园 艺 学 报 2013,40(2):255 264 Acta Horticulturae Sinica http: // www. ahs. ac. cn E-mail: yuanyixuebao@126.com 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 * 马 宁 宁, 李 天 来 ( 沈 阳 农 业 大 学 园 艺 学 院, 辽 宁 省 设 施 园 艺 重 点 实 验 室, 沈 阳 110866) 摘 要 : 利 用 PCR-DGGE 技 术, 研 究 了 裸 地 及 不 同 连 作 年 限 的 设 施 番 茄 栽 培 土 壤 中 细 菌 和 真 菌 的 群 落 结 构 及 多 样 性 的 变 化 情 况 结 果 表 明 : 设 施 条 件 下 种 植 番 茄 明 显 改 变 了 土 壤 土 著 细 菌 的 群 落 结 构, 但 连 作 年 限 对 土 壤 细 菌 多 样 性 影 响 较 小, 细 菌 群 落 结 构 变 化 不 大 ; 土 著 真 菌 的 群 落 结 构 稳 定 性 优 于 土 著 细 菌, 但 土 壤 真 菌 的 优 势 种 群 在 不 同 连 作 年 限 的 土 样 中 变 化 较 大, 连 作 显 著 降 低 了 某 些 真 菌 的 数 量, 同 时 显 著 增 加 了 另 一 些 真 菌 的 数 量, 其 中, 连 作 20 年 番 茄 的 土 壤 真 菌 新 出 现 的 优 势 种 群 最 多, 且 与 非 优 势 种 群 的 真 菌 数 量 差 异 较 大, 这 种 番 茄 连 作 后 改 变 土 壤 真 菌 种 群 平 衡 的 现 象 可 能 是 导 致 番 茄 产 生 连 作 障 碍 的 重 要 原 因 之 一 通 过 电 泳 条 带 的 回 收 测 序, 可 知 所 取 土 样 中 的 细 菌 优 势 种 群 属 于 Clostridium butyricum Uncultured bacterium Bacillus 和 Arthrobacter, 真 菌 优 势 种 群 属 于 Saccobolus dilutellus Uncultured fungus Lasiobolus ciliatus Spooneromyces laeticolor 和 Lasiobolidium orbiculoides 关 键 词 : 番 茄 ; 长 期 连 作 ; 土 壤 微 生 物 ;PCR-DGGE; 群 落 结 构 ; 多 样 性 中 图 分 类 号 :S 641.2 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :0513-353X(2013)02-0255-10 Effect of Long-term Continuous Cropping of Protected Tomato on Soil Microbial Community Structure and Diversity MA Ning-ning and LI Tian-lai * (College of Horticulture,Shenyang Agricultural University,Liaoning Province Key Laboratory of Protected Horticulture, Shenyang 110866,China) Abstract:Community structure and diversity of microorganism in bare soil and continuous cropping protected tomato field were studied with PCR-DGGE technology. Results showed that soil indigenous bacterial community structure was significantly influenced by planting tomato under protected field,but soil bacterial community structure and diversity were not sensitive to continuous cropping years. Compared with soil indigenous bacteria,indigenous fungal community structure was more steady,but the dominant fungi were more different in the fields with different continuous cropping years,continuous cropping significantly decreased the number of some fungi,meanwhile,the number of some other fungi was significantly increased,most dominant fungi populations were enriched in soil with tomato continuous cropping years of 20,and which number was quite different with the non-dominant fungi populations. The 收 稿 日 期 :2012 09 06; 修 回 日 期 :2013 01 09 基 金 项 目 : 十 二 五 国 家 科 技 支 撑 计 划 项 目 (2011BAD12B03); 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专 项 资 金 项 目 (CARS-25); 辽 宁 省 重 大 科 技 攻 关 项 目 (2011215003); 沈 阳 市 农 业 科 技 发 展 专 项 (F11-092-3-00) * 通 信 作 者 Author for correspondence(e-mail:tianlaili@126.com)
