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1 中 国 农 业 科 学 2007,40(10): Scientia Agricultura Sinica 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 中 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 的 变 化 及 其 与 产 量 品 质 的 关 系 吴 凤 芝, 王 学 征 ( 东 北 农 业 大 学 园 艺 学 院, 哈 尔 滨 ) 摘 要 : 目 的 研 究 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 中, 土 壤 微 生 物 多 样 性 的 变 化 及 其 对 产 量 品 质 的 影 响 方 法 利 用 RAPD 技 术 研 究 了 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 对 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 及 产 量 品 质 的 影 响 结 果 连 作 黄 瓜 2 年 和 7 年 的 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 指 数 丰 富 度 及 其 均 匀 度 指 数 均 随 着 黄 瓜 种 植 年 限 的 增 加 而 降 低, 黄 瓜 产 量 显 著 下 降 而 对 于 和 21 年 3 种 轮 作 种 植 的 土 壤, 尽 管 其 种 植 年 限 较 长, 但 其 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 及 均 匀 度 均 高 于 7 年 黄 瓜 连 作 的 土 壤, 而 且 黄 瓜 VC 含 量 均 高 于 连 作 土 壤 结 论 设 施 栽 培 条 件 下, 轮 作 有 利 于 土 壤 微 生 物 群 落 的 多 样 性 和 稳 定 性 的 提 高, 有 利 于 土 壤 生 态 环 境 的 改 善 和 黄 瓜 产 量 品 质 的 形 成 关 键 词 :RAPD; 多 样 性 指 数 ; 均 匀 度 指 数 ; 产 量 ; 品 质 Effect of Monocropping and Rotation on Soil Microbial Community Diversity and Cucumber Yield, Quality Under Protected Cultivation WU Feng-zhi, WANG Xue-zheng (College of Horticulture, North East Agricultural University, Harbin ) Abstract: Objective The objective of the experiment is to study the effect of monocropping and rotation on microbial community diversity and cucumber yield and quality. Method RAPD techniques were adopted to study the effect of monocropping and rotation on DNA sequence diversity of microbial community and cucumber yield and quality. Result The diversity index, richness and evenness index of microbial community in the 2-year and 7-year monocropping soil decreased with the increasing of planting history, and cucumber yield dropped obviously. However, in 15-year, 18-year and 21-year rotation soil, even though the planting history was longer, the DNA sequence diversity and evenness of microbial community were both higher than those in the 7-year monocropping soil, and also the vitamin C content in cucumber of rotation was higher than that of monocropping. Conclusion Under protected cultivation, crop rotation is propitious to DNA sequence diversity and stability of microbial community, increases the cucumber yield and quality, and improves soil ecological environment. Key words: RAPD; Diversity index; Evenness