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Biomolecular Engineering Laboratory Fundamental Lab Work 1. Pipet 2. 度 理 3. 4. 落 數 (CFU) 5. 6. 離 7. DNA 8. DNA 9. 離 離 10. 金 離 11. (initial rate of absorbance increase) 1. Biological Fuel Cell 2. Bacterial Cellulose Production and Applications 3. Antibiotic Peptides Production by Lactic Acid Bacteria 4. Immobilized Enzymes or Cells as Biocatalyst for Biotransformations 行 年 利 兩 兩 理 行 行 行

牢 行 量 不 裸 露 留 糖 料 理 行 狀 切 更 理 切 不 精 理 冷 離 1. 料 Merck Index 2. 度 3. 硫 β-mercaptoethanol formaldehyde 量 若 不 理 4. 例 acrylamide 神 ethidium bromide SDS 5. 料 不 6. 度 切

Pipet 量 (micropipet) 行 量 都 了 量 識 A. 1. Pipetman 不 量 量 2. 3 量 量 (tip) P1000 藍 量 P100 量 P10 量 量 量 不 塞 4. 量 兩 A, 量 B, 量 C, 量 量 D, E, 狀

B. 1. 量 2. 度 量 切 行 3. 量 切 不 度 70 塞 4. Pipetman Pipetman Pipetman C. 1. 六 量 離 A~F 2. 列 不 L A B C D E F Solution 1 900 495 999 90 99 5 Solution 2 100 5 1 10 1 5 1000 500 1000 100 100 10 3. 量 離 離 數 4. 量 量 (i) 量 留 (ii) 離 留

度 A. 度 流 1. 2. Spectra manager 3. Environment Hardware setting Deuterium ( 340nm) 4. Fixed wavelength measurement 5. measurement parameters wavelength OK 6. Autozero 零 B. 1. UV (<340nm ) 2. 若 0.8 3. 度 度 4. 不 留 5. 立 6. C. 1. 1mg BSA 10mL BSA 2. BSA 不 度 (0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001 mg/ml) 3. 度 OD 280 4. 度 行 不 度 5. 錄 不 度 度 立 BSA 量 R 2 ~0.999 pipet 度

A. LB agar plate : 1% (w/v) Bacto tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 1% NaCl 5 N NaOH ph 7.0 1.5% (w/v) Bacto agar 1. 30 2. 冷 50 B. 1. Kanamycin LB plate (LB+Kan) 2. 落 3. LB+A plate 落 連 數 (Streak 1) 4. 60 度 ( Streak 2) 5. (Streak 3) 6. 37 Streak 1 Streak 2 Streak 3 C. LB 1% (w/v) Bacto tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 1% NaCl 5 N NaOH ph7.0 1. 15 ml pipet 3 ml LB 2. ( ) 精 落 落 離 精 3. 37

(diauxic growth) When exposed to glucose + lactose, E. coli does not consume lactose until glucose is exhausted, resulting in two exponential growth phases separated by a lag. This is called the diauxie or double growth. Diauxie occurs because synthesis of lactose permease and β-galactosidase is somehow abolished in the presence of glucose. 1. 兩 250 ml 利 量 30ml LB 兩 glucose (0.5%) 度 glucose(0.5%) lactose(1%) 2. 1 ml 1 ml 量 離 37 3. 60 min 1 ml 4. 利 度 不 OD 600 LB Blank 5. 離 行 離 6. X- OD 600 兩 不

蘭 A. 理 連 不 若 不 留 若 留 蘭 類 兩 蘭 蘭 不 (crystal violet) 藍 蘭 (Iodine) 不 CV-I 料 95% 度 蘭 量 留 CV-I 量 立 不 易 留 蘭 量 易 不 易 利 CV-I (safranin o) 料 蘭 蘭 留 B. 1. 2. Escherichia coli Streptococcus thermophilus 3. 4.

5. 60 6. 來 7. 精 行 8. 來 精 9. 45 10. C. 切 度 流 蘭 蘭 不 不 CV-I 蘭 蘭 24 老 蘭 易 留 力

DNA DNA 立 DNA 狀 DNA 數 kb 行 力 DNA DNA DNA 例 裂 alkaline lysis boiling method CsCl 裂 率 廉 易 理 利 理 DNA DNA 兩 狀 復 DNA DNA 亂 度 易 沈 來 DNA 兩 DNA 復 易 離 DNA DNA 離 Solution I Solution II SDS NaOH DNA Solution III DNA 利 DNA 沈 Solution III 離 DNA 留 DNA 精 沈 / / 異 [PCI] 留 70 精 類 量 (mini-prep) 離 DNA CsCl 度 度 離 量 (large-prep) 了 量 DNA (molecular cloning) 例 行 切 了 alkaline boiling methods DNA 益 不 利 (column chromatography) 行 量 DNA 更 省 利 裂 行 DNA A. DNA ( 裂 ) TE buffer 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA, ph8.0 Lysis buffer 0.2N NaOH, 1% SDS Neutralization buffer 5M potassium acetate B. 裂