256 园 艺 学 报 40 卷 change of soil fungi population balance that caused by tomato continuous cropping maybe one of the important reasons for the tomato continuous cropping obstacle. Recycling and sequence analysis of prominent electrophoretic bands showed that the dominant bacteria of soil sample belong to Clostridium butyricum,uncultured bacterium,bacillus and Arthrobacter,while the dominant fungus belong to Saccobolus dilutellus,uncultured fungus,lasiobolus ciliatus,spooneromyces laeticolor and Lasiobolidium orbiculoides. Key words:tomato;long-term continuous cropping;soil microbial;pcr-dgge;community structure;diversity 番 茄 是 设 施 栽 培 中 重 要 蔬 菜 作 物 之 一, 通 常 连 作 较 为 普 遍, 从 而 导 致 土 壤 退 化, 产 量 和 品 质 下 降 ( 吴 凤 芝 等,1997) 土 壤 微 生 物 是 土 壤 生 态 系 统 中 最 重 要 和 最 活 跃 的 组 分, 它 控 制 着 土 壤 生 态 系 统 功 能 的 许 多 关 键 过 程, 在 促 进 土 壤 养 分 转 化 循 环 维 持 系 统 稳 定 性 以 及 可 持 续 利 用 中 占 主 导 地 位 ( 章 家 恩 和 廖 宗 文,2000;Schutter et al.,2001), 可 以 说 土 壤 微 生 物 的 变 化 是 产 生 作 物 连 作 障 碍 的 主 要 因 素 因 此, 研 究 设 施 作 物 连 作 土 壤 微 生 物 的 变 化 规 律, 对 于 进 一 步 研 究 解 决 作 物 连 作 障 碍 问 题 具 有 重 要 意 义 传 统 的 土 壤 微 生 物 研 究 主 要 采 用 分 离 培 养 法, 但 这 种 方 法 能 够 分 离 培 养 出 来 的 微 生 物 十 分 有 限, 大 量 微 生 物 不 能 分 离 培 养 出 来, 因 此, 影 响 研 究 结 果 的 正 确 性 近 年 来, 采 用 分 子 生 物 学 技 术 研 究 土 壤 微 生 物 的 报 道 越 来 越 多, 其 中 吴 凤 芝 和 王 学 征 (2007) 采 用 RAPD 技 术 研 究 黄 瓜 土 壤 微 生 物 群 落 物 种 多 样 性 Buchan 等 (2003) 采 用 T-RFLP 技 术 研 究 沼 泽 枯 草 腐 败 过 程 中 细 菌 和 真 菌 的 群 落 动 态 演 替 及 优 势 种 群, 宋 亚 娜 和 林 智 敏 (2010) 采 用 PCR-DGGE 技 术 研 究 水 稻 生 长 过 程 中 稻 田 土 壤 氨 氧 化 细 菌 和 氨 氧 化 古 菌 群 落 结 构 的 变 化 等 均 取 得 较 好 结 果 本 研 究 中 以 番 茄 不 同 连 作 年 限 土 壤 为 材 料, 采 用 PCR-DGGE 技 术, 分 析 土 壤 微 生 物 的 群 落 结 构, 旨 在 明 确 设 施 栽 培 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 的 演 替 规 律, 为 克 服 连 作 障 碍 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 土 壤 样 品 供 试 土 样 采 自 沈 阳 市 于 洪 区 马 三 家 镇 拉 马 台 村 种 植 番 茄 的 日 光 温 室, 该 村 早 在 20 世 纪 80 年 代 中 期 就 进 行 了 温 室 蔬 菜 栽 培, 番 茄 的 栽 培 生 产 历 史 长, 栽 培 模 式 和 管 理 措 施 较 为 规 范 统 一, 番 茄 一 年 两 茬, 每 茬 6 穗 果, 底 肥 为 粪 肥 复 合 肥 配 施, 冲 施 肥 追 肥, 无 大 规 模 病 害 发 生 2009 年 4 月 选 择 该 村 连 续 种 植 番 茄 4 7 10 15 和 20 年 的 日 光 温 室, 按 照 5 点 取 样 法 采 集 番 茄 冠 幅 内 0 ~ 20 cm 的 耕 层 土 壤, 同 时 以 温 室 附 近 未 种 植 任 何 作 物 的 露 地 0 ~ 20 cm 土 壤 为 对 照, 置 于 无 菌 袋 内 带 回 实 验 室, 过 2 mm 土 筛 后 于 80 保 存 备 用 1.2 研 究 方 法 1.2.1 土 壤 微 生 物 基 因 组 DNA 的 提 取 和 纯 化 土 壤 微 生 物 DNA 的 提 取 在 吴 敏 娜 等 (2007) 的 方 法 基 础 上 略 有 改 进 称 取 0.5g 土 样 及 0.5g 灭 菌 后 的 石 英 砂 于 核 酸 提 取 管 中, 加 入 850 μl 提 取 缓 冲 液 (100 mmol L -1 Tris-HCl,pH 8.0,100 mmol L -1 钠 EDTA,pH 8.0;100 mmol L -1 磷 酸 钠,pH 8.0;1.5 mol L -1 NaCl;1% CTAB), 涡 旋 振 荡 1 min 后 用 核 酸 提 取 仪 振 荡 30 s, 加 入 50 μl 溶 菌 酶 (100 mg ml -1 ) 50 μl 蜗 牛 酶 (120
