NCG-hIL15 品系名称 :NOD/ShiLtJGpt-Prkdc em26cd52 Il2rg em26cd22 /Gpt-Il15 em1cin(hil15) /Gpt 品系类型 :Knock-in 品系编号 :T004886 品系背景 :NOD/ShiLtJGpt 一 品系描述 [1] NOD/ShiltJGpt 遗传背景小鼠具有天然免疫缺陷, 如补体系统 巨噬细胞缺陷 Prkdc 基因突变会导致 VDJ 重组受损 (scid 鼠 ), 造成 T 细胞和 B 细胞不能发育成熟, 表现为 [2] 细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷 Il2 receptor gamma(il2rγ) 链是具有重要免疫功能的细胞因子 IL2 IL4 IL7 IL9 IL15 和 IL21 的共同受体亚基, 将编码 IL2rγ 的 IL2rg [3] 基因敲除小鼠机体免疫功能严重降低, 尤其是 NK 细胞的活性几乎丧失 通过基因编辑技术在 NOD/ShiLtJGpt 小鼠上敲除 Prkdc 及 Il2rg 基因制作的高度免疫缺陷模型 NCG, 背景较 [4] 单一, 寿命长, 缺乏成熟的 T 细胞 B 细胞和 NK 细胞, 缺乏补体活性 IL15( 白细胞介素 -15) 是一种多效性细胞因子, 由活化的单核 - 巨噬细胞 表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生, 发挥类似 IL2 的生物学活性, 具有激活 T 细胞 B 细胞和 [5,6] NK 细胞, 并可介导这些细胞的增殖和存活功能 为此, 我们在 NCG 小鼠模型上进行人源化 IL15 基因的敲入, 获得自主产权品系 NCG-hIL15, 该小鼠可支持人源 NK 细胞的定植及活性 通过表型分析验证的 NCG-hIL15 小鼠, 可以与其它人源化细胞因子的小鼠模型配繁, 亦将成为人源免疫系统重建的重要模型 二 应用领域 1. 用于制备免疫系统人源化小鼠模型, 如接种 PBMC HSC 获得的免疫系统人源化小鼠模型 ; 2. 用于人源细胞 组织移植 ; 3. 接种人源肿瘤用于筛选相关药物 ; 4. 用于人类造血系统和免疫系统研究 三 验证数据 1 NCG-hIL15 小鼠人源 IL15 mrna 表达水平验证
图 1 对比 NCG-hIL15 小鼠人源 IL15 和 NCG 小鼠鼠源 IL15 mrna 表达水平通过 Q-PCR 检测发现 NCG-hIL15 人源化小鼠中人源 IL15 组织表达特异性与 NCG 背景鼠中鼠源 IL15 表达特异性一致 2 NCG-hIL15 小鼠外周血中人源 IL15 表达水平 图 2 NCG 和 NCG-hIL15 小鼠外周血中人源 IL15 的含量比较通过 ELISA 检测发现 NCG 小鼠外周血血浆中未检测到人源 IL15, 而 NCG-hIL15 人源化小鼠的杂合子及纯合子中均能检测到人源 IL15 的表达, 且纯合子表达水平高于杂合子 3 NCG-hIL15 小鼠 T/B/NK 细胞比例检测
图 3 NCG-hIL15 小鼠 T/B/NK 细胞比例检测结果取 5 周龄 C57BL/6JGPT 和 NCG-hIL15 雌鼠外周血及脾脏细胞进行流式检测, 测定其 T 细胞 (CD3+) B 细胞 (CD19+) 和 NK 细胞 (CD335+) 比例 结果显示, 与 C57BL/6JGPT 相比,NCG-hIL15 小鼠几乎没有 T B NK 细胞, 免疫缺陷较为彻底
4 HuHSC-NCG-hIL15 造模流程 NCG-hIL15 小鼠移植 CD34+HSC 后, 生存周期超过 18 周, 给药窗口期较长 NCG-hIL15 小鼠的免疫重建效率高, 主要重建 T 细胞 少量 NK 细胞和巨噬细胞以及大量未成熟的 B 细胞等, 可用于肿瘤免疫治疗药物的评价 图 4 huhsc- NCG-hIL15 重建过程 5 HuHSC-NCG-hIL15 生长曲线和体重变化 图 5 人源 HSC 重建后 NCG 及 NCG-hIL15 小鼠生存率和体重变化情况 免疫重建过程中 huhsc-ncg 及 huhsc-ncg-hil15 小鼠体重呈上升趋势 6 huhsc-ncg 及 huhsc-ncg-hil15 小鼠外周血免疫重建表型
Total Leukocytes: hcd45+; NK cell: hcd56+; B cell: hcd19+; T cell: hcd3+, hcd4+, hcd8 图 6 huhsc-ncg 及 huhsc-ncg-hil15 小鼠外周血中各细胞组份的重建情况于 5 7 9 11 13 周收集 huhsc-ncg 及 huhsc-ncg-hil15 小鼠外周血, 采用流式细胞技术检测 huhsc-ncg 小鼠及 huhsc-ncg-hil15 小鼠人源化进程 检测指标为 hcd45, hcd56,hcd19,hcd3,hcd4,hcd8 随着免疫重建进程,5 周左右 huhsc-ncg-hil15 小鼠外周血中 hcd45+ 白细胞水平在已达 20% 以上, 其中 hcd3+t 细胞水平逐渐增加, 且分化出 hcd4+t 及 hcd8+t 细胞亚群 与 huhsc-ncg 小鼠相比,CD56+NK 细胞重建水平明显升高 7 huhsc-ncg 及 huhsc-ncg-hil15 小鼠外周血中 NK 细胞功能蛋白检测 图 7 huhsc-ncg 及 huhsc-ncg-hil15 小鼠外周血中重建人源 NK 细胞功能性蛋白检测
