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削吏田
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1 56 doi /j.issn J South Med Univ, 215, 35(1): 基础研究人源性荷三阴乳腺癌 NOD/SCID 小鼠模型建立及其免疫应答张翘楚, 李玺, 刘瑞磊, 姜华, 黄泽楠, 刘宇, 汤谧, 黄勇中山大学附属第三医院甲状腺乳腺外科, 广东广州 5163 摘要 : 目的建立具有人免疫学特征的 NOD/SCID 小鼠模型, 并观察其对三阴乳腺癌的免疫应答方法筛选无免疫渗漏 NOD/ SCID 小鼠 24 只, 分成 4 组, 免疫重建组提前 3 d 腹腔注射 25 mg/kg 环磷酰胺 (CTX), 后经腹腔注射健康人外周血单个核细胞 (PBMC) 同时背部皮下接种人三阴乳腺癌细胞 MDA-MB-231; 单纯免疫组只注射 CTX 及 PBMC; 单纯荷瘤组只接种 MDA-MB-231; 空白对照组不作任何处理定期观察各组小鼠生物学及免疫学特征结果免疫荷瘤组成瘤潜伏期 (1~12 d) 较单纯荷瘤组 (8~1 d) 延长, 肿瘤生长速度减缓, 第 5 周末肿瘤体积分别为 ± mm 3 和 mm(p<.1), 3 生存率提高 (P<.1) 接受免疫重建的小鼠外周血人 IgG 于第 2 周即可测到, 并逐渐上升, 较未接受免疫重建小鼠差异有统计学意义 (P<.1) 外周血中细胞比例于第 2 周逐渐下降, 但于第 9 周仍可测到第 9 周小鼠脾脏细胞中 T 细胞比例高达 55.3%( 免疫荷瘤组 ) 及 52.7%( 单纯荷瘤组 ) 免疫荷瘤组小鼠脾指数 9.64 mg/g 明显高于单纯免疫组 3.82±.31 mg/g 及空白对照组 1.51±.14 mg/g 结论成功构建稳定的具有人免疫学特征的 NOD/SCID 小鼠模型, 并观察到其对三阴乳腺癌产生免疫应答, 可为三阴乳腺癌免疫治疗研究提供较为理想的动物模型关键词 : 免疫重建 ; 免疫治疗 ;NOD/SCID 小鼠 ; 三阴乳腺癌 Establishment of a NOD/SCID mouse model with human immune reconstitution bearing human triple-negative breast cancer ZHANG Qiaochu, LI Xi, LIU Ruilei, JIANG Hua, HUANG Zenan, LIU Yu, TANG Mi, HUANG Yong Department of Thyroid and Breast Surgery, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 5163, China Abstract: Objective To establish a NOD/SCID mouse model with human immune reconstitution and observe its immune response to human triple-negative breast cancer xenograft. Methods Twenty-four NOD/SCID mice without immune leakage were subjected to cyclophosphamide (CTX) treatment 3 days prior to immune reconstitution with human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) injection and subcutaneous transplantation of human triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells, CTX treatment and PBMC injection without tumor cell transplantation, MDA-MB-231 cell transplantation only, or no treatments. The tumor growth and immune responses of the mice were observed at regular intervals. Results Compared with the tumor-bearing mice, the tumor-bearing mice with immune reconstitution showed prolonged incubation period of tumor formation, slower tumor growth rate and increased survival rate. Human IgG and T cells were detected in the peripheral blood of the mice 1 week after human PBMC injection. The percentage of T cells in the spleen cells was 55.3% at 9 weeks in tumor-bearing mice with immune reconstitution and 52.7% in tumor-bearing mice without immune reconstitution. The spleen index of the tumor-bearing mice with immune reconstitution was much higher than that in mice with only immune reconstitution and the control mice (9.64 vs 3.82±.31 and 1.51±.14 mg/g). Conclusion A stable NOD/SCID mouse model with immune reconstitution has been established successfully, which shows immune responses to triple-negative breast cancer xenografts and allows studies of immunological therapy study of triple-negative breast cancer. Key words: immune reconstitution; immunological therapy; NOD/SCID mice; triple-negative breast cancer 乳腺癌是女性中发病率高的癌症 [1] 其中三阴乳腺癌 (TNBC) 以雌激素受体 (ER) 孕激素受体 (PR) 和 [2-3] HER2/neu 均为阴性表达, 预后差为特征因缺乏针对性的治疗靶点, 目前临床上结合手术的全身治疗只能依靠化疗近年来, 免疫治疗备受关注, 为三阴乳腺癌收稿日期 : 基金项目 : 中央高校基本科研业务费专项资金 (9ykpy15) 作者简介 : 张翘楚, 医学硕士, zhangqiaochuaz@163.com 通信作者 : 黄勇, 医学博士, 副主任医师, 硕士生导师, dryonghuang@189.cn 的治疗提供了新的切入点因此, 本实验尝试利用免疫缺陷鼠构建具有人免疫内环境的小鼠模型, 为三阴乳腺癌的免疫治疗提供研究平台现实验常用免疫缺陷鼠包括裸鼠 SCID 鼠及 NOD/ SCID 鼠, 裸鼠表现为 T 细胞免疫缺陷,B 细胞免疫正常 SCID 小鼠 T B 细胞免疫缺陷, 但体内存在正常的 NK [4] 细胞 NOD/SCID 免疫特征为 :T B 细胞缺乏,NK 细 [5] 胞活性降低相较裸鼠及 SCID 鼠,NOD/SCID 鼠免疫背景更干净故本实验尝试在 NOD/SCID 小鼠基础上建立人免疫重建模型, 并观察其对三阴乳腺癌的产生