2 期 马 宁 宁 等 : 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 257 mg ml -1 ) 和 50 μl 纤 维 素 酶 (120 mg ml -1 ),37 温 浴 振 荡 1 h; 加 入 100 μl 20% SDS, 混 匀 后 65 恒 温 处 理 30 min, 每 10 min 振 荡 1 次,12 000 r min -1 离 心 10 min; 取 上 清 液 加 入 0.2 倍 体 积 的 KAc(8 mol L -1 ), 冰 浴 20 min 后 14 000 r min -1 离 心 20 min; 取 上 清 液 加 入 0.5 倍 体 积 的 PEG (20%) 和 0.1 倍 体 积 的 NaCl(5 mol L -1 ), 混 匀, 室 温 放 置 1 h 后 14 000 r min -1 离 心 10 min; 弃 去 上 清 液, 沉 淀 物 用 500 μl 70% 的 预 冷 乙 醇 充 分 漂 洗,14 000 r min -1 离 心 10 min; 待 乙 醇 完 全 干 燥 后 加 入 700 μl TE 和 等 体 积 的 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 (25..24..1), 充 分 混 合 后 12 000 r min -1 离 心 10 min; 取 水 相 再 加 入 等 体 积 的 氯 仿 / 异 戊 醇 (24..1) 抽 提 1 遍,12 000 r min -1 离 心 10 min; 取 水 相 上 清 液, 加 入 0.1 倍 体 积 的 NaAc(3 mol L -1 ) 和 0.6 倍 体 积 的 预 冷 异 丙 醇, 混 匀 后 室 温 放 置 1 h,14 000 r min -1 离 心 10 min; 弃 上 清 液, 沉 淀 物 用 500 μl 70% 的 预 冷 乙 醇 充 分 漂 洗 后 溶 于 50 μl TE 中, 得 到 DNA 粗 提 液 粗 提 DNA 样 品 用 博 大 泰 克 (BioDev) 的 B 型 小 量 DNA 片 段 快 速 纯 化 回 收 试 剂 盒 纯 化 后 20 保 存 用 0.8% 的 琼 脂 糖 凝 胶 检 测 DNA 的 完 整 性, 以 λ-hind Ⅲ digest( 购 自 TaKaRa) 作 为 Marker 1.2.2 样 品 DNA 的 PCR 扩 增 分 别 采 用 细 菌 通 用 引 物 341f-GC/U758(Phillips et al.,2008) 和 真 菌 通 用 引 物 403f/662r-GC(Diouf et al.,2006) 对 土 壤 微 生 物 总 DNA 进 行 PCR 扩 增, 引 物 具 体 信 息 如 表 1 所 示 细 菌 PCR 扩 增 反 应 条 件 是 94 预 变 性 4 min,94 变 性 1 min,55 退 火 1 min,72 延 伸 45 s, 每 个 循 环 加 1 s, 共 35 个 循 环, 之 后 72 延 伸 10 min 真 菌 PCR 扩 增 反 应 条 件 是 94 预 变 性 5 min,94 变 性 1 min, 50 退 火 40 s,72 延 伸 1 min, 共 35 个 循 环,72 延 伸 10 min 引 物 341f 和 662r 的 5 端 分 别 加 GC 夹 用 来 防 止 DNA 片 段 在 进 行 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 时 过 早 解 链 细 菌 和 真 菌 的 PCR 反 应 体 系 均 为 50 μl, 其 组 成 为 DNA 模 板 1 μl,10 PCR 反 应 缓 冲 液 5 μl,2.5 mmol L -1 dntp 混 合 液 4 μl, 20 pmol L -1 前 后 引 物 各 1 μl,5 U μl -1 Taq 酶 0.4 μl, 加 灭 菌 去 离 子 水 至 总 体 积 为 50 μl Table 1 表 1 PCR 扩 增 引 物 Primers used for PCR amplification 目 的 序 列 Target sequence 细 菌 16S V3-V4 Bacterial 16S V3-V4 引 物 Primer 341f-GC * 引 物 序 列 (5 3 ) Primer sequence(5 3 ) CCTACGGGAGGCAGCAG U758 CTACCAGGGTATCTA ATCC 真 菌 28S Fungal 28S 403f GTGAAATTGTTGAAAGGGAA 260 662r-GC * GACTCCTTGGTCCGTGTT * GC 夹 (GC clamp):5 -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3. 片 段 长 度 /bp Fragment size 417 1.2.3 PCR 产 物 的 DGGE DGGE 采 用 D-Code system(bio-rad Laboratories Inc,Hercules,CA,USA), 细 菌 和 真 菌 分 别 采 用 6% 和 8% 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶, 变 性 梯 度 均 为 30% ~ 60%(100% 变 性 相 当 于 7 mol L -1 尿 素 和 40% 去 离 子 甲 酰 胺 ),PCR 产 物 上 样 量 为 40 μl, 在 1 TAE 缓 冲 液 中 (40 mmol L -1 Tris,20 mmol L -1 冰 乙 酸,1 mmol L -1 Na 2 -EDTA),60 恒 温,200 V 电 压 条 件 下 电 泳 5 h, 电 泳 后, 用 Genefinder 染 料 (1 TAE 稀 释 10 000 倍 ) 染 色 40 min, 然 后 利 用 Bio-Rad 凝 胶 成 像 系 统 拍 照 1.2.4 DGGE 图 谱 优 势 条 带 的 回 收 和 测 序 将 经 过 Genefinder 染 色 照 相 后 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 置 于 紫 外 灯 下, 用 灭 菌 的 手 术 刀 片 小 心 切 下 凝 胶 中 较 为 明 亮 清 晰 的 条 带, 用 无 菌 的 去 离 子 水 冲 洗 掉 残 留 的 染 色 剂 后 将 胶 条 完 全 浸 于 30 μl TE 中, 4 放 置 过 夜, 使 胶 条 中 的 DNA 片 段 溶 出 以 DNA 浸 出 液 为 模 板, 分 别 用 相 应 的 细 菌 带 夹 引 物 341f-GC/U758 和 真 菌 带 夹 引 物 403f/662r-GC 按 照 前 述 程 序 进 行 PCR 扩 增, 扩 增 产 物 再 用 DGGE 验 证 扩 增 片 段 与 所 回 收 条 带 的 电 泳 行 为 是 否 一 致, 确 定 回 收 条 带 的 正 确 位 置 后, 按 照 前 面 所 述 的 方 法
