细 胞 培 养 技 术 常 见 问 题 解 答 一 细 胞 培 养 基 础 问 答 1.BHK 细 胞 就 是 指 BHK21 吗? 答 :BHK 细 胞 是 指 幼 年 叙 利 亚 地 鼠 肾 细 胞 (Baby Hamster Syrian Kidney),1961 年 建 株 原 始 的 细 胞 株 是 成 纤 维 细 胞, 贴 壁 依 赖 性 1963 年 获 得 单 细 胞 克 隆 细 胞 后 经 无 数 次 传 代 后 细 胞 可 悬 浮 生 长, 它 广 泛 用 于 增 殖 各 种 病 毒, 生 产 兽 用 疫 苗 最 常 用 的 是 BHK21 的 一 个 亚 克 隆 细 胞, 即 克 隆 13 或 C13 2. 二 倍 体 细 胞 有 什 么 特 点? 答 : 二 倍 体 细 胞 的 染 色 体 组 型 是 2n 核 型 ; 贴 壁 依 赖 接 触 抑 制 ; 一 般 可 传 代 50 代 ; 无 致 瘤 性 如 W1-38: 正 常 胚 肺 组 织 人 二 倍 体 细 胞 系 MRC-5: 从 正 常 男 性 肺 组 织 中 获 得 的 人 二 倍 体 细 胞 系 3. 什 么 是 动 物 细 胞 大 规 模 培 养? 答 : 所 谓 动 物 细 胞 大 规 模 培 养 技 术 (large-scale culture technology) 是 指 在 人 工 条 件 下 ( 设 定 ph 温 度 溶 氧 等 ), 在 细 胞 生 物 反 应 器 (bioreactor) 中 高 密 度 大 量 培 养 动 物 细 胞 用 于 生 产 生 物 制 品 的 技 术 目 前 可 大 规 模 培 养 的 动 物 细 胞 有 鸡 胚 猪 肾 猴 肾 地 鼠 肾 等 多 种 原 代 细 胞 及 人 二 倍 体 细 胞 CHO( 中 华 仓 鼠 卵 巢 ) 细 胞 BHK-21 Vero 细 胞 ( 非 洲 绿 猴 肾 传 代 细 胞 ) 等, 并 已 成 功 生 产 了 包 括 狂 犬 病 疫 苗 口 蹄 疫 疫 苗 甲 型 肝 炎 疫 苗 乙 型 肝 炎 疫 苗 红 细 胞 生 成 素 单 克 隆 抗 体 等 产 品 在 过 去 几 十 年 来, 细 胞 培 养 技 术 经 有 了 很 大 发 展, 从 使 用 转 瓶 (roller bottle) CellCube 等 贴 壁 细 胞 培 养, 发 展 为 生 物 反 应 器 (Bioreactor) 进 行 大 规 模 细 胞 培 养 4. 细 胞 体 内 外 培 养 的 差 别 是 什 么? 答 : 细 胞 离 体 后, 失 去 了 神 经 体 液 的 调 节 和 细 胞 间 的 相 互 影 响, 生 活 在 缺 乏 动 态 平 衡 相 对 稳 定 环 境 中, 日 久 天 长, 易 发 生 如 下 变 化 : 分 化 现 象 减 弱 ; 形 态 功 能 趋 于 单 一 化 或 生 存 一 定 时 间 后 衰 退 死 亡 ; 或 发 生 转 化 获 得 不 死 性, 变 成 可 无 限 生 长 的 连 续 细 胞 系 或 恶 性 细 胞 系 因 此, 培 养 中 的 细 胞 可 视 为 一 种 在 特 定 的 条 件 下 的 细 胞 群 体, 它 们 既 保 持 着 与 体 内 细 胞 相 同 的 基 本 结 构 和 功 能, 也 有 一 些 不 同 于 体 内 细 胞 的 性 状 实 际 上 从 细 胞 一 旦 被 置 于 体 外 培 养 后, 这 种 差 异 就 开 始 发 生 了 5. 什 么 是 无 血 清 培 养 基? 与 普 通 培 养 基 有 什 么 区 别? 答 : 无 血 清 培 养 基 (serum free medium,sfm): 是 不 需 要 添 加 血 清 就 可 以 维 持 细 胞 在 体 外 较 长 时 间 生 长 繁 殖 的 合 成 培 养 基 但 是 它 们 可 能 包 含 个 别 蛋 白 或 大 量 蛋 白 组 分 基 本 成 分 为 基 础 培 养 基 及 添 加 组 分 两 大 部 分 添 加 组 分 可 能 包 括 纤 连 蛋 白 层 粘 连 蛋 白 等 贴 壁 因 子 胰 岛 素 转 铁 蛋 白 硒 等
6. 什 么 是 无 血 清 无 动 物 组 分 培 养 基 无 蛋 白 培 养 基 和 限 定 化 学 成 分 培 养 基? 答 : 无 血 清 无 动 物 组 分 培 养 基 是 不 含 任 何 动 物 来 源 成 份 的 无 血 清 培 养 基, 但 可 能 添 加 植 物 蛋 白 或 重 组 蛋 白 无 蛋 白 培 养 基 (protein free midium,pfm): 即 不 含 有 蛋 白 的 培 养 基, 无 论 是 植 物 蛋 白 或 动 物 蛋 白 成 分 培 养 基 (chemical defined medium,cdm): 是 指 培 养 基 中 的 素 有 成 分 都 是 明 确 的, 它 同 样 不 含 有 蛋 白, 也 不 是 添 加 了 植 物 水 解 物, 而 是 使 用 了 一 些 已 知 结 构 与 功 能 的 小 分 子 化 合 物, 如 短 肽 等 这 种 培 养 基 更 有 利 于 分 析 细 胞 的 分 泌 产 物 和 产 品 纯 化 7.HEPES 在 细 胞 培 养 过 程 中 起 什 么 作 用? 