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中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 213 年 9 月 2587 龙 骨 马 尾 杉 PcFPS1 基 因 克 隆 及 序 列 分 析 药 材 与 资 源 张 鑫 1, 罗 红 梅 1, 殷 秀 梅 2, 宋 经 元 1* 1. 中 国 医 学 科 学 院 北 京 协 和 医 学 院 药 用 植 物 研 究 所 濒 危 药 材 繁 育 国 家 工 程 实 验 室, 北 京 1193 2. 西 南 大 学 园 艺 园 林 学 院, 重 庆 4716 摘 要 : 目 的 对 龙 骨 马 尾 杉 Phlegmariurus carinatus 法 呢 二 磷 酸 合 成 酶 (Farnesyl diphosphate synthase,fps) 基 因 PcFPS1 编 码 区 进 行 克 隆 及 序 列 分 析 方 法 根 据 已 获 得 的 龙 骨 马 尾 杉 转 录 组 数 据, 从 中 获 得 1 条 编 码 FPS 的 转 录 本, 采 用 RT-PCR 方 法 获 得 PcFPS1 的 编 码 区 序 列, 并 对 PcFPS1 蛋 白 进 行 理 化 性 质 蛋 白 二 级 结 构 及 三 维 结 构 预 测 分 析 结 果 序 列 分 析 表 明, 所 克 隆 的 PcFPS1 基 因 编 码 区 长 为 1 119 bp, 编 码 372 个 氨 基 酸 残 基,PcFPS1 与 挪 威 云 杉 Picea abies 的 FPS 具 有 7% 的 序 列 相 似 性 生 物 信 息 学 预 测 PcFPS1 蛋 白 基 本 不 含 跨 膜 区, 具 有 萜 类 合 酶 保 守 结 构 域, 不 含 信 号 肽 结 论 首 次 获 得 龙 骨 马 尾 杉 PcFPS1 基 因 的 编 码 区 序 列, 为 进 一 步 研 究 PcFPS1 在 石 杉 科 植 物 萜 类 及 甾 醇 类 化 合 物 生 物 合 成 途 径 中 的 功 能 及 鉴 定 酶 活 性 位 点 奠 定 基 础 关 键 词 : 法 呢 二 磷 酸 合 成 酶 ; 龙 骨 马 尾 杉 ; 次 生 代 谢 ; 三 萜 ; 克 隆 中 图 分 类 号 :R282.12 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :253-267(213)18-2587 - 6 DOI: 1.751/j.issn.253-267.213.18.2 Cloning and sequence analysis of PcFPS1 gene in Phlegmariurus carinatus ZHANG Xin 1, LUO Hong-mei 1, YIN Xiu-mei 2, SONG Jing-yuan 1 1. National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 1193, China 2. College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 4716, China Abstract: Objective To clone and analyze the coding region of Farnesyl diphosphate synthase (FPS) gene PcFPS1 from Phlegmariurus carinatus. Methods According to the acquired transcriptome dataset of P. carinatus, one transcript coding FPS was obtained. The coding region sequence was obtained using RT-PCR method, and the physicochemical properties, protein secondary structure, and three-dimensional structure of PcFPS1 protein were predictively analyzed. Results The cloned PcFPS1 gene contained a 1 119-bp