258 园 艺 学 报 40 卷 再 次 切 胶, 以 回 收 后 的 DNA 为 模 板, 用 不 带 夹 的 引 物 341f/U758 和 403f/662r 再 进 行 PCR 扩 增, 扩 增 产 物 送 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 (TaKaRa) 纯 化 测 序 1.3 数 据 处 理 使 用 图 像 分 析 软 件 Quantity One(4.3.1) 对 DGGE 图 谱 进 行 分 析, 电 泳 条 带 的 数 量 用 来 代 表 细 菌 和 真 菌 的 群 落 丰 富 度 (S); 利 用 DGGE 图 谱 的 数 字 化 结 果 分 别 计 算 土 壤 样 品 中 细 菌 和 真 菌 群 落 的 多 样 性 指 数 (H),Shannon-Wiener 多 样 性 指 数 H = (P i )ln(p i ), 其 中 P i = n i /N,n i 为 某 个 带 的 峰 强 度,N 为 该 带 所 在 泳 道 的 所 有 带 峰 强 度 之 和 ; 用 非 加 权 组 平 均 法 (UPGMA) 对 土 壤 样 品 进 行 聚 类 分 析, 形 成 聚 类 树 状 图 将 测 序 结 果 输 入 NCBI 数 据 库 通 过 BLAST 软 件 与 已 知 序 列 比 对, 获 取 同 源 性 较 高 的 相 关 基 因 序 列 2 结 果 与 分 析 2.1 土 壤 微 生 物 基 因 组 DNA 的 提 取 及 PCR 扩 增 结 果 由 图 1 可 见, 各 处 理 土 壤 样 品 中 所 提 取 出 的 DNA 片 段 大 小 相 近 且 均 约 为 23 kb, 条 带 纯 度 和 完 整 性 较 好, 可 以 作 为 模 板 用 于 PCR 扩 增, 各 处 理 条 带 亮 度 有 差 异 可 能 是 样 品 中 所 含 的 微 生 物 数 量 不 同 造 成 的 图 1 土 壤 微 生 物 DNA 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 谱 Fig. 1 Agarose gel(0.8%)electrophoresis of microbial DNA extracted from soil 通 过 浓 度 为 1.5% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 PCR 扩 增 结 果, 如 图 2 所 示, 各 处 理 的 细 菌 16S 和 真 菌 28S rdna 扩 增 条 带 的 纯 度 和 亮 度 都 比 较 好, 没 有 出 现 非 特 异 性 扩 增, 且 扩 增 产 物 与 目 的 片 段 长 度 相 近, 分 别 约 为 400 bp 和 260 bp,pcr 扩 增 效 果 良 好, 扩 增 产 物 可 以 进 行 DGGE 实 验 图 2 PCR 扩 增 产 物 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 谱 Fig. 2 Agarose gel(1.5%)electrophoresis of PCR amplification products
2 期 马 宁 宁 等 : 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 259 2.2 不 同 连 作 年 限 土 壤 细 菌 的 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 图 3 为 不 同 连 作 年 限 土 壤 细 菌 16S rdna 的 PCR-DGGE 图 谱 由 图 3 可 见, 各 连 作 泳 道 的 条 带 数 和 位 置 差 异 不 大, 个 别 条 带 在 亮 度 上 有 一 定 的 差 别,b l c 条 带 出 现 在 所 有 连 作 泳 道, 但 亮 度 不 尽 相 同, 其 所 代 表 的 细 菌 种 群 在 连 坐 初 期 (4 年 ) 数 量 较 多, 连 作 7 年 后 数 量 减 少, 随 着 连 作 年 限 的 增 加, 又 发 生 富 集, 在 连 作 10 年 和 15 年 的 土 壤 中 成 为 优 势 种 群, 但 随 着 连 作 进 一 步 继 续, 它 们 的 优 势 地 位 又 被 其 他 种 群 取 代 ; 个 别 连 作 泳 道 有 其 特 有 的 条 带, 如 连 作 4 年 泳 道 的 h 条 带 15 年 泳 道 的 a i 条 带 和 20 年 泳 道 的 j k 条 带, 这 些 条 带 所 代 表 的 细 菌 种 群 是 相 应 时 期 的 优 势 种 群, 对 照 泳 道 的 d e f g 条 带 在 各 连 作 年 限 泳 道 中 没 有 出 现 或 亮 度 大 大 减 弱, 这 说 明 设 施 番 茄 栽 培 改 变 了 原 土 壤 细 菌 的 群 落 结 构, 一 些 土 著 细 菌 优 势 种 群 消 失 或 数 量 减 少 整 个 DGGE 图 谱 有 35 个 带 型, 各 泳 道 条 带 数 为 22 ~ 27 条 不 等, 其 中 7 年 连 作 泳 道 的 条 带 数 最 多, 但 条 带 间 亮 度 差 异 不 大, 没 有 出 现 绝 对 优 势 种 群, 各 种 群 间 细 菌 数 量 较 平 均, 图 3 土 壤 细 菌 16S rdna 的 PCR-DGGE 图 谱 Fig. 3 Denaturing gradient gel electrophoresis of bacteria 对 照 泳 道 的 条 带 数 最 少 16S rdna PCR amplification products 利 用 DGGE 图 谱 的 数 字 化 结 果 计 算 各 处 理 土 壤 细 菌 的 多 样 性 指 数 如 表 2 所 示, 对 照 的 多 样 性 指 数 数 值 最 小, 细 菌 