答 :HEPES 溶 液 : 是 一 种 弱 酸, 中 文 名 字 是 羟 乙 基 哌 秦 乙 硫 磺 酸, 主 要 作 用 是 防 止 培 养 基 ph 迅 速 变 动 在 开 放 式 培 养 条 件 下, 观 察 细 胞 时 培 养 基 脱 离 了 5%CO2 的 环 境,CO2 气 体 迅 速 逸 出,pH 迅 速 升 高, 若 加 了 HEPES, 此 时 可 以 维 持 ph7.0 左 右 一 般 在 进 行 克 隆 化 培 养 时 要 添 加 HEPES 8.CO2 培 养 箱 之 水 盘 如 何 保 持 清 洁? 答 : 定 期 ( 至 少 每 两 周 一 次 ) 以 无 菌 蒸 馏 水 或 无 菌 去 离 子 水 更 换 之 二 培 养 基 生 产 和 使 用 常 见 问 题 1. 低 血 清 培 养 基 能 用 肉 眼 判 断 其 ph 值 吗? 答 : 低 血 清 培 养 基 中 酚 红 的 含 量 与 普 通 培 养 基 中 的 酚 红 含 量 不 同, 不 能 通 过 肉 眼 观 察 或 通 过 经 验 来 判 定 ph 值, 建 议 使 用 ph 计 进 行 测 定 2. 低 血 清 培 养 基 的 缓 冲 系 统 是 什 么? 答 : 平 衡 盐 一 般 是 由 无 机 盐 及 葡 萄 糖 组 成 的 平 衡 盐 有 Hanks 系 统 Earle s 系 统 Dulbecco s 磷 酸 缓 冲 盐 系 统 等 199 系 列 培 养 基 MEM 系 列 培 养 基 均 有 Hanks 系 统 的 培 养 基 及 Earle s 系 统 的 培 养 基 但 是 有 些 培 养 基 均 不 是 以 上 常 规 的 平 衡 盐 系 统, 例 如 RPMI 1640 培 养 基 F12 培 养 基 MEM(SLM) 低 血 清 培 养 基 的 平 衡 盐 系 统 也 不 是 常 规 的 平 衡 盐 系 统, 该 平 衡 盐 系 统 的 缓 冲 能 力 强 于 常 规 平 衡 盐 系 统 的 缓 冲 能 力 3. 谷 氨 酰 胺 溶 液 和 碳 酸 氢 钠 的 配 制 方 法 是 什 么? 答 : 以 0.2mol/L 的 L- 谷 氨 酰 胺 配 制 为 例 : 称 取 L- 谷 氨 酰 胺 2.92g, 加 注 射 用 水 100ml, 充 分 搅 拌 混 匀 用 0.2μm 滤 膜 正 压 过 滤 除 菌 溶 液 应 在 4 下 避 光 保 存,2 周 内 使 用 以 7.5% NaHCO3 的 配 制 为 例 : 称 取 NaHCO37.5g 溶 于 100ml 蒸 馏 水 中 过 滤 除 菌
4. 什 么 培 养 基 中 可 以 省 去 加 酚 红? 答 : 酚 红 在 培 养 基 中 用 作 ph 值 的 指 示 剂 : 中 性 时 为 红 色, 酸 性 时 为 黄 色, 碱 性 时 为 紫 色 酚 红 本 身 对 生 物 制 品 质 量 并 不 会 产 生 影 响, 可 以 通 过 纯 化 技 术 去 除, 但 酚 红 在 无 血 清 培 养 基 可 能 带 来 胞 内 钠 / 钾 失 衡, 影 响 细 胞 生 长, 当 然 这 种 作 用 能 被 血 清 所 中 和 或 减 轻 酚 红 并 不 是 培 养 基 中 必 需 的 一 种 成 分, 很 多 国 外 的 疫 苗 或 抗 体 生 产 企 业 在 生 产 过 程 中 都 使 用 无 酚 红 培 养 基 5. 放 置 在 冰 箱 中 的 培 养 基 颜 色 会 发 生 变 化, 为 什 么? 答 : 培 养 基 保 存 于 4 冰 箱 中, 培 养 基 内 CO2 会 逐 渐 溢 出, 造 成 培 养 基 越 来 越 偏 碱 性 而 培 养 基 中 酸 碱 指 示 剂 ( 通 常 为 phenol red) 的 颜 色 也 会 随 碱 性 增 加 而 更 偏 暗 红 培 养 基 偏 碱 后 再 用 于 细 胞 培 养 将 造 成 细 胞 生 长 停 滞 或 死 亡 培 养 基 偏 碱 时, 可 以 通 入 无 菌 过 滤 的 CO2, 以 调 整 ph 值 6. 无 血 清 培 养 与 有 血 清 培 养 使 用 的 抗 生 素 量 一 样 吗? 答 : 当 在 无 血 清 培 养 基 中 添 加 抗 生 素 时, 降 低 至 少 在 有 血 清 培 养 基 中 所 使 用 浓 度 的 50% 因 为 血 清 中 的 蛋 白 会 结 合 和 灭 活 一 些 抗 生 素 而 在 无 血 清 培 养 条 件 下, 抗 生 素 不 被 灭 活 7. 培 养 基 中 添 加 了 血 清 和 抗 生 素 后, 可 长 期 保 存 吗? 