index; Yield; Quality 0 引 言 研 究 意 义 近 年 来, 设 施 园 艺 在 中 国 发 展 非 常 迅 速, 栽 培 面 积 逐 年 增 加 但 由 于 菜 农 为 了 追 求 高 产, 盲 目 超 量 施 用 农 药 和 化 肥, 造 成 土 壤 生 态 环 境 恶 化, 蔬 菜 产 量 下 降, 品 质 变 劣, 连 作 障 碍 严 重, 不 仅 严 重 影 响 了 设 施 农 业 的 可 持 续 发 展 和 食 品 安 全, 而 且 威 胁 着 消 费 者 的 健 康 因 此 创 造 一 个 有 利 于 蔬 菜 生 产 的 环 境 已 成 为 一 个 急 需 解 决 的 问 题 土 壤 微 生 物 群 落 是 个 非 常 特 别 的 生 物 学 群 体, 其 重 要 的 生 理 功 能 已 引 起 学 者 们 的 足 够 重 视 [1~4] 在 生 态 系 统 中 土 壤 微 生 物 有 机 体 组 成 了 一 个 强 大 的 动 力 资 源 库, 在 植 物 残 体 降 解 腐 殖 质 形 成 及 养 分 转 化 与 循 环 中 扮 演 着 十 分 重 要 的 角 色 [5~8] 许 多 学 者 认 为 土 壤 微 生 物 是 连 作 障 碍 的 主 要 因 子 之 一, 其 群 落 结 构 组 成 及 其 变 化 在 一 定 程 度 上 反 映 了 土 壤 的 质 量 及 其 健 全 性 前 人 研 究 进 展 随 着 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 ( ), 黑 龙 江 省 自 然 科 学 基 金 项 目 (C0215), 黑 龙 江 省 教 育 厅 项 目 ( ) 作 者 简 介 : 吴 凤 芝 (1963-), 女, 教 授, 研 究 方 向 为 设 施 园 艺 及 蔬 菜 生 理 生 态 Tel: ;Fax: ; [email protected]

2 10 期 吴 凤 芝 等 : 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 中 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 的 变 化 及 其 与 产 量 品 质 的 关 系 2275 人 们 对 可 持 续 农 业 和 土 壤 质 量 越 来 越 重 视, 通 过 测 定 土 壤 微 生 物 来 检 测 土 壤 质 量 也 越 来 越 被 重 视 姚 建 [9, 10] 等 利 用 RAPD 技 术 研 究 了 农 用 化 学 品 污 染 对 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 的 影 响 结 果 表 明 4 种 不 同 污 染 程 度 的 土 壤 微 生 物 群 落 序 列 在 其 均 匀 度 指 数 多 样 性 指 数 和 丰 富 度 指 数 等 方 面 均 存 在 差 异 尹 [11] 睿 等 通 过 BIOLOG 鉴 定 系 统 对 设 施 土 壤 与 稻 麦 轮 作 田 土 壤 微 生 物 学 特 征 进 行 了 研 究 结 果 表 明, 设 施 土 壤 微 生 物 利 用 的 碳 源 显 著 少 于 露 地 和 稻 麦 轮 作 土 [12] 壤, 而 后 两 者 无 显 著 差 异 范 君 华 等 对 阿 拉 尔 垦 区 已 使 用 10 年 以 上 温 室 和 菜 地 的 土 壤 养 分 微 生 物 区 系 及 微 生 物 活 性 进 行 研 究, 发 现 温 室 土 壤 由 于 盐 渍 化 的 [13] 影 响, 微 生 物 的 活 性 明 显 低 于 露 地 菜 田 曲 再 红 等 研 究 了 土 壤 微 生 物 与 番 茄 生 长 的 关 系 结 果 表 明, 土 壤 微 生 物 的 数 量 明 显 增 加, 同 时 番 茄 的 株 高 和 株 重 也 有 明 显 变 化, 不 同 时 间 测 定 土 壤 中 细 菌 数 量 和 放 线 菌 数 量 与 番 茄 株 高 和 株 重 均 存 在 显 著 性 正 相 关 关 系 本 研 究 切 入 点 本 文 利 用 RAPD 技 术 对 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 对 土 壤 微 生 物 群 落 的 影 响 进 行 了 分 析, 研 究 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 对 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 及 其 产 量 品 质 的 影 响 拟 解 决 的 关 键 问 题 旨 在 为 综 合 评 价 种 植 年 限 和 栽 培 方 式 对 土 壤 微 生 物 的 影 响, 同 时 为 通 过 种 植 年 限 和 栽 培 方 法 调 整 土 壤 微 生 物 结 构, 创 造 良 好 的 设 施 土 壤 生 态 环 境, 丰 富 与 发 展 连 作 障 碍 理 论 提 供 科 学 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 试 验 材 料 供 试 黄 瓜 (Cucumis sativus L.) 