群 落 多 样 性 最 低 ; 随 着 番 茄 连 作 年 限 的 增 加, 土 壤 细 菌 多 样 性 指 数 略 有 增 大, 连 作 15 年 和 20 年 的 土 壤 细 菌 Shannon-Wiener 指 数 相 同 表 2 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 Table 2 Diversity of soil microorganism community 土 壤 细 菌 Soil bacteria 土 壤 真 菌 Soil fungal 连 作 年 限 丰 富 度 指 数 多 样 性 指 数 丰 富 度 指 数 多 样 性 指 数 Years of continuous cropping Richness index Shannon-Wiener index Richness index Shannon-Wiener index 0( 对 照 Control) 22 2.70 24 2.59 4 23 2.79 21 2.55 7 27 2.82 33 3.13 10 25 2.86 39 3.28 15 26 2.93 31 2.99 20 24 2.93 32 2.90 采 用 非 加 权 组 平 均 法 (UPGMA) 对 DGGE 图 谱 进 行 聚 类 分 析 形 成 树 状 图 ( 图 4) 从 图 4 中 可 以 明 显 看 出, 连 作 4 年 和 7 年 的 DGGE 指 纹 图 谱 最 为 相 似, 聚 为 一 类, 其 次 是 连 作 10 年 和 15 年 的, 相 似 性 为 55%, 聚 为 一 簇, 连 作 20 年 作 为 一 个 分 支, 与 4 年 7 年 分 支 的 相 似 性 (0.52) 高 于 与 10 年 15 年 分 支 的 相 似 性 (0.45), 对 照 单 独 成 为 一 个 分 支, 与 各 连 作 处 理 的 相 似 性 最 低, 仅 为 0.34 各 连 作 处 理 的 相 似 性 都 在 0.45 以 上
260 园 艺 学 报 40 卷 Fig. 4 图 4 土 壤 细 菌 16S rdna 的 UPGMA 聚 类 分 析 UPGMA cluster analysis of bacteria 16S rdna PCR amplification products 2.3 不 同 连 作 年 限 土 壤 真 菌 的 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 不 同 连 作 年 限 土 壤 真 菌 28S rdna 的 PCR-DGGE 图 谱 如 图 5 所 示 从 图 5 可 以 看 出, 与 细 菌 DGGE 图 谱 相 比, 真 菌 的 电 泳 图 谱 背 景 清 晰, 条 带 明 确, 各 泳 道 间 条 带 数 亮 度 差 异 较 大, 几 乎 每 个 泳 道 都 有 清 晰 可 辨 的 特 有 条 带 ( 如 g a h e i), 连 作 泳 道 间 共 有 条 带 的 亮 度 也 不 同 ( 如 b c f d) 随 着 连 作 年 限 的 增 加,a g h p 条 带 的 亮 度 减 弱 或 消 失,b c n f 条 带 的 亮 度 增 强, 连 作 20 年 的 土 壤 泳 道 出 现 了 新 的 高 亮 度 o 条 带, 条 带 亮 度 的 变 化 反 映 了 其 所 代 表 种 群 的 真 菌 数 量 的 变 化, 虽 然 20 年 连 作 土 壤 的 条 带 数 不 是 最 多 的, 但 有 最 多 的 高 亮 度 条 带, 与 4 年 连 作 土 壤 相 比,20 年 连 作 土 壤 新 增 了 高 亮 度 条 带 n 和 o, 且 条 带 b c k 的 亮 度 大 大 增 强, 而 条 带 d 亮 度 减 弱,g 条 带 消 失, 说 明 番 茄 经 过 长 期 连 作, 土 壤 中 某 些 种 类 的 真 菌 大 量 富 集, 其 他 种 类 真 菌 数 量 减 少 或 消 失, 这 可 能 是 番 茄 根 系 分 泌 物 的 作 用 结 果 与 土 壤 细 菌 不 同 的 是, 种 植 番 茄 并 没 有 明 显 改 变 土 壤 土 著 真 菌 的 群 落 结 构, 除 i 条 带 外, 其 他 条 带 (j k l m) 所 代 表 的 土 著 真 菌 的 优 势 种 群 没 有 因 为 番 茄 连 作 而 消 失, 但 条 带 亮 度 改 变 较 大, 真 菌 数 量 发 生 了 变 化 土 壤 样 品 中 真 菌 基 因 组 DNA 的 DGGE 图 谱 共 有 50 个 不 同 的 带 型, 每 个 处 理 含 有 21 ~ 39 图 5 土 壤 真 菌 28S rdna 的 PCR-DGGE 图 谱 Fig. 5 Denaturing gradient gel electrophoresis of fungal 28S rdna PCR amplification products
2 期 马 宁 宁 等 : 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 261 种 带 型 ( 表 2), 除 对 照 和 连 作 4 年 处 理 之 外, 所 有 处 理 条 带 数 都 大 于 30, 其 中 连 作 10 年 的 条 带 最 多, 有 39 条, 随 着 连 作 年 限 的 增 加, 土 壤 真 菌 的 丰 富 度 指 数 呈 先 上 升 后 下 降 的 变 化 趋 势, 与 细 菌 相 比, 不 同 连 作 年 限 土 壤 真 菌 多 样 性 指 数 有 较 大 差 异, 连 作 4 年 土 壤 真 菌 多 样 性 指 数 最 低 (2.55), 连 作 10 年 多 样 性 指 数 最 高 (3.28), 其 余 处 理 由 低 到 高 依 次 为 对 照 < 连 作 20 年 < 连 作 15 年 < 连 作 7 年 图 6 是 不 同 处 理 土 壤 真 菌 DGGE 结 果 的 聚 类 分 析 图 由 图 6 可 见, 各 处 理 的 DGGE 指 纹 图 谱 差 异 较 大, 相 似 性 较 低, 除 连 作 15 年 和 20 年 的 相 似 性 达 到 0.56 以 外, 其 他 处 理 的 相 似 性 均 低 于 0.5, 其 中 连 作 