1. pet30b(+) 3mL (LB+Kan) 37 170rpm 16 2. 離 (6000rpm,1min) 3. 200 L TE buffer 4. 200 L Lysis buffer 10 5. 250 L Neutralization buffer 10 6. 離 (12000rpm,5~10min) 量 離 7. 500 L 異 IPA DNA 離 (12000rpm,5~10min) 8. 500 L 70% 精 DNA 離 (12000rpm, 5~10min) 9. DNA 20 L TE buffer DNA agarose 冷 切 DNA agarose gel DNA 度 agarose 度 了 DNA 不 度 率 不 DNA marker Syber Green Syber Green EtBr 見 C. (agarose, low EEO) 1 TAE 10 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 0.1 M EDTA, 50% glycerol SYBR green stock solution (100X) DNA 量 DNA/HindIII fragments 8 23.1, 9.4, 6.5, 4.3, 2.3, 2.0, 0.56, 0.125 kb 度 0.5 g/ L λmr

D. 1. 8-well 1.2% agarose gel 量 agarose 0.3g 1 TAE 25 ml 爐 2. 不 DNA 2 l SYBR Green 2 l loading dye 30 well 行 3. 100V 行 bromophenol blue 行 UV transilluminator box 錄 4. 量 DNA 量

A. 理 力 力 利 略 說 1. 不 連 (disc-page) 行 度 SDS- (SDS-PAGE) 量 度 (gradient) 量 SDS 度 兩 SDS- 度 力 2. 狀 立 (16 18 cm) (8 10 cm) 力 不 狀 行 行 3. 類 (polyacrylamide) 數 (agarose gel) pi 異 4. 率 ph 8.8 pi 8.8 率 量 若 量 狀 不 率 B. 1. 2, 3. (8x10 cm) Spacer (0.75 mm) Comb (0.75 mm) 4. 5. 6. 7. 30% acrylanide mix 1.5M Tris(pH8.0) 10% Ammonium persulfate 10% SDS TEMED

C. 1. 列 不 度 SDS-PAGE 2. 易 Isopropanol 20 3. Isopropanol 4. 3X loading dye 95 10 5 5. 冷 SDS-PAGE 110V 行 藍 料 6. 兩 留 切 離 ( ) 7. Staining buffer 5 min 50 rpm 不 8. CBR 來 藍 來 20 ml Destaining buffer 留

離 離 A. 理 離 ion exchange chromatography IEC 離 理 離 不 不 離 不 力 離 度 ph 離 來 離 5 1. 離 2. 離 3. 行 離 不 易 離 4. 離 5. 離 離 律 量 離 不 度 降 都 連 離 來 類 ph ph 離 ph 力 來 不 不 apartic acid glutamic acid ph3~4 glycine alanine arginine lysine ph ph 10~11 B. 1. Buffer A 50 mm Na 2 HPO 4, ph 7.0 2. Buffer B 50 mm Na 2 HPO 4, ph 7.0, 0.5 M NaCl 3. DEAE-cellulose C. 1. DEAE cellulose 沈

降 沈 降 buffer A 2. 沈 降 度 0.5 cm buffer A 流 流 不 3. 濾 流 buffer A 流 10 ml 4. bufferb 離 流 1 ml 5. 行 SDS-PAGE

金 離 A. 理 若 六 His 離 imidazole 離 B. 1. 金 2. Buffer A 50 mm Na 2 HPO 4, ph 8.0; 0.3 M NaCl; 20 mm imidazole 3. Buffer B 50 mm Na 2 HPO 4, ph 8.0; 0.3 M NaCl; 250 mm imidazole C. 1. 0.5 ml 藍 塞 buffer A 流 20 ml 塞 2. 弄 亂 流 3. buffer A 流 buffer A 流 10 ml 4. buffer B 流 1ml 5. 行 SDS-PAGE

1. 2. Reagent Stock Final Volume H 2 0 675µL Potassium phosphate buffer, 1M 0.1M 100µL ph8.0 D-alanine 0.3M 0.03M 100µL o-phenylenediamine/o-dianisidine 0.3% 0.03% 100µL Horseraddish peroxidase 0.25U/ L 5U 20µL Enzyme(DAOase) 5µL 3. 度 Time course measurement Measurement parameters 參 數 列 更 Photometric mode=abs Response=quick wavelength=453nm End time=120sec Data Pitch=0.2sec Display=auto 4. 利 度 力 參 數 來 OD 453 5. 離 金 異