答 : 一 旦 您 在 新 鲜 培 养 基 中 添 加 了 血 清 和 抗 生 素 时, 您 应 该 在 两 到 三 周 内 使 用 它 因 为 一 些 抗 生 素 和 血 清 中 的 基 本 成 分 在 解 冻 后 就 开 始 降 解 8. 什 么 是 个 性 化 培 养 基? 它 有 什 么 优 点? 答 : 根 据 细 胞 类 型 培 养 方 式 和 生 产 工 艺 等 特 点 所 定 制 的 培 养 基, 即 个 性 化 培 养 基 个 性 化 培 养 基 在 国 外 生 物 制 药 企 业 被 普 遍 采 用, 个 性 化 培 养 基 可 以 为 细 胞 生 长 提 供 充 足 的 营 养 物 质, 能 提 高 细 胞 的 生 长 速 率 培 养 密 度 以 及 延 长 细 胞 维 持 时 间 ; 也 可 以 为 细 胞 生 长 提 供 均 衡 的 营 养 供 给, 减 少 细 胞 有 害 代 谢 物 质 的 积 累, 降 低 对 细 胞 生 长 的 危 害 ; 同 时 对 贴 壁 细 胞 而 言, 能 增 加 细 胞 的 贴 壁 性, 并 降 低 培 养 过 程 中 剪 切 力 对 细 胞 的 损 伤 ; 个 性 化 培 养 基 可 以 根 据 各 户 的 特 殊 需 求 减 少 或 不 使 用 动 物 源 成 分, 从 而 使 生 物 制 品 安 全 性 更 有 保 障 9. 细 胞 培 养 基 偶 然 被 冻, 可 否 继 续 使 用? 答 : 如 果 细 胞 培 养 基 偶 然 被 冻, 您 应 该 自 然 溶 解 培 养 基 并 观 察 是 否 有 沉 淀 产 生 如 果 没 有 沉 淀 产 生, 培 养 基 可 以 正 常 使 用, 如 果 出 现 沉 淀, 只 能 丢 弃 这 些 培 养 基 10. 细 胞 冷 冻 培 养 基 之 成 份 为 何?
答 : 动 物 细 胞 冷 冻 保 存 时 最 常 使 用 的 冷 冻 培 养 基 是 含 5-10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90-95% 原 来 细 胞 生 长 用 的 新 鲜 培 养 基 均 匀 混 合 注 意 : 由 于 DMSO 稀 释 时 会 放 出 大 量 热 能, 故 不 可 将 DMSO 直 接 加 入 细 胞 液 中, 必 须 使 用 前 先 行 配 制 完 成 11. 培 养 基 及 其 它 添 加 物 和 试 剂 可 反 复 冻 融 吗? 答 : 大 部 分 添 加 物 和 试 剂 最 多 可 以 冻 融 3 次, 如 果 次 数 过 多 会 将 使 含 有 的 蛋 发 生 降 解 和 沉 淀, 这 将 会 影 响 它 的 性 能 12. 液 体 培 养 基 的 保 存 是 冷 藏 好? 还 是 冷 冻 好? 答 : 要 冷 藏!! 通 常 液 体 培 养 基 在 冷 藏 条 件 下 可 存 放 6 个 月 到 一 年 三 常 见 血 清 使 用 问 题 1. 血 清 使 用 时 一 定 需 要 灭 活 么? 答 : 实 验 显 示, 经 过 正 确 处 理 的 热 灭 活 血 清 对 大 多 数 的 细 胞 而 言 是 不 需 要 的 经 此 处 理 过 的 血 清 对 细 胞 的 生 长 只 有 微 小 的 促 进, 或 完 全 没 有 任 何 作 用, 甚 至 因 为 高 温 处 理 影 响 了 血 清 的 质 量, 而 造 成 细 胞 生 长 速 率 的 降 低 而 经 过 热 处 理 的 血 清, 沉 淀 物 的 形 成 会 显 著 的 增 多, 这 些 沉 淀 物 在 倒 置 显 微 镜 下 观 察, 像 是 小 黑 点, 常 常 会 让 研 究 者 误 以 为 是 血 清 遭 受 污 染, 而 把 血 清 放 在 37 环 境 中, 又 会 使 此 沉 淀 物 更 增 多, 使 研 究 者 误 认 为 是 微 生 物 的 分 裂 扩 增 若 非 必 须, 可 以 不 需 要 做 热 处 理 这 一 步 不 但 节 省 时 间, 更 确 保 血 清 的 质 量 2. 何 谓 F, FCS, CS, HS? 答 :F (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是 相 同 的 意 思, 两 者 都 是 指 胎 牛 血 清, FCS 乃 错 误 的 使 用 字 眼, 请 不 要 再 使 用 CS (calf serum) 则 是 指 小 牛 血 清 HS (horseserum) 则 是 指 马 血 清 3. 保 存 血 清 最 好 的 方 法 是 什 么? 答 : 我 们 建 议 血 清 应 保 存 在 -5 至 -2O 若 存 放 于 4 时, 请 勿 超 过 一 个 月 若 一 次 无 法 用 完 一 瓶, 建 议 无 菌 分 装 血 清 至 恰 当 的 灭 菌 容 器 内, 再 放 回 冷 冻 4. 如 何 解 冻 血 清 才 不 会 使 产 品 质 量 受 损?