4 年 处 理 与 其 他 处 理 的 相 似 性 最 低, 仅 为 0.25, 连 作 7 年 和 10 年 的 处 理 相 似 性 为 0.43, 聚 成 一 类 ; 对 照 (0 年 ) 和 连 作 4 年 处 理 与 其 他 处 理 相 似 性 较 低, 分 别 形 成 分 支, 其 中, 对 照 (0 年 ) 与 15 年 20 年 分 支 相 似 性 是 0.39, 与 7 年 10 年 分 支 相 似 性 是 0.29 Fig. 6 图 6 土 壤 真 菌 28S rdna 的 UPGMA 聚 类 分 析 UPGMA cluster analysis of fungal 28S rdna PCR amplification products 2.4 不 同 连 作 年 限 土 壤 微 生 物 的 优 势 种 群 分 析 选 择 图 3 中 亮 度 较 高 且 比 较 清 晰 可 辨 的 条 带 进 行 切 胶 回 收, 经 PCR 后 测 序, 条 带 a ~ d 测 序 成 功 从 图 3 可 以 看 出, 除 了 7 年 连 作 土 壤 外, 其 他 连 作 处 理 都 有 条 带 a 和 c, 但 条 带 亮 度 有 差 异, 条 带 b 存 在 于 所 有 连 作 处 理, 代 表 一 种 番 茄 连 作 土 壤 中 的 细 菌 优 势 种 群, 条 带 d 只 出 现 在 对 照 中, 可 能 是 自 然 土 壤 中 细 菌 的 优 势 种 群 通 过 NCBI 查 找 比 对, 选 择 与 测 序 序 列 相 似 性 最 高 的 前 两 条 序 列 为 参 考 对 象, 如 表 3 所 示, 测 序 序 列 与 已 发 表 序 列 的 相 似 性 达 到 92% ~ 100%, 多 数 属 于 未 经 培 养 的 细 菌, 条 带 d 序 列 与 已 发 表 的 Arthrobacter sp. 和 Actinomyces sp. 序 列 相 似 性 最 高, 达 到 100% 对 土 壤 真 菌 DGGE 凝 胶 中 的 条 带 进 行 分 离 回 收,PCR 扩 增 后 测 序, 结 果 即 图 5 中 的 条 带 a ~ e 测 序 成 功, 条 带 a 是 连 作 7 年 处 理 特 有 的 条 带 ; 条 带 b 存 在 于 除 7 年 和 对 照 之 外 的 4 条 泳 道,15 年 20 年 处 理 的 亮 度 较 高 ;c 条 带 出 现 在 所 有 土 壤 样 品 中, 其 中 连 作 15 20 年 处 理 的 亮 度 最 高 ; 除 了 7 年 条 带 d 在 所 有 连 作 处 理 泳 道 中 的 亮 度 都 较 高, 且 并 未 出 现 在 对 照 泳 道 中 ;e 条 带 只 见 于 7 年 和 10 年 泳 道, 后 者 亮 度 明 显 高 于 前 者 将 所 有 测 得 序 列 与 NCBI 中 已 发 表 序 列 进 行 比 对, 得 到 与 本 试 验 条 件 下 土 壤 真 菌 优 势 种 群 序 列 同 源 性 较 高 的 真 菌 ( 表 3),LF-e 与 Lasiobolidium orbiculoides 序 列 相 似 性 为 100%, 可 能 是 同 属 真 菌, 其 余 测 序 序 列 与 已 发 表 序 列 相 似 性 为 87% ~ 97%
262 园 艺 学 报 40 卷 Table 3 表 3 土 壤 微 生 物 的 DGGE 回 收 条 带 序 列 分 析 Sequence analysis of bands excised from DGGE gel derived from soil microorganism 条 带 编 号 Band No. 序 列 同 源 性 较 高 的 微 生 物 Microorganism with the highest identity from NCBI 相 似 性 % Similarity LB-a Clostridium butyricum strain W5(DQ831124) 97 Uncultured organism clone ELU0147-T221-S-NIPCRAMgANa_000420(HQ800997) 97 LB-b Uncultured bacterium clone BFA_100(EF443777) 99 Uncultured bacterium clone SSD120_A12(JQ358480) 99 LB-c Uncultured Bacillus sp. clone OTU76(JQ217331) 92 Bacillus sp. LKC-YN001(JN854133) 92 LB-d Arthrobacter sp. TXc7-10(HQ333015) 100 Actinomyces sp. YACS-36(DQ649438) 100 LF-a Saccobolus dilutellus isolate AFTOL-ID 1299(FJ176870) 90 Uncultured soil fungus clone Fung.dry.ECATDBG02(GU376216) 89 LF-b Uncultured fungus clone gbfc_3b38_043(dq901003) 95 Pezizales sp. BC2(DQ317324) 87 LF-c Lasiobolus ciliatus voucher KS-94-005(DQ167411) 97 Lasiobolus cuniculi voucher C F-54526(DQ168338) 97 LF-d Spooneromyces laeticolor(dq220434) 93 Uncultured Ascomycota clone A9YE16RM1(FJ568096) 93 LF-e Lasiobolidium orbiculoides(dq062995) 100 Pseudombrophila merdaria(dq062992) 96 注 :LB-a ~ LB-d 对 应 图 3 中 条 带 a ~ d,lf-a ~ LF-e 对 应 图 5 中 条 带 a ~ e Note:LB-a LB-d correspond to the bands a ~ d in figure 3,LF-a LF-e correspond to the bands a e in figure 5. 