coding region for encoding a predicted protein of 372 amino acids with high homology (7%) to FPS gene in Picea abies. PcFPS1 contained almost no transmembrane region and had the conserved domain of terpenoid cylases, without signal peptide. Conclusion This study clones and analyzes the FPS gene from P. carinatus which is obtained for the first time. The results will provide a foundation for exploring the function of PcFPS1 in terpene and sterol biosynthesis of plants in Huperziaceae. Key words: farnesyl diphosphate synthase; Phlegmariurus carinatus (Desv.) Ching; secondary metabolism; triterpenoid; cloning 龙 骨 马 尾 杉 Phlegmariurus carinatus (Desv.) Ching 为 石 杉 科 (Huperziaceae ) 马 尾 杉 属 Phlegmariurus Holub. 植 物, 又 称 龙 骨 石 松 大 千 金 草 大 伸 筋 草 裤 带 藤 等, 始 载 于 云 南 植 物 研 究, 主 要 分 布 于 热 带 地 区, 多 年 生 常 绿 草 本, 丛 生, 外 形 犹 如 马 尾 龙 骨 马 尾 杉 营 养 叶 与 孢 子 叶 异 型, 附 生 植 物, 叶 无 主 肋 全 缘, 孢 子 叶 类 似 营 养 叶, 叶 线 性 或 披 针 形, 叶 紧 贴 于 茎, 披 针 形 [1] 其 化 学 成 分 主 要 为 石 松 生 物 碱 及 萜 类, 全 草 入 药 从 其 同 科 植 物 蛇 足 石 杉 中 分 离 得 到 的 石 杉 碱 甲 (HupA) 被 临 收 稿 日 期 :213-5-11 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 基 于 宏 量 ESTs 的 蛇 足 石 杉 转 录 组 分 析 及 石 杉 碱 甲 合 成 酶 (HAS) 的 鉴 定 研 究 (39113);211 年 度 教 育 部 长 江 学 者 和 创 新 团 队 发 展 计 划 (IRT115) 作 者 简 介 : 张 鑫 (199 ), 男, 浙 江 温 州 人, 硕 士 研 究 生, 主 要 从 事 药 用 植 物 分 子 生 物 学 的 研 究 E-mail: 37573624@qq.com * 通 信 作 者 宋 经 元, 教 授, 博 士, 中 国 医 学 科 学 院 北 京 协 和 医 学 院 药 用 植 物 研 究 所 药 用 植 物 鉴 定 研 究 中 心 副 主 任, 主 要 研 究 方 向 为 中 药 资 源 学 E-mail: jysong@implad.ac.cn

2588 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 213 年 9 月 床 证 明 是 一 种 高 效 高 选 择 性 的 中 枢 乙 酰 胆 碱 酯 酶 抑 制 剂, 具 有 治 疗 多 种 神 经 退 行 性 疾 病 的 潜 在 作 用 [2] 目 前 HupA 已 研 制 成 新 药 用 于 临 床 治 疗 重 症 肌 无 力 轻 度 老 年 痴 呆 症 等 疾 病 [2] 另 有 研 究 表 明, 龙 骨 马 尾 杉 中 HupA 的 量 高 于 包 括 蛇 足 石 杉 在 内 的 石 杉 科 其 他 植 物 [3] [4-5] Luo 等 报 道 了 通 过 罗 氏 454 高 通 量 测 序 方 法 获 得 了 野 生 龙 骨 马 尾 杉 蛇 足 石 杉 的 转 录 组 信 息, 并 对 其 中 三 萜 黄 酮 生 物 碱 合 成 相 关 基 因 及 SSR 进 行 了 大 量 发 掘 目 前, 已 分 别 从 蛇 足 石 杉 长 柄 石 杉 Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev. var. longipetiolata (Spring) H. M. Chang 中 分 离 鉴 定 了 32 个 石 松 三 萜 [6-9],7 个 serratene 型 三 萜 [1], 且 此 类 三 萜 为 结 构 特 殊 的 五 环 三 萜, 具 有 潜 在 药 用 价 值 萜 类 是 自 然 界 中 种 类 最 多 结 构 多 样 的 一 类 天 然 产 物 [11], 主 要 从 植 物 中 分 离 获 得 萜 类 化 合 物 不 仅 参 与 植 物 的 生 长 发 育 环 境 应 答 等 生 理 过 程, 而 且 还 广 泛 应 用 于 医 药 化 工 等 领 域 目 前, 萜 类 化 合 物 的 生 物 合 成 途 径 已 基 本 阐 明 在 植 物 中, 萜 类 化 合 物 与 甾 醇 类 化 合 物 的 生 物 合 成 共 享 甲 羟 戊 酸 代 谢 途 径 (mevalonic acid metabolic pathway) [12] 首 先, 甲 羟 戊 酸 (mevalonic acid, MVA) 生 成 的 异 戊 烯 二 磷 酸 (isopentenyl pyrophosphate, IPP) 在 香 草 二 磷 酸 合 成 酶 (geranyl pyrophosphate synthase, GPS) 作 用 下 形 成 香 叶 二 磷 酸 (geranyl diphosphate, GPP),GPP 由 法 呢 二 磷 酸 合 成 酶 (FPS) 催 化 形 成 法 呢 二 磷 酸 (farnesyl pyrophosphate, FPP),FPP 又 在 鲨 烯 合 成 酶 (squalene synthase,ss) 的 作 用 下 合 成 鲨 烯 (squalene), 后 者 经 鲨 烯 环 氧 酶 (squalene epoxidase,se) 催 化 转 变 为 2, 3- 氧 化 鲨 烯 (2, 3-oxidosqualene) [13] 2, 3- 氧 化 鲨 烯 经 环 氧 角 鲨 烯 环 化 酶 (oxidosqualene cyclase,osc) 催 化 后 环 化 形 成 多 种 结 构 功 能 各 异 的 植 物 甾 醇 和 三 萜 类 骨 架 [14] 其 中,FPS 被 认 为 是 异 戊 二 烯 生 物 合 成 途 径 中 的 一 个 关 键 酶, 催 化 两 分 子 IPP 和 二 甲 基 烯 丙 基 二 磷 酸 三 铵 盐 (DMAPP) 头 尾 相 接 缩 合 为 FPP, 继 而 形 成 萜 类 化 合 物 FPS 基 因 已 经 在 青 钱 柳 Cyclocarya paliurus (Batal.) Hjinskaja [15] 三 七 Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen [16] 柴 胡 Bupleurum chinense DC. [17] 等 植 物 中 得 到 克 隆, 并 得 到 功 能 验 证 根 据 参 与 萜 类 生 物 合 成 的 不 同 阶 段, 可 将 相 关 酶 分 为 前 期 中 期 后 期 酶,FPS 作 为 中 期 酶, 且 作 用 机 制 相 对 简 单, 对 于 研 究 萜 类 化 合 物 的 合 成 有 重 要 的 意 义 [17-18] 目 前, 对 于 龙 骨 马 尾 杉 中 萜 类 甾 醇 类 生 物 合 成 关 键 酶 的 研 究 甚 少, 未 有 文 献 对 龙 骨 马 尾 杉 中 的 FPS 基 因 进 行 报 道 本 研 究 基 于 课 题 组 前 期 得 到 的 龙 骨 马 尾 杉 大 量 的 转 录 组 数 据 [4-5], 从 中 发 掘 了 FPS 的 转 录 本, 利 用 RT-PCR 方 法 扩 增 获 得 FPS 基 因 PcFPS1 的 全 长 cdna 序 列, 并 运 用 相 应 的 生 物 信 息 学 方 法 预 测 了 PcFPS1 蛋 白 的 结 构 及 功 能 位 点, 为 鉴 定 PcFPS1 蛋 白 功 能 研 究 龙 骨 马 尾 杉 萜 类 及 甾 醇 类 化 合 物 的 生 物 合 成 分 子 机 制 奠 定 基 础 1 材 料 试 剂 及 仪 器 1.1 材 料 龙 骨 马 尾 杉 Phlegmariurus carinatus (Desv.) Ching 