答 : 将 血 清 从 冷 冻 箱 取 出 后, 先 置 于 2~8 冰 箱 使 之 融 解, 然 后 在 室 温 下 使 之 全 融 但 必 须 注 意 的 是, 融 解 过 程 中 必 须 规 则 地 摇 晃 均 匀 5. 血 清 解 冻 后 发 现 有 絮 状 沉 淀 物 出 现, 该 如 何 处 理? 答 : 血 清 中 沉 淀 物 的 出 现 有 许 多 种 原 因, 但 最 普 遍 的 原 因 是 由 于 血 清 中 脂 蛋 白 的 变 性 所 造 成, 而 血 纤 维 蛋 白 ( 形 成 凝 血 的 蛋 白 之 一 ) 在 血 清 解 冻 后, 也 会 存 在 于 血 清 中, 亦 是 造 成 沉 淀 物 的 原 因 之 一 但 这 些 絮 状 沉 淀 物, 并 不 影 响 血 清 本 身 的 质 量 若 欲 去 除 这 些 絮 状 沉 淀 物, 可 以 将 血 清 分 装 至 无 菌 离 心 管 内, 以 400g 稍 微 离 心, 上 清 液 即 可 接 着 加 入 培 养 基 内 一 起 过 滤 最 好 不 使 用 过 滤 的 方 法 去 除 这 些 絮 状 沉 淀 物, 因 为 它 可 能 会 阻 塞 过 滤 膜 6. 如 何 避 免 血 清 中 沉 淀 物 的 产 生? 答 : (1) 解 冻 血 清 时, 请 按 照 所 建 议 的 逐 步 解 冻 法 (-20 至 4 至 室 温 ), 若 血 清 解 冻 时 改 变 的 温 度 太 大 ( 如 -20 至 37 ), 非 常 容 易 产 生 沉 淀 物 (2) 解 冻 血 清 时, 请 随 时 将 之 摇 晃 均 匀, 使 温 度 及 成 分 均 一, 减 少 沉 淀 的 发 生 (3) 请 勿 将 血 清 置 于 37 太 久 若 在 37 放 置 太 久, 血 清 会 变 得 混 浊, 同 时 血 清 中 许 多 较 不 稳 定 的 成 分 会 因 此 受 到 损 害, 而 影 响 血 清 的 质 量 (4) 血 清 的 热 灭 活 非 常 容 易 造 成 沉 淀 物 的 增 多, 若 非 必 要, 可 以 无 须 做 此 步 骤 (5) 若 必 须 做 血 清 的 热 灭 活, 请 遵 守 56,30 分 钟 的 原 则, 并 且 随 时 摇 晃 均 匀 温 度 过 高, 时 间 过 久 或 摇 晃 不 均 匀, 都 会 造 成 沉 淀 物 的 增 多 四 细 胞 培 养 常 用 试 剂 使 用 问 答 1. 谷 氨 酰 胺 使 用 方 法 是 什 么? 答 : 谷 氨 酰 胺 在 溶 液 中 很 不 稳 定, 故 4 下 放 置 1 周 可 分 解 50%, 使 用 中 最 好 单 独 配 制, 置 -20 冰 箱 中 保 存, 用 前 加 入 培 养 液 中 2. 碳 酸 氢 钠 在 室 温 条 件 存 放 是 否 稳 定? 答 : 碳 酸 氢 钠 白 色 粉 末, 或 不 透 明 单 斜 晶 系 细 微 结 晶 比 重 2.159 无 臭 味 咸, 可 溶 于 水, 微 溶 于 乙 醇 其 水 溶 液 因 水 解 而 呈 微 碱 性, 受 热 易 分 解, 在 65 以 上 迅 速 分 解, 在 270 时 完 全 失 去 二 氧 化 碳, 在 干 燥 空 气 中 无 变 化, 在 潮 湿 空 气 中 缓 慢 分 解 3. 培 养 细 胞 生 长 减 慢 的 原 因 有 哪 些? 其 解 决 办 法 有 哪 些?