品 种 为 津 优 1 号 供 试 土 壤 均 取 自 哈 尔 滨 市 香 坊 区 同 一 自 然 村 连 续 种 植 2 年 和 7 年 黄 瓜 的 大 棚 土 壤 ( 称 为 连 作 土 壤, 取 自 同 一 种 植 户, 栽 培 管 理 方 式 相 同 ) 及 黄 瓜 番 茄 和 菜 豆 轮 作 15 年 18 年 和 21 年 的 大 棚 土 壤 ( 称 为 轮 作 土 壤, 同 一 种 植 户, 栽 培 管 理 方 式 相 同 ) 供 试 土 壤 均 为 黑 土, 理 化 性 状 见 表 试 验 设 计 表 1 供 试 土 壤 的 理 化 性 状 Table 1 The basic physicochemical properties of tested soil 栽 培 方 式 年 限 有 机 质 全 氮 碱 解 氮 全 磷 速 效 磷 缓 效 钾 速 效 钾 ph Cultural mode Years O.M. (g kg -1 ) Total N (g kg -1 ) Alkaline N Total P (g kg -1 ) Avai. P Slowly Avai. K Avai. K 连 作 Monocropping 轮 作 Rotation 试 验 采 用 盆 栽, 共 有 5 个 处 理, 每 个 处 理 3 次 重 复, 每 个 重 复 8 盆, 每 个 处 理 24 盆, 随 机 排 列 每 24 盆 土 壤 中 加 0.75 kg N-P-K 比 例 为 的 撒 可 富 复 合 肥, 每 盆 土 壤 7 kg 6 月 28 日 播 种, 子 叶 展 开 移 苗, 三 叶 一 心 定 植 拉 秧 期 (10 月 13 日 ) 取 样, 测 定 黄 瓜 根 际 土 壤 微 生 物 多 样 性 各 参 数, 每 个 处 理 取 3 盆, 数 据 处 理 采 用 平 均 值 1.3 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 的 分 析 方 法 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 的 提 取 与 纯 化 在 盛 果 期 取 盆 栽 土 样, 每 种 土 样 采 集 约 50 g, 过 2 mm 筛 后, 装 入 聚 乙 烯 袋 保 存 于 -70 条 件 下, 预 备 DNA 的 [14~17] 提 取 DNA 提 取 方 法 参 照 夏 北 成 等 的 方 法, 稍 作 修 改 纯 化 采 用 Promega Winzard 纯 化 试 剂 盒 纯 化 方 法 PCR 反 应 体 系 的 确 定 PCR 的 扩 增 条 件 影 响 RAPD 结 果 的 重 现 性 [19] [9] 以 姚 健 的 方 法 稍 作 修 改, 经 过 对 Mg 2+ 浓 度 dntp 浓 度 DNA 模 板 和 引 物 浓 度 的 比 例 退 火 温 度 和 延 伸 时 间 的 摸 索 [20,21], 最 后 确 定 本 试 验 的 PCR 扩 增 反 应 在 25 μl 体 积 中 进 行, 其 中 包 括 7 ng 土 壤 DNA 样 品 20 pmol µl -1 随 机 引 物 l.5u Taq 酶 3.0 mmol L -1 MgCl 2 和 0.2 mmol L -1 dntpmix, 反 应 缓 冲 液 系 用 Promega 配 套 产 品,PCR 扩 增 反 应 在 Perkin-elmer,Norwalk,CT 上 进 行 ;PCR 扩 增 反 应 进 程 如 下 :94 3 min 使 土 壤 DNA 变 性 ; 然 后 再 进 行 39 个 循 环, 每 个 循 环 包 括 :94 变 性 1 min,37 退 火 40s,72 延 伸 1.5 min, 结 束 后 72 再 延 伸 7 min 扩 增 产 物 在 1.8% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 紫 外 灯 下 观 察 并 拍 照 并 且 利 用 同 一 引 物 对 同 一 种 模 板 进 行 多 次 扩 增, 对 反 应 体 系 的 稳 定 性 进 行 检 验, 所 得 谱 带 清 晰 一 致, 重 复 性 好 ; 更 换 引 物 和 模 板 DNA 检 测 优 化 后 的 RAPD

3 2276 中 国 农 业 科 学 40 卷 体 系 也 能 得 到 清 晰 稳 定 的 谱 带 RAPD 分 子 遗 传 标 记 的 指 纹 分 析 通 过 分 析 电 泳 照 相 底 片 上 RAPD 指 纹 信 息, 进 而 得 出 引 物 对 5 个 处 理 的 土 壤 微 生 物 群 落 总 DNA 的 扩 增 情 况 将 电 泳 底 片 信 息 扫 描 进 计 算 机, 通 过 分 析 统 计 5 种 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 的 RAPD 条 带 数 ; 分 析 各 RAPD 条 带 的 灰 度 ( 范 围 0~255,0: 灰 度 最 小,255: 灰 度 最 大 ), 由 于 底 片 上 RAPD 条 带 的 灰 度 与 其 含 量 呈 比 例 关 系, 用 条 带 灰 度 大 小 来 代 替 每 个 RAPD 条 带 的 扩 增 量 (N) 用 于 计 算 群 落 DNA 序 列 的 多 样 性 指 数 丰 富 度 指 数 及 均 匀 度 指 数 [22,23], 得 出 5 种 土 壤 微 生 物 总 DNA 的 扩 增 情 况 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 