于重建 13 周 (W13) 收集 huhsc-ncg 及 huhsc-ncg-hil15 小鼠外周血, 采用流式细胞技术检测 huhsc-ncg 小鼠及 huhsc-ncg-hil15 小鼠外周血中重建的人源 NK 细胞功能基因表达情况 检测指标为 CD56 CD16 KIR3DL NKG2D 与 huhsc-ncg 相比, huhsc-ncg-hil15 小鼠人源 NK 细胞重建水平显著升高, 且可以表达 KIR3DL NKG2D 功能性蛋白 8 NK 细胞功能性数据验证 图 8 NCG-hIL15 小鼠中移植人源造血干细胞 HSC 重建 NK 细胞杀伤及 ADCC 作用随着效靶比的增加 (NK:K562=2: 1,5: 1,10: 1),NCG-hIL15 人源化小鼠重建 NK 细胞对于人慢性髓系白血病细胞 K562 的杀伤率也随之增加 ( 左图 ) 随着效靶比的增加 (NK: Raji=2: 1,5: 1),NCG-hIL15 人源化小鼠重建 NK 细胞对于 Raji 细胞的杀伤率也随之增加 ( 右图 ) 加入 0 μg/ml 及 10 μg/ml 的 Rituximab( 靶向 CD20 抗体, 主要通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 ADCC 杀伤 CD20+ 肿瘤细胞 ),Rituximab 抗体通过 NK 细胞介导的 ADCC 作用, 对 Raji 细胞的杀伤作用进一步增强 图 9 基于 huhsc-ncg-hil15 小鼠体内用药试验将对数生长期人淋巴瘤细胞 Raji 细胞接种到 huhsc-ncg-hil15 小鼠皮下, 待肿瘤生长至平均体积约 40-50 mm3 时, 随机分为 PBS 组,Rituximab 给药组及 Blincyto( 靶向 CD3 及 CD19 的双特异性抗体, 主要通过介导 CD3+T 细胞杀伤 CD19+ 肿瘤细胞 ) 给药组, 并使用相应的药物进行治疗 结果显示 :Rituximab 组 (TGI=48.95%) 及 Blincyto 组 (TGI=59.67%) 对 huhsc-ncg-hil15 的 Raji 细胞荷瘤鼠上肿瘤生长有显著的抑制作用
结果证明 : 移植人源造血干细胞 HSC 的 NCG-hIL15 小鼠结合人源的肿瘤构建的动物模 型可以用于评价借助 T 细胞及 NK 细胞发挥抗肿瘤作用的肿瘤免疫治疗相关药效评估 9 hupbmc/nk-ncg-hil15 小鼠外周血免疫重建表型 图 10 在 NCG-hIL15 小鼠上进行 PBMC 或 NK 重建后各细胞组分分析将 PBMC 或从 PBMC 分选的 NK 细胞接种至成年 NCG-hIL15 小鼠体内, 分别在重建后的第 2,3,4 周进行检测 hupbmc-ncg-hil15 小鼠重建两周即可检测其 hcd45+ 细胞占比约 20%, 在第 3,4 周有所增长 重建出的细胞以 CD3+T 细胞为主 NK-NCG-hIL15 重建的 hcd45+ 细胞比例较低 (10% 左右 ), 重建出的细胞以 NK 细胞为主, 有少量的 T 细胞 参考文献 1. Shultz LD, Schweitzer PA, Christianson SW, et al. (1995). "Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice". J. Immunol. 154 (1): 180 91. 2. Takenaka K, Prasolava TK, Wang JC, et al. (2007). "Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells". Nat. Immunol. 8 (12): 1313 23. 3. Greiner DL, Hesselton RA, Shultz LD (1998). "SCID mouse models of human stem cell engraftment". Stem Cells. 16 (3): 166 177. 4. Cao X, Shores EW, Hu-Li J, et al. (1995). "Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain". Immunity. 2 (3): 223 38. 5. Ali, A. K., Nandagopal, N. & Lee, S. H. (2015). IL-15-PI3K-AKT-mTOR: A Critical Pathway in the Life Journey of Natural Killer Cells. Frontiers in immunology. 6, 355. 6. Fehniger, T. A. et al. (2001). Fatal leukemia in interleukin 15 transgenic mice follows early expansions in natural killer and memory phenotype CD8+ T cells. The Journal of experimental medicine. 193, 219-231,.