答 : 可 能 得 原 因 有 : 更 换 了 不 同 的 培 养 液 或 血 清 ; 培 养 液 中 一 些 细 胞 生 长 必 需 成 分 如 谷 氨 酰 胺 或 生 长 因 子 等 耗 尽 或 缺 乏 或 已 被 破 坏 ; 培 养 物 中 有 少 量 细 菌 或 真 菌 污 染 ; 试 剂 保 存 不 当 ; 比 较 新 培 养 液 与 原 培 养 液 成 分, 比 较 新 血 清 与 旧 血 清 支 持 细 胞 生 长 实 验 找 出 可 能 的 原 因 解 决 办 法 : 增 加 起 始 培 养 细 胞 浓 度 ; 让 细 胞 逐 渐 适 应 新 培 养 液 ; 换 入 新 鲜 配 制 培 养 液 ; 补 加 谷 氨 酰 胺 或 生 长 因 子 等 ; 用 无 抗 生 素 培 养 液 培 养, 如 发 现 污 染, 丢 弃 培 养 物, 或 用 抗 生 素 除 菌 ; 血 清 需 保 存 在 -5 到 -20 ; 培 养 液 需 在 2-8 避 光 保 存 ; 含 血 清 完 全 培 养 液 在 2-8 保 存, 并 在 2 周 内 用 完 ; 分 离 培 养 物, 检 测 支 原 体 4.L- 谷 氨 酰 胺 在 细 胞 培 养 中 重 要 吗? 它 在 溶 液 中 不 稳 定 吗? 答 :L- 谷 氨 酰 胺 在 细 胞 培 养 时 非 常 重 要 的 脱 掉 氨 基 后,L- 谷 氨 酰 胺 可 作 为 培 养 细 胞 的 能 量 来 源 参 与 蛋 白 质 的 合 成 和 核 酸 代 谢 L- 谷 氨 酰 胺 在 溶 液 中 经 过 一 段 时 间 后 会 降 解, 降 解 率 随 保 存 温 度 而 变 L- 谷 氨 酰 胺 的 降 解 导 致 氨 的 形 成, 而 氨 对 于 一 些 细 胞 具 有 毒 性 5. 细 胞 传 代 消 化 时 所 用 胰 酶 浓 度 越 高 越 好 吗? 答 : 不 见 得! 因 为 胰 蛋 白 酶 溶 液 的 消 化 能 力 是 和 溶 液 的 ph 温 度 胰 酶 浓 度 及 溶 液 中 是 否 含 有 Ca++, Mg++ 离 子 和 血 清 等 因 素 有 关 通 常 情 况 下,pH 8.0, 温 度 37 oc 其 作 用 能 力 最 强 另 外, 钙 镁 离 子 及 血 清 均 能 大 大 降 低 其 消 化 能 力 我 们 每 次 进 行 传 代 消 化 前, 一 定 要 用 D-Hanks 液 或 液 反 复 冲 洗 细 胞 培 养 瓶, 以 便 于 将 含 血 清 的 培 养 基 冲 洗 干 净, 这 样 就 能 大 大 提 高 消 化 液 的 消 化 能 力 通 常 使 用 的 消 化 液 浓 度 为 : (1)0.05% 胰 蛋 白 酶 +0.02%EDTA; (2)0.25% 胰 蛋 白 酶 多 数 细 胞 传 代 消 化 可 使 用 0.25% 胰 蛋 白 酶 +0.02%EDTA 这 种 消 化 液 6. 二 价 离 子 抑 制 胰 蛋 白 酶 活 性 吗? 使 用 胰 蛋 白 酶 时 加 入 EDTA 的 目 的 是 什 么? 答 : 二 价 离 子 的 确 抑 制 胰 蛋 白 酶 活 性 EDTA 用 来 螯 合 游 离 的 镁 离 子 和 钙 离 子, 以 便 保 持 抑 制 胰 蛋 白 酶 的 活 性 建 议 胰 蛋 白 酶 处 理 细 胞 前, 用 EDTA 清 洗 细 胞, 以 消 除 来 自 培 养 基 中 所 有 的 二 价 离 子 7.GlutaMAX-I 是 什 么? 培 养 细 胞 如 何 利 用 GlutaMAX-I? 这 个 二 肽 有 多 稳 定? 答 :GlutaMAX-I 即 谷 丙 氨 酸 二 肽, 是 一 个 L- 谷 氨 酰 胺 的 衍 生 物, 其 不 稳 定 的 alpha- 氨 基 用 L- 丙 氨 酸 来 保 护 一 种 肽 酶 逐 渐 裂 解 二 肽, 释 放 L- 谷 氨 酰 胺 供 利 用 GlutaMAX-I 二 肽 非 常 稳 定, 即 使 在 121 磅 灭 菌 20 分 钟,GlutaMAX-I 二 肽 溶 液 有 最 小 的 降 解, 如 果 在 相 同 条 件 下,L- 谷 氨 酰 胺 几 乎 完 全 降 解 8. 培 养 基 中 丙 酮 酸 钠 的 作 用 是 什 么?
