "-+) # # /")"* %"+/1* $ $ "#')1 '5) ' %. ")/+//.+) "1"++, "+"- ) /-/),-))) ") -)</ ' & $% 曾正渝兰作平肉桂的研究现状及应用进展现代医药卫生 ' & $% &##)1 + ) "-1- -/), -))) --)-)) %)/ "% " 董万超肉桂的利用及药理作用特种经济动植物 "% " %#.. '"-"--/:/*, /"-/+ 1)+/ "/1+,") )+."),')++ & %" $%' 李静吴海强刘志刚等肉桂提取物对粉尘螨杀灭的实验研究中国人兽共患病学报 & %" $%' '#')1 '')1 ') #"),.)-, 9/"/"/.") /-/* ) -/:/* 9",/")/,.# -1- -)- % $ 张其中张占会陈达丽等水温对多子小瓜虫孵化及幼虫活力的影响生态科学 % $ #. ')1 '.,-/,/9)/* )+ "-)+ ) )1 /")/+ -*+/+ ) /")/+,.#% -# "+9/"+"+ " && $%? 超张其中罗芬种中草药杀灭离体小瓜虫的药效研究淡水渔业 " && $% #55.. ; )1 "0)/"/0 -/:/*,-))/+1)+/.# ) 1,+ &# # %"+/1* +"- " '' $''

7 期梁靖涵等肉桂活性成分肉桂醛杀灭离体多子小瓜虫效果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《钢铁是怎样炼成的》（下）

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