全 草, 采 自 海 南 省 霸 王 岭 自 然 保 护 区 ( 海 拔 1 32 m,19 1 E,19 7 N); 株 高 为 1~12 cm, 由 中 国 医 学 院 药 用 植 物 研 究 所 林 余 霖 研 究 员 鉴 定 为 龙 骨 马 尾 杉 采 集 后 用 清 水 冲 洗 5~8 次, 然 后 用 吸 水 纸 轻 轻 吸 去 水 分, 立 刻 置 于 液 氮 速 冻, 8 保 存 备 用 大 肠 杆 菌 trans5a 感 受 态 购 于 北 京 全 式 金 生 物 科 技 有 限 公 司 1.2 试 剂 植 物 多 糖 多 酚 核 糖 核 酸 (RNA) 提 取 试 剂 盒 购 于 百 泰 克 生 物 公 司 PrimeScript 反 转 录 试 剂 盒 Pyrobest 高 保 真 酶 pmd19-t vector 均 为 日 本 宝 生 物 公 司 产 品 多 聚 酶 链 式 反 应 (PCR) 产 物 胶 回 收 试 剂 盒 购 于 天 根 生 物 公 司 本 研 究 所 用 引 物 均 由 北 京 诺 赛 基 因 组 研 究 中 心 有 限 公 司 合 成 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 试 剂 1.3 仪 器 恒 温 水 浴 槽 ( 北 京 精 科 华 瑞 仪 器 有 限 公 司 ); 培 养 箱 ( 北 京 议 嘉 林 科 技 有 限 公 司 );PCR 扩 增 仪 (ABI 96); 8 超 低 温 冰 箱 (Thermo);3K3 高 速 冷 冻 离 心 机 (Sigma); 凝 胶 成 像 系 统 ( 美 国 伯 乐 ); 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 (Nanodrop 2, 美 国 ); 制 冰 机 (Scotsman);Sigma 1 14 小 型 台 式 高 速 离 心 机 (Sigma); 移 液 器 (Gilson); 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 (Sanyo); DYY 8C 型 电 泳 仪 ( 北 京 六 一 电 泳 厂 ) 2 方 法 2.1 RNA 的 提 取 取 龙 骨 马 尾 杉 样 品, 用 清 水 清 洗 干 净 并 擦 去 表 面 水 分, 迅 速 在 液 氮 中 研 磨, 依 据 百 泰 克 生 物 公 司 的 植 物 多 糖 多 酚 RNA 提 取 试 剂 盒 的 操 作 步 骤 提 取 龙 骨 马 尾 杉 总 RNA, 利 用 Nanodrop 2 进 行 测 定 以 及 1% 的 琼 脂 糖 电 泳 检 测 RNA 完 整 性 2.2 cdna 的 合 成 利 用 无 RNA 酶 的 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 (DNase I)

中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 213 年 9 月 2589 对 提 取 的 RNA 进 行 处 理, 去 除 提 取 物 中 所 含 的 DNA 并 进 行 纯 化 再 利 用 TaKaRa 公 司 的 PrimeScript 反 转 录 酶, 按 照 该 试 剂 盒 提 供 的 反 应 条 件 和 步 骤 进 行 实 验 操 作, 将 RNA 反 转 录 成 第 一 链 互 补 链 DNA (cdna), 得 到 的 cdna 溶 液 用 于 PCR 扩 增 2.3 PcFPS1 基 因 的 扩 增 及 测 序 以 龙 骨 马 尾 杉 的 cdna 为 模 板, 以 5 -ATGGGAACTTTGCAGCATCAG-3 为 上 游 引 物, 5 -CTACTTATGTCGCTTGTAGATT-3 为 下 游 引 物 PCR 反 应 体 系 为 cdna μl;pyrobest 酶.2 μl; 1 μmol 引 物 (F/R) μl;2.5 mmol/l dntp 1.5 μl; 1 Pyrobest 缓 冲 液 3. μl;ddh 2 O 22.3 μl; 对 龙 骨 马 尾 杉 的 PcFPS1 基 因 进 行 扩 增 反 应 程 序 :94 预 变 性 3 min, 然 后 进 行 3 个 循 环,94 3 s,58 3 s,72 1.5 min, 循 环 结 束 后 72 7 min 延 