答 : 丙 酮 酸 钠 可 以 作 为 细 胞 培 养 中 的 替 代 碳 源, 尽 管 细 胞 更 倾 向 于 以 葡 萄 糖 作 为 碳 源, 但 是, 如 果 没 有 葡 萄 糖 的 话, 细 胞 也 可 以 代 谢 丙 酮 酸 钠 9.Hank s 平 衡 盐 溶 液 (H) 和 Earle s 平 衡 盐 溶 液 (E) 有 什 么 本 质 的 功 能 差 别? 答 :H 和 E 的 主 要 差 别 在 于 碳 酸 氢 钠 的 水 平, 在 Eagle s (2.2g/L) 中 比 在 Hanks (0.35g/L) 中 高 碳 酸 氢 钠 需 用 高 水 平 的 CO2 平 衡, 以 维 持 溶 液 的 PH 值 Eagle s 液 在 空 气 水 平 的 CO2 中, 溶 液 会 变 碱,Hanks 液 在 CO2 培 养 箱 中 会 变 酸 如 果 希 望 在 CO2 培 养 箱 中 保 存 组 织, 需 要 用 Eagle s 液 如 果 仅 仅 是 清 洗 将 要 在 细 胞 培 养 基 中 储 存 的 组 织, 用 Hanks 液 就 可 以 了 五 细 胞 培 养 过 程 常 见 问 题 1. 为 什 么 培 养 的 细 胞 要 及 时 传 代? 答 : 体 外 培 养 的 细 胞 大 多 具 有 生 长 接 触 抑 制 的 特 性, 也 就 是 说 当 一 个 细 胞 被 其 他 细 胞 包 围 的 时 候, 它 就 会 停 止 生 长, 及 时 传 代 后, 细 胞 的 生 长 得 以 继 续 2. 培 养 液 ph 下 降 很 快 可 能 原 因 有 哪 些? 其 解 决 办 法 是 什 么? 答 : 通 常 细 胞 生 长 得 非 常 快 时,pH 值 通 常 下 降 得 很 快 此 时 可 以 及 时 传 代 提 高 传 代 比 例 或 降 低 血 清 量 等 方 法 进 行 解 决 此 外, 培 养 瓶 盖 拧 得 太 紧 NaHCO3 缓 冲 系 统 缓 冲 能 力 不 够 培 养 液 中 盐 浓 度 不 正 确 细 菌 酵 母 或 真 菌 污 染 等 也 能 导 致 ph 值 通 常 下 降 得 很 快 (1) 按 培 养 液 中 NaHCO3 浓 度 增 加 或 减 少 培 养 箱 内 CO2 浓 度,2.0g/L 到 3.7g/L 浓 度 NaHCO3 对 应 CO2 浓 度 为 5% 到 10% (2) 改 用 不 依 赖 CO2 培 养 液 (3) 松 开 瓶 盖 1/4 圈 加 HEPES 缓 冲 液 至 10 到 25mM 终 浓 度 (4) 在 CO2 培 养 环 境 中 改 用 基 于 Earle s 盐 配 制 的 培 养 液, 在 大 气 培 养 环 境 中 培 养 改 用 Hanks 盐 配 制 的 培 养 液 (5) 如 果 是 污 染 造 成 的 则 丢 弃 培 养 物 或 用 抗 生 素 除 菌 3. 培 养 液 ph 对 细 胞 生 长 的 影 响? 答 : 由 于 大 多 数 细 胞 适 宜 ph 为 7.2-7.4, 偏 离 此 范 围 可 能 对 细 胞 生 长 将 产 生 有 害 的 影 响 但 各 种 细 胞 对 ph 的 要 求 也 不 完 全 相 同, 原 代 培 养 细 胞 一 般 对 ph 变 动 耐 受 差, 无 限 细 胞 系 耐 受 力 强 但 总 体 来 说, 细 胞 耐 酸 性 比 耐 碱 性 强 一 些 在 配 制 培 养 用 液 时, 需 要 注 意 一 点 : 培 新 配 的 培 养 基 在 经 过 0.10um 或 0.22um 滤 膜 过 滤 时, 溶 液 的 ph 还 会 向 上 浮 动 0.2 左 右 4. 购 买 之 细 胞 冷 冻 管 经 解 冻 后, 为 何 会 发 生 细 胞 数 目 太 少 之 情 形?
答 : 研 究 人 员 在 冷 冻 细 胞 之 培 养 时 出 现 细 胞 数 目 太 少, 大 都 是 因 为 离 心 过 程 操 作 上 的 失 误, 造 成 细 胞 的 物 理 性 损 伤, 以 及 细 胞 流 失 建 议 细 胞 解 冻 后 不 要 立 刻 离 心, 应 待 细 胞 生 长 隔 夜 后 再 更 换 培 养 基 即 可 但 对 于 DMSO 敏 感 的 细 胞, 还 是 复 苏 细 胞 时, 用 离 心 去 除 DMSO 比 较 好 5. 购 买 之 细 胞 死 亡 或 细 胞 存 活 率 不 佳 可 能 原 因? 答 : 研 究 人 员 在 细 胞 培 养 时 出 现 存 活 率 不 佳, 原 因 比 较 复 杂, 常 见 原 因 可 归 纳 为 : 培 养 基 使 用 错 误 或 培 养 基 品 质 不 佳 ; 血 清 使 用 错 误 或 血 清 的 品 质 不 佳 ; 解 冻 过 程 错 误 ; 冷 冻 细 胞 解 冻 后, 加 以 洗 涤 细 胞 和 离 心 ; 悬 浮 细 胞 误 认 为 死 细 胞 ; 培 养 温 度 使 用 错 误 ; 细 胞 置 于 80 太 久 等 建 议 严 格 参 照 ATCC 或 ECACC 的 标 准 操 作 规 程 进 行 细 胞 复 苏 冻 存 等 工 作 6. 支 原 体 污 染 会 对 细 胞 培 养 有 何 影 响? 