3 讨 论 许 多 研 究 已 表 明 : 作 物 连 作 导 致 土 壤 微 生 物 群 落 改 变 是 产 生 作 物 连 作 障 碍 的 重 要 原 因 之 一 然 而, 以 往 研 究 土 壤 微 生 物 群 落 变 化 多 采 用 微 生 物 培 养 方 法, 这 种 方 法 受 培 养 条 件 影 响 较 大, 不 仅 可 培 养 出 的 微 生 物 有 限, 而 且 研 究 结 果 也 存 在 一 定 差 异 ( 孙 艳 艳 等,2010; 华 菊 玲 等,2012) 近 年 来, 采 用 分 子 生 物 学 方 法 进 行 作 物 连 作 土 壤 微 生 物 研 究 已 有 一 些 进 展 吴 凤 芝 和 王 学 征 (2007) 利 用 RAPD 技 术 研 究 了 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 对 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 的 影 响, 结 果 发 现 连 作 7 年 的 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 指 数 丰 富 度 及 均 匀 度 指 数 均 小 于 连 作 2 年 的 李 坤 等 (2009) 采 用 PCR-DGGE 技 术 研 究 葡 萄 连 作 对 土 壤 细 菌 和 真 菌 种 群 结 构 及 多 样 性 的 影 响, 发 现 种 植 葡 萄 30 年 的 连 作 园 土 壤 细 菌 和 真 菌 的 多 样 性 都 大 于 种 植 葡 萄 3 年 的 新 植 园 土 壤 胡 元 森 等 (2007) 采 用 DGGE 技 术 研 究 黄 瓜 连 作 对 土 壤 微 生 物 区 系 的 影 响, 发 现 连 作 并 未 造 成 土 壤 菌 群 大 量 丢 失, 菌 群 构 成 仍 较 稳 定, 但 土 壤 部 分 种 群 的 数 量 发 生 了 明 显 变 化 本 研 究 中 采 用 DGGE 技 术 研 究 结 果 表 明, 设 施 番 茄 栽 培 土 壤 细 菌 丰 富 度 指 数 真 菌 丰 富 度 指 数 和 多 样 性 指 数 均 随 连 作 年 限 的 延 长 呈 先 上 升 后 下 降 的 变 化 趋 势, 但 连 作 20 年 番 茄 的 土 壤 细 菌 及 真 菌 丰 富 度 和 多 样 性 指 数 仍 大 于 连 作 4 年 的 土 壤 这 说 明 本 试 验 条 件 下, 番 茄 长 期 连 作 增 加 了 土 壤 细 菌 和 真 菌 的 丰 富 度 和 多 样 性, 这 与 吴 凤 芝 和 王 学 征 (2007) 用 RAPD 技 术 对 黄 瓜 连 作 土 壤 微 生 物 的 研 究 结 果 不 一 致, 结 合 胡 元 森 等 (2007) 采 用 DGGE 技 术 研 究 认 为 黄 瓜 连 作 土 壤 菌 群 构 成 较 为 稳 定, 未 出 现 丢 失 的 结 果, 认 为 本 研 究 与 吴 凤 芝 和 王 学 征 (2007) 的 研 究 结 果 不 一 致 的 原 因 可 能 与 RAPD 和 DGGE 两 种 分 子 生 物 学 技 术 有 关, 且 与 随 机 引 物 的 选 择 和 多 少 有 关, 当 然 作 物 的 不 同 以 及 土 壤 质 地 和 施 肥 等 均 会 影 响 结 果, 有 关 方 面 还 需 做 进 一 步 研 究 本 研 究 中, 尽 管 土 壤 细 菌 及 真 菌 的 丰 富 度 指 数 和 多 样 性 指 数 均 随 连 作 年 限 的 延 长 而 增 加, 但 土 壤 细 菌 种 群 数 量 差 异 不 大, 群 落 结 构 较 为 相 似, 只 是 优 势 种 群 的 种 类 和 数 量 略 有 不 同 ; 而 与 细 菌 相 比, 土 壤 真 菌 对 连 作 的 反 应 更 敏 感, 连 作 显 著 降 低 了 某 些 真 菌 的 数 量, 同 时 真 菌 DGGE 的 每 条 泳 道 均 有 独 立 且 亮 度 较 高 的 条 带, 这 说 明 每 个 不 同 连 作 年 限 的 土 壤 样 品 中 均 有 降 低 的 真 菌 种 群 和 升 高 的 真 菌 种 群, 其 中, 连 作 20 年 土 壤 的 真 菌 优 势 种 群 最 多, 且 与 非 优 势 种 群 的 真 菌 数 量 差 异 较 大, 某 些
2 期 马 宁 宁 等 : 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 263 真 菌 数 量 大 幅 增 加, 富 集 现 象 明 显, 这 种 番 茄 连 作 后 改 变 土 壤 真 菌 优 势 种 群 平 衡 可 能 是 导 致 番 茄 产 生 连 作 障 碍 的 重 要 原 因 之 一 一 些 研 究 (Saïdou et al.,2006;wakelin et al.,2008; 张 海 燕 等,2010) 也 证 实 土 壤 细 菌 与 土 壤 类 型 密 切 相 关, 而 土 壤 真 菌 与 土 壤 管 理 密 切 相 关, 其 原 因 是, 细 菌 在 土 壤 中 数 量 最 多, 且 群 落 结 构 稳 定, 对 环 境 变 化 的 适 应 力 强 ; 而 真 菌 的 数 量 远 远 少 于 细 菌, 且 对 土 壤 环 境 变 化 敏 感 对 于 土 壤 土 著 微 生 物 来 说, 土 著 真 菌 的 群 落 结 构 稳 定 性 优 于 土 著 细 菌, 优 势 种 群 没 有 因 为 受 到 温 度 湿 度 人 为 耕 作 措 施 等 的 影 响 而 消 失 测 序 结 果 显 示,5 条 真 菌 DGGE 条 带 所 代 表 的 真 菌 种 群 都 属 于 子 囊 菌 纲, 其 中 a c e 都 属 于 盘 菌 目, 细 菌 DGGE 条 带 中 d 条 带 所 代 表 的 土 著 细 菌 优 势 种 群 是 放 线 菌 的 一 种, 而 a b c 所 代 表 的 连 作 土 壤 细 菌 优 势 种 群 分 别 属 于 酪 酸 梭 菌 未 经 培 养 的 细 菌 和 芽 孢 杆 菌, 这 些 微 生 物 在 土 壤 中 的 作 用 还 有 待 于 进 一 步 研 究 PCR-DGGE 技 术 在 研 究 