2 J South Med Univ, 215, 35(1): 免疫应答 1 材料和方法 1.1 动物和细胞 3~5 周 NOD/SCID 小鼠, 雌性,24 只, 体质量 16~ 2 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司在中山大学北校区动物实验中心于 SPF 条件下饲养, 为避免动物运输时产生的应激反应引起实验误差, 所有小鼠均在到达实验中心后 5~7 d 开始实验人三阴乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 由本实验室保存新鲜健康人外周血试验用血液成分白细胞富集物由广州市中心血站提供 1.2 主要试剂 DMEM 高糖培养基 RPMI 164 培养基胎牛血清购自美国 Gibco; 淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司, 红细胞裂解液购自广州杰特伟生物科技有限公司, 注射用环磷酰胺购自山西普德药业有限公司 ; 人鼠 IgG ELISA 检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司 ;FACS Calibur 流式细胞仪购自美国 BD; 流式细胞抗体 CD3-PE 及其同型对照购自美国 BD 1.3 方法肿瘤细胞培养及 PBMC 提取人三阴乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 用含 1% 胎牛血清的 DMEM 完全培养基在 37 体积分数 5% CO 2 恒温培养箱中培养取对数生长期细胞计数 /ml 重悬于无菌 PBS 密度梯度离心法提取 PBMC [6], 简述如下 : 取白细胞富集物等量生理盐水稀释后, 滴加于淋巴细胞分离液上, 保持界面清晰稀释血液和淋巴细胞分离液体积比 2 1,45 g 离心 25 min, 吸取白膜层, 用 5 倍体积的生理盐水稀释以去除残余淋巴细胞分离液, 分别用 g 各 1 min 离心洗涤, 弃上清液, 计数 /ml 重悬于无菌 PBS 模型建立及分组 NOD/SCID 小鼠 24 只, 随机分为 4 组, 每组 6 只实验前尾静脉采血测定鼠 IgG, 确定无免疫渗漏 (IgG<5 μg/ml) 免疫荷瘤组腹腔注射环磷酰胺 (CTX)25 mg/kg, 进一步抑制小鼠体内 NK 细胞 [7] 活性,3 d 后经腹腔注射 / 只健康人外周血单个核细胞 (PBMC), 同时背部皮下接种 / 只 MDA-MB-231 三阴乳腺癌细胞 ; 单纯免疫组仅注射同量 CTX 及 PBMC, 不荷瘤 ; 单纯荷瘤组仅在背部皮下接种同量三阴乳腺癌细胞 ; 空白对照组不作任何处理观察小鼠生物学特征腹腔注射 CTX 后每天观察小鼠精神状态, 进食, 毛发, 体质量变化荷瘤后游标卡尺测量肿瘤大小, 