答 : 支 原 体 污 染 几 乎 可 影 响 所 有 细 胞 之 生 长 参 数 代 谢 及 研 究 之 任 一 数 据 故 进 行 实 验 前, 必 须 确 认 细 胞 为 mycoplasma-free, 实 验 结 果 之 数 据 方 有 意 义 7. 冷 冻 保 存 细 胞 之 方 法? 答 : 冷 冻 保 存 方 法 一 : 冷 冻 管 置 于 4 (30-60 分 钟 ) -20 ( 30 分 钟 ) -80 (16-18 小 时 或 隔 夜 ) 液 氮 罐 长 期 储 存 冷 冻 保 存 方 法 二 : 冷 冻 管 置 于 已 设 定 程 序 之 可 程 序 降 温 机 中 每 分 钟 降 1-3 至 80 以 下, 再 放 入 液 氮 中 长 期 储 存 注 意 :-20 不 可 超 过 1 小 时, 以 防 止 冰 晶 过 大, 造 成 细 胞 大 量 死 亡, 亦 可 跳 过 此 步 骤 直 接 放 入 -80 冰 箱 中, 惟 存 活 率 稍 微 降 低 一 些 8. 悬 浮 细 胞 应 如 何 继 代 处 理? 答 : 一 般 仅 需 持 续 加 入 新 鲜 培 养 基 于 原 培 养 瓶 中, 稀 释 细 胞 浓 度 即 可 若 培 养 液 太 多 时 可 分 瓶 取 出 一 部 份 含 细 胞 之 培 养 液 至 另 一 新 的 培 养 瓶 中, 加 入 新 鲜 培 养 基 稀 释 至 适 当 浓 度, 重 复 前 述 步 骤 即 可 9. 欲 将 一 般 动 物 细 胞 离 心 下 来, 其 离 心 速 率 应 为 多 少 转 速? 答 : 欲 回 收 动 物 细 胞, 其 离 心 速 率 一 般 为 300 g ( 约 1,000rpm),5-10 分 钟, 过 高 之 转 速 过 长 时 间 都 将 造 成 细 胞 死 亡 合 适 的 离 心 转 速 是 根 据 相 对 离 心 决 定 RCF=1.119 105 r (rpm)2, 其 中 r 为 离 心 机 转 轴 中 心 与 离 心 套 管 底 部 内 壁 的 距 离 ;rpm 为 离 心 机 每 分 钟 的 转 数 ;RCF(relative eentrifugal force) 为 相 对 离 心 力, 以 重 力 加 速 度 g(980.66cm/s2) 的 倍 数 来 表 示 表 示 单 位
10. 培 养 细 胞 时 应 使 用 5% 还 是 10%CO2, 或 者 根 本 没 有 影 响? 答 : 一 般 培 养 基 中 大 都 使 用 HCO3-/CO32-/H+ 作 为 ph 的 缓 冲 系 统, 而 培 养 基 中 NaHCO3 的 含 量 将 决 定 细 胞 培 养 时 应 使 用 的 CO2 浓 度 当 培 养 基 中 NaHCO3 含 量 为 每 公 升 3.7g 时, 细 胞 培 养 时 应 使 用 10% CO2; 当 培 养 基 中 NaHCO3 为 每 公 升 1.5g 时, 则 应 使 用 5%CO2 培 养 细 胞 11. 细 胞 冷 冻 管 解 冻 培 养 时, 是 否 应 马 上 去 除 DMSO? 答 : 除 少 数 特 别 注 明 对 DMSO 敏 感 之 细 胞 外, 绝 大 部 分 细 胞 株 ( 包 括 悬 浮 性 细 胞 ), 在 解 冻 之 后, 应 直 接 放 入 含 有 10-15ml 新 鲜 培 养 基 之 培 养 方 瓶 中, 待 隔 天 再 置 换 新 鲜 培 养 基 以 去 除 DMSO 即 可, 如 此 可 避 免 大 部 分 解 冻 后 细 胞 无 法 生 长 或 贴 附 之 问 题 12. 冷 冻 管 应 如 何 解 冻? 答 : 取 出 冷 冻 管 后, 须 立 即 放 入 37 水 槽 中 快 速 解 冻, 轻 摇 冷 冻 管 使 其 在 1-2 分 钟 内 大 部 分 融 化, 特 别 注 意, 需 残 留 一 小 块 冰 块, 就 可 拿 到 超 净 工 作 台 操 作 细 胞, 用 75% 消 毒 冻 存 管, 用 新 鲜 培 养 基 将 细 胞 转 移 至 培 养 瓶 另 外 冷 冻 管 由 液 氮 桶 中 取 出 解 冻 时, 必 须 注 意 安 全, 预 防 冷 冻 管 之 爆 裂 13. 如 何 用 台 盼 兰 计 数 活 细 胞? 答 : 将 样 品 适 当 稀 释 后, 用 稀 释 后 的 样 品 和 0.4% 的 台 盼 兰 溶 液 按 1:1 混 合 后, 用 移 液 枪 点 样 到 血 球 计 数 板, 置 于 倒 置 显 微 镜 下 观 察 计 数, 其 中 蓝 色 细 胞 是 死 细 胞, 因 活 细 胞 排 斥 台 盼 兰, 不 被 染 色 14. 细 胞 欲 冷 冻 保 存 时, 细 胞 冷 冻 管 内 应 有 多 少 细 胞 浓 度? 答 : 冷 冻 管 内 细 胞 数 目 一 般 为 1-8 106 cells/ml vial 15. 细 胞 冷 冻 培 养 基 之 成 份 为 何? 答 : 动 物 细 胞 冷 冻 保 存 时 最 常 使 用 的 冷 冻 培 养 基 是 含 9-10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90-95 % 原 来 细 胞 生 长 用 之 新 鲜 培 养 基 均 匀 混 合 之 注 意 : 由 于 DMSO 稀 释 时 会 放 出 大 量 热 能, 故 不 可 将 DMSO 直 接 加 入 细 胞 液 中, 必 须 使 用 前 先 行 配 制 完 成 16. 如 何 消 除 组 织 培 养 的 污 染? 答 : 当 重 要 的 培 养 细 胞 污 染 时, 研 究 者 可 能 试 图 消 除 或 控 制 污 染 首 先, 确 定 污 染 物 是 细 菌 真 菌 支 原 体 或 酵 母, 把 污 染 细 胞 与 其 它 细 胞 系 隔 离 开, 用 实 验 室 消 毒 剂 消 毒 培 养 器 皿 和 超 净 台, 检 查 HEPA 过 滤 器