伸 反 应,1 保 温 1% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 PCR 产 物, 对 扩 增 所 得 目 的 片 段 进 行 切 胶 回 收 将 回 收 产 物 与 pmd19-t 载 体 连 接, 转 化 trans5a 菌 株, 在 含 有 氨 苄 的 LB 平 板 上 进 行 培 养, 挑 取 单 克 隆 经 菌 落 PCR 扩 增 和 电 泳 检 测 后 选 择 阳 性 克 隆 送 公 司 测 序 2.4 PcFPS1 生 物 信 息 学 分 析 按 相 关 软 件 ( 表 1) 对 PcFPS1 基 因 编 码 蛋 白 的 理 化 性 质 结 构 域 二 级 结 构 分 泌 蛋 白 定 位 信 号 跨 膜 区 和 结 构 域 进 行 预 测 和 分 析, 并 建 立 该 蛋 白 的 三 维 模 型 氨 基 酸 序 列 比 对 利 用 美 国 国 立 生 物 技 术 信 息 中 心 (NCBI) 的 蛋 白 质 序 列 数 据 库 进 行, 再 通 过 MEGA 5 构 建 Neighbor-joining 系 统 进 化 树 表 1 生 物 信 息 学 分 析 软 件 Table 1 Bioinformatic analysis software 作 用 软 件 网 址 理 化 性 质 ExPASy Proteomics http://www.expasy.ch/tools/pr 蛋 白 质 结 ExPASy PROSITE http://www.expasy.ch/prosite/ h l 构 域 和 NCBI 在 线 工 具 蛋 白 质 二 SWISS-MODEL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 级 结 构 Structure/cdd/wrpsb.cgi 蛋 白 质 三 SWISS-MODEL http://swissmodel.expasy.org/ 维 建 模 分 泌 蛋 白 Signal P4. Server http://swissmodel.expasy.org/ 蛋 白 定 位 WOLF PSORT http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/ 信 号 跨 膜 区 TMHMM Server v.2. http://wolfpsort.org/ 氨 基 酸 序 MEGA 5 http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/ 列 比 对 3 结 果 与 分 析 3.1 龙 骨 马 尾 杉 PcFPS1 基 因 的 克 隆 通 过 搜 索 龙 骨 马 尾 杉 高 通 量 转 录 组 数 据 [4-5], 从 中 发 现 一 个 转 录 本 (contig459) 被 注 释 为 FPS 基 因 经 分 析, 发 现 该 转 录 本 具 有 一 个 完 整 的 开 放 阅 读 框 (open reading frame,orf) 根 据 该 ORF 的 序 列 设 计 基 因 的 全 长 扩 增 引 物 (PcFPS1-F 和 PcFPS1-R), 以 龙 骨 马 尾 杉 全 草 RNA 反 转 录 得 到 的 cdna 为 模 板, 利 用 PCR 技 术 扩 增 获 得 一 条 长 为 1 119 bp 的 序 列, 对 所 扩 增 基 因 命 名 为 PcFPS1, 并 将 核 酸 序 列 提 交 到 NCBI ( GenBank 登 录 号 为 JX2751), 见 图 1 M PcFPS1 2 bp 1 bp 75bp 5bp 25bp 1bp 图 1 PcFPS1 基 因 的 克 隆 Fig. 1 Cloning of PcFPS1 gene 3.2 PcFPS1 基 因 编 码 蛋 白 特 性 分 析 3.2.1 理 化 性 质 分 析 利 用 ExPASy Proteomics Server 的 在 线 软 件 Protparam 对 PcFPS1 基 因 编 码 蛋 白 质 的 理 化 性 质 进 行 预 测, 结 果 显 示 PcFPS1 编 码 372 个 氨 基 酸, 分 子 式 为 C 1916 H 2998 N 498 O 576 S 13, 相 对 分 子 质 量 42 642.6 等 电 点 (pi)5.31, 带 正 电 残 基 (Arg+Lys) 为 45, 带 负 电 