自 然 界 微 生 物 群 落 的 遗 传 多 样 性 和 种 群 差 异 方 面 具 有 明 显 的 优 越 性, 自 从 Muyzer 等 (1993) 首 次 将 这 项 技 术 应 用 于 微 生 物 生 态 学 研 究 以 来, 已 有 越 来 越 多 的 人 将 其 作 为 主 要 的 分 子 工 具 之 一, 用 于 研 究 微 生 物 群 落 结 构 多 样 性 以 及 微 生 物 种 群 的 动 态 变 化 (Martina et al., 2004; 秦 华 等,2010; 顾 美 英 等,2012) 目 前 国 内 利 用 DGGE 技 术 研 究 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 方 面 多 偏 重 于 研 究 土 壤 细 菌, 而 对 于 土 壤 真 菌 的 研 究 少 见 报 道 本 研 究 的 结 果 表 明, 以 403f/662r-GC 为 引 物 用 于 土 壤 真 菌 的 DGGE 分 析, 得 到 的 电 泳 图 谱 背 景 明 确 条 带 清 晰 可 分 辨 条 带 数 量 较 多, 可 以 用 于 研 究 不 同 处 理 下 土 壤 真 菌 群 落 的 演 变 情 况 以 往 研 究 者 多 针 对 细 菌 16S rdna 的 V3 可 变 区 设 计 引 物 用 于 DGGE 实 验 (Cindy et al.,2000; 王 旭 熙 等,2012), 由 于 片 段 较 短, 一 些 相 近 的 细 菌 不 能 被 区 分 开 来, 致 使 细 菌 的 分 类 地 位 确 定 不 够 具 体 精 确 本 次 试 验 中 以 细 菌 16S rdna 的 V3 ~ V4 可 变 区 为 目 的 序 列 进 行 PCR 扩 增, 在 满 足 DGGE 实 验 条 件 的 前 提 下 增 大 了 片 段 长 度, 有 利 于 进 一 步 区 分 亲 缘 关 系 较 接 近 的 细 菌 种 群, 但 扩 增 片 段 的 增 大 也 带 来 了 一 些 问 题, 如 电 泳 条 带 增 多 导 致 条 带 间 分 离 不 完 全, 电 泳 图 谱 背 景 模 糊, 可 分 辨 条 带 数 减 少 等, 这 些 问 题 需 要 通 过 调 整 变 性 剂 浓 度 梯 度 电 压 及 电 泳 时 间 等 实 验 条 件 来 解 决 References Buchan A,Newell S Y,Butler M. 2003. Dynamics of bacterial and fungal communities on decaying salt marsh grass. Appl Environ Microbiol,69 (1):6676 6687. Cindy H Nakatsu,Vigdis Torsvik,Lise Øvreås. 2000. Soil community analysis using DGGE of 16S rdna polymerase chain reaction products. Soil Sci Soc Am J,64 (4):1382 1388. Diouf M,Miambi E,Mora P,Delgarde S,Rouland C. 2006. The impact of termite sheetings age on their fungal communities. European Journal of Soil Biology,42 (1):85 91. Gu Mei-ying,Xu Wan-li,Mao Jun,Zhang Zhi-dong,Tang Guang-mu,Ge Chun-hui. 2012. Microbial community diversity of rhizosphere soil in continuous cotton cropping system in Xinjiang. Acta Ecologica Sinica,32 (10):3031 3040. (in Chinese) 顾 美 英, 徐 万 里, 茆 军, 张 志 东, 唐 光 木, 葛 春 辉. 2012. 新 疆 绿 洲 农 田 不 同 连 作 年 限 棉 花 根 际 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性. 生 态 学 报, 32 (10):3031 3040. Hu Yuan-sen,Wu Kun,Li Cui-xiang,Jia Xin-cheng. 2007. Effect of continuous cropping of cucumber on soil microbial population Ⅱ variation analysis based on DGGE approach. Scientia Agricultura Sinica,40 (10):2267 2273. (in Chinese) 胡 元 森, 吴 坤, 李 翠 香, 贾 新 成. 2007. 黄 瓜 连 作 对 土 壤 微 生 物 区 系 影 响 Ⅱ 基 于 DGGE 方 法 对 微 生 物 种 群 的 变 化 分 析. 中 国 农 业 科 学,40 (10):2267 2273. Hua Ju-ling,Liu Guang-rong,Huang Jin-song. 2012. Effect of continuous cropping of sesame on rhizospheric microbial communities. Acta Ecologica Sinica,32 (9):2936 2942. (in Chinese) 华 菊 玲, 刘 光 荣, 黄 劲 松. 2012. 连 作 对 芝 麻 根 际 土 壤 微 生 物 群 落 的 影 响. 生 态 学 报,32 (9):2936 2942. Li Kun,Guo Xiu-wu,Sun Ying-ni,Zhang Li-heng,Hu Xi-xi. 2009. Effect of grape-replanting on soil bacterial and fungal populations. Chinese
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