高 浓 度 的 抗 生 素 和 抗 霉 菌 素 可 能 对 一 些 细 胞 系 有 毒 性, 因 而, 做 剂 量 反 应 实 验 确 定 抗 生 素 和 抗 霉 菌 素 产 生 毒 性 的 剂 量 水 平 这 点 在 使 用 抗 生 素 如 两 性 霉 素 B 和 抗 霉 菌 素 如 泰 乐 菌 素 时 尤 其 重 要 下 面 是 推 荐 的 确 定 毒 性 水 平 和 消 除 培 养 污 染 的 实 验 步 骤 1) 在 无 抗 生 素 的 培 养 基 中 消 化 计 数 和 稀 释 细 胞, 稀 释 到 常 规 细 胞 传 代 的 浓 度 2) 分 散 细 胞 悬 液 到 多 孔 培 养 板 中, 或 几 个 小 培 养 瓶 中 在 一 个 浓 度 梯 度 范 围 内, 把 选 择 抗 生 素 加 入 到 每 一 个 孔 中 例 如, 两 性 霉 素 B 推 荐 下 列 浓 度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml 3) 每 天 观 测 细 胞 毒 性 指 标, 如 脱 落, 出 现 空 泡, 汇 合 度 下 降 和 变 圆 4) 确 定 抗 生 素 毒 性 水 平 后, 使 用 低 于 毒 性 浓 度 2-3 倍 浓 度 的 抗 生 素 的 培 养 液 培 养 细 胞 2-3 代 5) 在 无 抗 生 素 的 培 养 基 中 培 养 细 胞 一 代 6) 重 复 步 骤 4 7) 在 无 抗 生 素 的 培 养 基 中 培 养 4-6 代, 确 定 污 染 是 否 以 已 被 消 除 17. 培 养 细 胞 出 现 死 亡 其 可 能 的 原 因 有 什 么? 解 决 办 法 有 哪 些? 答 : 可 能 的 原 因 有 培 养 箱 内 无 CO2; 培 养 箱 内 温 度 波 动 太 大 ; 细 胞 冻 存 或 复 苏 过 程 中 损 伤 ; 培 养 液 渗 透 压 不 正 确 ; 培 养 液 种 有 毒 代 谢 产 物 堆 积 等 解 决 办 法 可 以 检 测 培 养 箱 内 CO2 浓 度, 检 查 培 养 箱 内 温 度 ; 取 新 的 保 存 细 胞 种 ; 检 测 培 养 液 渗 透 压 等 ; 换 入 新 鲜 培 养 液 等 18. 国 内 可 以 买 到 细 胞 株 的 地 方 有 哪 些? 答 : 可 以 从 国 内 多 家 代 理 厂 家 买 到 ATCC 或 ECACC 的 细 胞 株, 同 时 国 内 可 以 买 到 细 胞 株 的 地 方 还 有 中 国 医 学 科 学 院 ( 协 和 医 科 大 学 ) 基 础 医 学 部, 中 国 科 学 院 细 胞 研 究 所 以 及 武 汉 大 学 冷 藏 中 心 等 19. 细 胞 的 渗 透 压 耐 受 性 是 多 少? 答 : 细 胞 必 须 生 活 在 等 渗 环 境 中, 大 多 数 培 养 细 胞 对 渗 透 压 有 一 定 耐 受 性 人 血 浆 渗 透 压 290mOsm/kg, 可 视 为 培 养 人 体 细 胞 的 理 想 渗 透 压 鼠 细 胞 渗 透 压 在 320mOsm/kg 左 右 对 于 大 多 数 哺 乳 动 物 细 胞, 渗 透 压 在 260-320mOsm/kg 的 范 围 都 适 宜 20. 支 原 体 (mycoplasma) 污 染 的 细 胞, 是 否 能 以 肉 眼 观 察 出 异 状? 答 : 不 能 除 极 有 经 验 之 专 家 外, 大 多 数 遭 受 支 原 体 污 染 的 细 胞 株, 无 法 以 其 外 观 分 辨 之 21. 怎 样 查 到 一 个 特 定 细 胞 株 的 相 关 知 识 和 培 养 条 件? 答 :ATCC (American Type Culture Collection) 收 集 了 绝 大 多 数 细 胞 的 详 细 资 料 打 开 ATCC 网 页 的 Cells and hybridomas 链 接, 输 入 细 胞 名 称 就 可 以 搜 索 ATCC 的 细 胞 数 据 库 数 据 库 中 有 每 一 种 细 胞 的 详 细 描 述, 包 括 细 胞 的 来 源, 培 养 和 冻 存 条 件, 以 及 相 关 文 献 等 资 料
22. 为 什 么 要 在 溶 解 的 一 周 内 使 用 贮 存 在 4 冰 箱 中 的 液 体 胰 蛋 白 酶 溶 液? 答 : 胰 蛋 白 酶 在 4 就 可 能 开 始 降 解, 如 果 在 室 温 下 放 置 超 过 30 分 钟, 就 会 变 得 不 稳 定