残 基 (Asp+Glu) 为 55 该 蛋 白 的 不 稳 定 系 数 (instability coefficient) 为 41.72, 说 明 PcFPS1 不 稳 定 脂 肪 系 数 (aliphatic coefficient) 为 92.23, 亲 水 性 系 数 (grand average of hydropathicity,gravy) 为.336 3.2.2 PcFPS1 二 级 结 构 分 析 及 结 构 域 预 测 采 用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/) 进 行 蛋 白 质 二 级 结 构 分 析 和 结 构 域 的 三 维 建 模 发 现 其 二 级 结 构 中 α- 螺 旋 占 6.75%,β- 折 叠 占 2.42%, 无 规 则 卷 曲 占 36.83% ( 图 2 ) InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/tools/pfa/iprscan/) 的 保 守 结 构 域 在 线 预 测 结 果 表 明 :PcFPS1 含 有 2 种 保 守 结 构 域, 分 别 是 聚 戊 烯 基 酶 (polyprenyl synthethase, IPR92 ) 萜 类 合 酶 (terpenoid synthase, IPR8949) 其 中, 在 PcFPS1 的 25~372 位 氨 基 酸 位 点 为 萜 类 合 酶 结 构 域 ; 在 63~334 位 氨 基 酸 位

259 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 213 年 9 月.5 1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 11 111 可 能 性.5.5.5 121 131 141 151 161 171 181 191 21 211 221 231 241 251 261 271 281 291 31 311 321 331 341 351 241 251 H-α- 螺 旋 C- 无 规 卷 曲 H-α-helix C-Random coil 图 2 通 过 SWISS-MODEL 预 测 PcFPS1 蛋 白 的 二 级 结 构 Fig. 2 Secondary structure prediction of PcFPS1 protein using SWISS-MODEL 点 为 聚 戊 烯 基 酶 结 构 域 但 是, 对 于 聚 戊 烯 基 酶 的 研 究 不 多, 认 为 牻 牛 儿 基 焦 磷 酸 合 酶 在 结 构 上 和 聚 戊 烯 基 酶 具 有 相 似 性 从 萜 类 合 酶 的 结 构 域 分 布 位 点 来 看, 其 基 本 囊 括 了 该 酶 的 所 有 氨 基 酸 位 点, 这 说 明 不 同 植 物 来 源 的 FPS 同 源 性 较 高 3.2.3 PcFPS1 蛋 白 三 维 结 构 建 模 在 SWISS-MODEL 依 据 保 守 结 构 域 作 图 工 具 中, 对 PcFPS1 蛋 白 的 保 守 结 构 域 的 三 维 结 构 建 模, 结 果 见 图 3 3.2.4 PcFPS1 信 号 肽 亚 细 胞 定 位 预 测 分 析 利 用 SignalP 4. Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/ SignalP/) 预 测 PcFPS1 蛋 白 不 具 有 信 号 肽 在 线 工 具 WOLF PSORT(http://wolfpsort.org/) 预 测 该 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 情 况, 结 果 显 示 : 细 胞 质 的 定 位 系 数 为 6.(cyto:6.); 细 胞 核 的 定 位 系 数 为 4.(nucl: 4.); 细 胞 骨 架 的 定 位 系 数 为 2.(cysk:2.); 叶 绿 体 的 定 位 系 数 为 (chlo:) 因 此,HsCAS1 最 可 能 定 位 于 细 胞 质 中 3.2.5 PcFPS1 跨 膜 区 预 测 分 析 利 用 TMHMM Server v. 2.