并记录小鼠成瘤潜伏期及成瘤率肿瘤成瘤后 ( 直径 5 mm) 记录肿瘤最长径 (a) 和最短径 (b), 并按以下公式计算肿瘤的体积 :V=ab 2 /2 绘制小鼠肿瘤生长曲线, 体质量曲线, 生存率曲线及自然生存时间第 9 周末处死所有小鼠后取脾脏称重, 并按以下公式计算脾指数 : 脾指数 = 脾脏重量 / 小鼠体质量 ELISA 检测小鼠外周血人 IgG 含量分别于免疫荷瘤后第周末用含肝素试管收集小鼠尾静脉血, 室温静置 3 h,3 r/min 离心 5 min 用 ELISA 双抗体夹心法检测小鼠血浆中人 IgG 蛋白含量, 具体按说明书操作在酶标仪波长 49 nm 上读取吸光度值, 并按标准曲线换算成相应浓度值流式细胞术检测小鼠外周血及脾脏细胞比例分别于免疫荷瘤后第周末取小鼠外周血及第 9 周末处死小鼠后取脾脏尾静脉血加红细胞裂解液 37 反应 1 min 去除红细胞脾脏冰上 2 目滤网研磨收集脾细胞, 离心, 去上清, 加红细胞裂解液 37 反应 1 min 两者均用 PBS 洗涤两次 (12 r/min,5 min), CD3-PE 标记, 冰上避光孵育 3 min, 用 PBS 洗涤两次 (12 r/min,5 min), 流式细胞仪检测 1.4 统计学分析所有数据以均数 ± 标准差表示, 用计算机 SPSS16. 统计软件处理小鼠生存率比较采用 log-rank 法分析, 随时间采集数据的多组间比较采用 Two-way ANOVA 两组间比较采用独立 t 检验 P<.5 为有统计学差异 2 结果 2.1 小鼠生物学特征两组接受免疫重建的小鼠 ( 免疫荷瘤组及单纯免疫组 ) 在 CTX 注射后 1 周内体质量下降, 进食量较前减少免疫荷瘤组小鼠中有 1 只于注射 PBMC 后明显表现出精神萎靡, 毛发蓬松杂乱, 并于第 16 天内死亡, 考虑为 GVHD [8] 其余小鼠 GVHD 表现不明显, 期间小鼠精神状态可, 毛发无明显脱落, 无呕吐,CTX 注射后 2~3 d 排少量稀便单纯荷瘤组成瘤潜伏期 8~1 d 免疫荷瘤组成瘤潜伏期 1~12 d, 两组小鼠成瘤率均为 1% 免疫荷瘤组相比单纯荷瘤组肿瘤生长减缓, 同期肿瘤体积缩小 (P<.1), 第 5 周末肿瘤体积分别为 ± mm 3 和 mm( 3 图 1A) 两组肿瘤均含有丰富血管及完整包膜, 切面灰白色鱼肉状, 肉眼可见瘤体中心出现明显坏死免疫荷瘤组小鼠体质量相比单纯免疫组及空白对照组明显下降 (P<.1), 但对比单纯荷瘤组从第 3 周开始有明显改善 (P<.1, 图 1B) 单纯荷瘤组小鼠在荷瘤后第 14 天即开始出现死亡, 濒死前出现消瘦, 精神萎靡, 毛发杂乱松散, 并于第 35 天全部死亡免疫荷瘤组小鼠 ( 除外因 GVHD 死亡 1 只小鼠 ) 从 34 d 才开始出现死亡, 生存率明显提高 (P<.1) 单纯免疫组与空白对照组在 9 周内生存率无统计学差异 (P>.5, 图 1C) 因免

验中心后 5~7 d 开始实验人三阴乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 由本实验室保存新鲜健康人外周血试验用血液成分白细胞富集物由广州市中心血站提供 1.

3 58 J South Med Univ, 215, 35(1): 疫荷瘤组与单纯荷瘤组小鼠于第 9 周前全部死亡, 无法取得相应脾脏数据单纯免疫组脾指数 5.1±.41 mg/g 高于空白对照组 1.63±.14 mg/g(p<.1, 图 1D), 图 1D 1 和 2 分别为单纯免疫组及空白对照组第 9 周末小鼠脾脏大小 A Tumor size (mm 3 ) Immune reconstitution & tumor bearing Immune reconstitution Tumor bearing Control Weeks after transplantation B Weight of mice (g) ) 1) 1) Weeks after CTX injection C 1 D 6 Percentage of survival Percentage of survival Days after transplantation Immune Control reconstitution 2 图 1 各组小鼠接受处理后生物学表现 Fig.1 Changes of tumor size and body weight, survival rate, and spleen indexof the mice in each group. A: Tumor size in immune reconstitution & tumor-bearing and immune reconstitution groups (P<.1); B: Body weight of the mice in each group after CTX injection. 1) P<.1 vs immune reconstitution & tumor-bearing group; C: Survival curves in each group. P<.1 between immune reconstitution & tumor-bearing group and tumor-bearing group; P>.5 between immune reconstitution group and control group; D: Spleen index and spleen size (1 and 2) in immune reconstitution group and control group (P<.1). 2.2 小鼠外周血人 IgG 含量接受免疫重建的小鼠 ( 免疫荷瘤组与单纯免疫组 ) 外周血于第 2 周即可测到一定量人 IgG, 并在第 2~6 周内呈上升趋势, 对比未免疫重建小鼠 ( 单纯荷瘤组及空白对照组 ) 差异有统计学意义 (P<.1) 免疫荷瘤组与单纯免疫组间的差异也有统计学意义 (P<.1, 表 1) 2.3 小鼠外周血及脾脏人细胞比例免疫荷瘤组及单纯免疫组小鼠外周血中于免疫重建后第 2 周即可检测到人 T 细胞 (54.4% 及 51.7%), 并呈递减趋势, 但在第 9 周末仍可测到, 对比两组未免疫重建小鼠 ( 单纯荷瘤组及空白对照组 ) 差异均有统计学意义 (P<.1) 两组接受免疫重建的小鼠间差异也表 1 小鼠外周血中人 IgG 含量 Tab.1 Human IgG content in the peripheral blood of the mice (μg/ml, Mean±SD) Human IgG (μg/ml) Group 2 nd week 4 th week Control.21±.7.21±.4 Tumor bearing Immune reconstitution.22± ± ).22± ± ) Immune reconstitution & tumor bearing ± )2) 1) 2) ± NA: not available. 1) P<.1 compared with control group; 2) P<.1 compared with immune reconstitution group. 6 th week.22±.8 NA ± ) 1) 2) ±136.72

after transplantation B Weight of mice (g) 25 23 22 2 18 16 14 1) 1) 1) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Weeks after CTX injection C 1 D 6 Percentage of survival 8 6 4 2 Percentage of survival 4 2 1 1 2 3 4 5 6

4 J South Med Univ, 215, 35(1): 具有统计学意义 (P<.1, 图 2) 第 9 周末处死小鼠后取脾脏细胞, 去除红细胞后可测得单纯免疫组及空白对照组小鼠脾脏中人 T 细胞比例分别为 52.7% 及.45%( 图 3) 1 8 2nd week 4th week 6th week % 8.655% 8.569% Immune reconstitution Tumor bearing Control % % % % 25.6% Immue reconstitution & tumor bearing % % % CD3+ PE 图 2 小鼠外周血中人 T 细胞比例 Fig.2 Percentage of human T cells in the peripheral blood of the mice. 3 讨论现国内外用于免疫重建的免疫缺陷鼠包括裸鼠 [9-11] SCID 鼠及 NOD/SCID 鼠因为裸鼠体内存在正常的 B 细胞免疫, 对植入的人淋巴细胞产生排斥反应, 导 [9, 12] 致免疫重建成功率低 NOD/SCID( none obesity disease Severe Combined Immune-Deficiency) 小鼠是在 SCID 小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠 (NOD/ Lt) 品系回交而得到的免疫缺陷鼠其免疫特征为 :T B 细胞缺陷,NK 细胞活性降低, 并不再发生自身免疫性糖 [5] 尿病相较 B NK 细胞免疫正常的裸鼠及 NK 细胞正

7% 1 8 6 4 2 6 4 2 1 1 1 1 2 1 3 1 4 1 1 1 1 2 1 3 1 4 1 1 1 1 2 1 3 1 4 38.4% 25.