(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHM-M/) 预 测 PcFPS1 的 跨 膜 区, 结 果 显 示 该 蛋 白 不 具 有 跨 膜 区 ( 图 4) 3.2.6 PcFPS1 的 氨 基 酸 序 列 比 对 及 进 化 分 析 将 PcFPS1 的 氨 基 酸 序 列 提 交 到 NCBI 的 蛋 白 质 序 列 数 据 库 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) 进 1.2.8 可 能 性.6.4.2 跨 膜 区 5 1 15 2 25 3 35 PcFPS1 氨 基 酸 顺 序 图 3 PcFPS1 蛋 白 的 三 维 模 型 Fig. 3 Three-dimensional model for PcFPS1 protein 图 4 预 测 的 PcFPS1 蛋 白 的 跨 膜 区 Fig. 4 Predicted transmembrane region of PcFPS1 protein

中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 213 年 9 月 2591 行 BLASTP 搜 索 相 似 性 序 列, 结 果 显 示,PcFPS1 与 挪 威 云 杉 Picea Abies (Linn.) Karst. 的 FPS 序 列 相 似 性 最 高, 达 7% 为 了 分 析 PcFPS1 的 进 化 情 况, 从 NCBI 的 Nr 数 据 库 中 选 取 了 1 个 物 种 1 条 FPS 序 列 绘 制 进 化 树 这 些 序 列 包 括 挪 威 云 杉 Picea abies Karst 的 FPS (gi 16823179 ), 银 杏 Ginkgo biloba L. 的 FPS (gi 3868429 ), 麝 香 百 合 Lilium longiflorum Thumb 的 FPS(gi 32637539 ), 小 果 野 蕉 Musa acuminata Colla 的 FPS(gi 1895845 ), 青 钱 柳 Cyclocarya paliurus (Batal) Iljinsk 的 FPS(gi 2678475 ), 雷 公 根 Centella asiatica ( L. ) Urban 的 FPS (gi 557192 ), 刺 五 加 Eleutherococcus senticosus (Ruprecht & Maximowicz) 的 FPS(gi 373842322 ), 辽 东 楤 木 Aralia elata ( Miq. ) Seem. 的 FPS (gi 3431229 ), 三 七 Panax notoginseng (Burk) f. H. Chen 的 FPS(gi 66735446 ) 和 人 参 Panax ginseng C. A. Mey. 的 FPS(gi 68165941 ) 进 化 树 如 图 5 所 示, PcFPS1 与 挪 威 云 杉 和 银 杏 的 FPS 亲 缘 关 系 较 近, 这 与 序 列 BLAST 的 分 析 结 果 一 致 4 讨 论 82 1 1 87 82 图 5 PcFPS1 的 进 化 分 析 人 参 三 七 辽 东 楤 木 刺 五 加 雷 公 根 青 钱 柳 小 果 野 蕉 麝 香 百 合 银 杏 挪 威 云 杉 龙 骨 马 尾 杉 Fig. 5 Phylogenetic analysis of PcFPS1 次 生 代 谢 产 物 是 植 物 在 长 期 进 化 中 与 环 境 相 互 作 用 的 结 果, 在 植 物 生 命 活 动 的 许 多 方 面 起 着 重 要 的 作 用, 且 部 分 是 植 物 生 命 活 动 所 必 需 的 同 时, 次 生 代 谢 产 物 在 医 药 食 品 轻 化 工 等 领 域 被 广 泛 应 用, 但 是 其 常 有 种 属 器 官 组 织 和 生 长 发 育 的 特 异 性, 且 往 往 含 量 较 低 这 就 可 能 导 致 在 对 植 物 的 开 发 利 用 过 程 中 造 成 资 源 和 生 态 问 题 针 对 这 个 难 题, 可 以 尝 试 利 用 植 物 条 形 码 (ITS2 序 列 ) [19] 建 立 多 个 植 物 的 系 统 发 育 树, 确 定 亲 缘 关 系, 对 近 缘 植 物 进 行 研 究, 从 中 寻 求 目 标 化 合 物 ITS2 的 鉴 定 效 率 已 经 在 蔓 藓 科 [2] [21] 豆 科 等 植 物 中 得 到 肯 定 目 前, 萜 类 化 合 物 除 了 考 虑 在 基 因 水 平 上 对 其 82 64 1 [22] 形 成 机 制 进 行 调 控 外, 还 利 用 全 基 因 组 测 序 技 术 对 三 萜 类 物 质 相 关 合 成 基 因 进 行 全 面 阐 释, 这 已 [23] [24] 经 在 灵 芝 和 黄 瓜 中 取 得 成 功 相 关 基 因 的 发 掘 [25] 与 研 究 还 能 通 过 转 录 组 测 序 进 行,Sun 等 在 对 西 洋 参 转 录 组 的 研 究 中 发 掘 了 大 量 细 胞 色 素 P45 糖 基 转 移 酶 相 关 基 因 本 研 究 结 果 不 仅 为 验 证 PcFPS1 的 分 子 功 能 提 供 依 据, 为 阐 明 石 杉 科 植 物 甾 醇 的 生 物 合 成 途 径 奠 定 基 础, 而 且 为 将 来 合 成 生 物 学 标 准 元 件 库 的 建 立 提 供 较 完 整 的 信 息 和 条 件 同 时, 此 次 实 验 克 隆 所 [12] 得 的 基 因 具 有 完 整 的 ORF, 而 之 前 在 柴 胡 中 仅 得 到 FPS 的 基 因 片 段 这 得 益 于 罗 氏 454 高 通 量 测 序 方 法 在 本 课 题 中 的 应 用, 因 其 读 长 较 长, 在 识 别 同 源 区 段 时 较 Solexa/Illumina 技 术 有 优 势, 更 适 合 做 转 录 组 研 究 其 次,PcFPS1 基 因 编 码 372 个 氨 基 酸 残 基, 与 之 前 报 道 的 三 七 [16] 青 钱 柳 [15] [26] 青 蒿 中 FPS 编 码 342~343 个 氨 基 酸 残 基 有 一 定 差 别, 这 可 能 是 由 于 龙 骨 马 尾 杉 属 于 低 等 蕨 类 植 物, 与 这 些 植 物 亲 缘 关 系 较 远 所 致 文 献 报 道,FPS 基 因 的 功 能 已 经 在 杜 仲 [27] [28] 烟 草 中 通 过 构 建 表 达 载 体 的 方 式 得 到 验 证 本 研 究 在 后 续 实 验 中, 将 进 行 PcFPS1 表 达 载 体 的 构 建, 并 对 PcFPS1 的 结 构 及 功 能 进 行 研 究 志 谢 : 中 国 医 学 科 学 院 药 用 植 物 研 究 所 海 南 分 所 李 榕 涛 王 德 立 老 师 在 样 品 采 集 过 程 中 给 予 帮 助 参 考 文 献 [1] 杨 纯 瑜. 国 产 石 杉 科, 石 松 科 药 用 植 物 的 分 类 分 布 和 药 用 价 值 [J]. 植 物 分 类 学 报, 1982, 2(4): 445-452. [2] Liu J S, Zhu Y L, Yu C M, et al. The structure of huperzine A and B, two new alkaloids exhibiting marked anti-cholinesterase activity [J]. Can J Chem, 1986, 64(4): 837-839. [3] Ma X Q, Tan C H, Zhu D Y, et al. Is there a better source of huperzine a than Huperzia serrata? Huperzine a content of Huperziaceae species in China [J]. J Agric Food Chem, 25, 53(5): 1393-1398. [4] Luo H M, Sun C, Li Y, et al. Analysis of expressed sequence tags from the Huperzia serrata leaf for gene discovery in the areas of secondary metabolite biosynthesis and developmental regulation [J]. Physiol Plant, 21, 139(1): 1-12. [5] Luo H M, Li Y, Sun C, et al. Comparison of 454-ESTs from Huperzia serrata and Phlegmariurus carinatus

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