5 6 J South Med Univ, 215, 35(1): Immune reconstitution Control %.45% 8 8 % of Max CD3+ PE 图 3 第 9 周末小鼠脾脏中人 T 细胞比例 Fig.3 Percentage of human T cells in the spleen of the mice at 9 weeks. 常的 SCID 鼠,NOD/SCID 鼠免疫背景更干净, 免疫重建 [13] 的成功率也更高 Shultz 等的研究表明 SCID 小鼠约 9% 可发生免疫渗漏, 而 NOD/SCD 小鼠不到 1% [14] Hesselton 等筛查实验评价了一系列 SCID 小鼠与不向遗传背景品系的小鼠回交的后代, 发现 NOD/SCID 小鼠对人外周血移植水平较其他遗传品系 SCID 小鼠高 5~1 倍为保证建模的成功率及模型的稳定性, 本实验选取了 NOD/SCID 小鼠作为免疫重建的对象为进一步抑制 NOD/SCID 小鼠体内残存的 NK 细胞对植入的异种淋巴细胞产生的排斥反应, 提高免疫重建成功率, 植入淋巴细胞前 3 d 先行注射 CTX [15] 虽经 CTX 注射后小鼠体质量有所下降, 但并不增加小鼠死亡率国内外免疫重建的方法很多, 包括取脐带血骨髓外周血胎肝胎胸腺等经小鼠腹腔尾静脉注射或肾包膜下移植 [16-2], 其中经腹腔注射人外周血淋巴细胞的方法最为简单有效, 且人外周血细胞来源充足, 成为小鼠免疫重建最为常用的方法人免疫重建的关键在于 PBMC 的移植, 其输注量过多, 易产生 GVHD [21-22], 导致模型建立的失败, 过少则无法达到免疫重建的目的参考既往实验, 本实验中采用移植数量, 结果显示免疫荷瘤组及单纯免疫组小鼠 GVHD 发生率低 (1/ 12), 移植成功率高 (11/12), 且单纯免疫组与空白对照组小鼠生存状态无明显差异, 是较为适合的 PBMC 移植数量免疫荷瘤组及单纯免疫组小鼠外周血从第 2 周开始即可检测到人 IgG, 明显高于单纯荷瘤组及空白对照组, 并在 6 周内随时间逐渐升高, 证明小鼠体液免疫功能建立并逐渐增强同时, 从第 2 周开始可检测到免疫荷瘤组及单纯免疫组小鼠外周血中人 T 细胞, 明显高于单纯荷瘤组及空白对照组, 虽然随时间逐渐减少, 但于第 9 周仍可检测到进一步检测发现单纯免疫组小鼠脾脏内人 T 细胞及脾指数远高于空白对照组, 表明移植的淋巴细胞活化, 由腹腔迁移入外周血, 并进一步定居在小鼠的重要免疫器官脾脏中, 提示免疫重建成功免疫荷瘤组小鼠成瘤率为 1%, 较单纯荷瘤组小鼠成瘤潜伏期延长, 同期体积缩小, 免疫荷瘤组小鼠体质量和生存率均较单纯荷瘤组小鼠提高, 且免疫荷瘤组小鼠外周血中人 IgG 及 T 细胞含量高于单纯免疫组小鼠, 证明免疫重建后小鼠体内人免疫系统对移植瘤产生免疫应答, 进一步活化增殖并起一定的抑制移植瘤生长作用, 给小鼠带来生存受益综上所述 : 采用腹腔注射人淋巴细胞皮下接种人三阴乳腺癌细胞的方法可以有效地建立较稳定的具有人免疫学特征的荷人三阴乳腺癌 NOD/SCID 小鼠模型小鼠来源充足, 取材方便, 操作简单, 并能较好地模拟三阴乳腺癌人体内免疫情况, 为研究三阴乳腺癌的免疫治疗提供了较为理想的模型参考文献 : [1] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of Cancer in 28: GLOBOCAN 28[J]. Int J Cancer, 21, 127 (12): [2] Foulkes WD, Smith IE, Reis-Filho JS. Triple-negative breast Cancer [J]. N Engl J Med, 21, 363(2): [3] Liedtke C, Mazouni C, Hess KR, et al. Response to neoadjuvant therapy and long-term survival in patients with triple-negative breast Cancer[J]. J Clin Oncol, 28, 26(8): [4] Bosma GC, Custer RP, Bosma MJ. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse[j]. Nature, 1983, 31(59): [5] Greiner DL, Hesselton RA, Shultz LD. SCID mouse models of

常的 SCID 鼠,NOD/SCID 鼠免疫背景更干净, 免疫重建 [13] 的成功率也更高 Shultz 等的研究表明 SCID 小鼠约 9% 可发生免疫渗漏, 而 NOD/SCD 小鼠不到 1% [14] Hesselton 等筛查实验评价了一系列 SCID 小鼠与不向遗传背景品系的

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A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene[j]. Clin Immunol, 28, 126(3): 33-14.

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