研 究 方 法 本 试 验 是 采 用 随 机 引 物 对 5 种 土 壤 微 生 物 群 落 总 DNA 进 行 扩 增 [9], 实 际 上 就 是 检 测 群 落 DNA 的 一 些 位 点, 所 扩 增 的 RAPD 条 带 可 以 初 步 反 映 整 个 群 落 的 DNA 序 列 的 有 关 信 息, 由 于 采 用 的 是 随 机 引 物, 每 次 扩 增 反 应 相 当 于 对 整 个 群 落 的 DNA 序 列 作 一 次 随 机 取 样, 扩 增 的 RAPD 条 带 的 数 量 可 以 代 表 群 落 DNA 序 列 的 丰 富 度 指 数 (S) 群 落 DNA 序 列 的 多 样 性 可 采 用 Shannon Weaver 指 数 及 其 均 匀 度 指 数 来 表 示, Shannon Weaver 指 数 及 其 均 匀 度 指 数 由 下 式 计 算 : Dsh =- P i lnp i =- (N i /N)ln(N i /N) Jsh =D sh /lns 式 中,Dsh 为 Shannon Weaver 指 数,Jsh 为 均 匀 度 指 数,P i 为 第 i 个 RAPD 条 带 出 现 的 概 率,N i 为 第 i 个 RAPD 条 带 的 扩 增 量,N 为 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 的 RAPD 条 带 的 扩 增 总 量 (N = N i ),S 为 群 落 DNA 序 列 丰 富 度 指 数 Dsh 最 小 值 为 0, 最 大 值 为 lns PCR 反 应 的 随 机 引 物 在 本 试 验 中, 共 对 100 个 随 机 引 物 进 行 了 筛 选, 从 中 得 到 9 个 引 物 能 够 扩 增 出 清 晰 的 RAPD 条 带 本 试 验 所 用 100 条 引 物 购 自 北 京 宝 泰 克 及 上 海 生 工 生 物 公 司 筛 选 出 的 随 机 引 物 及 其 核 酸 序 列 如 表 2 利 用 筛 选 出 的 9 个 随 机 引 物 对 各 个 时 期 的 土 壤 微 生 物 DNA 模 板 进 行 扩 增 1.4 产 量 品 质 分 析 方 法 产 量 为 小 区 8 株 的 平 均 值 ; 黄 瓜 含 水 量 采 用 烘 干 法 测 定 [24] ; 维 生 素 C 采 用 美 国 WATER 公 司 生 产 的 2487-DUAL WAVELENG 型 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 [25] ; 硝 酸 盐 采 用 刘 钧 等 的 方 法 [26] 亚 硝 酸 盐 含 量 采 用 胡 长 敏 等 的 方 法 测 定 [27] ; 可 溶 性 固 形 物 含 量 采 用 日 本 生 产 的 ATAGO-N-1 型 手 持 测 糖 计 方 法 测 定 表 2 筛 选 出 的 随 机 引 物 及 其 核 酸 序 列 Table 2 The selected primers and their nucleotide sequence 引 物 Primer 序 列 Sequence 5 3 GC 含 量 (%) Content of GC 引 物 Primer 序 列 Sequence 5 3 GC 含 量 (%) Content of GC S261 CTCAGTGTCC 60 O8 CCTCCAGTGT 70 S1387 CTACGCTCAC 70 V3 CTCCCTGCAA 60 S2125 CAAGCCGTGA 60 M12 GGGACGTTGG 70 S1508 AAGAGCCCTC 60 A12 TCGGCGATAG CGAGCTCTAG 数 据 统 计 分 析 差 异 显 著 性 分 析 采 用 SAS 6.2 软 件 2 结 果 与 分 析 2.1 设 施 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 的 变 化 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 的 总 体 扩 增 分 析 本 试 验 共 检 测 了 9 个 随 机 引 物, 其 扩 增 产 物 在 1.8% 琼 脂 糖 凝 胶 中 均 能 分 辨 出 清 晰 的 RAPD 条 带, 共 计 扩 增 出 260 个 RAPD 条 带, 其 中 非 多 态 性 条 带 2 条, 占 0.77%, 多 态 性 条 带 258 条, 占 99.2%( 表 3) 非 多 态 性 条 带 是 指 对 5 种 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 均 能 扩 增 出 的 条 带, 即 能 扩 增 出 这 一 条 带 的 此 种 微 生 物 在 5 种 土 样 中 均 存 在 多 态 性 条 带 指 对 5 种 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 并 非 全 能 扩 增 出 的 条 带 图 1 为 引 物 235 对 5 种 土 样 DNA 扩 增 的 多 态 性 电 泳 图 谱 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 的 丰 富 度 指 数 的 变 化 由 于 RAPD 采 用 的 是 随 机 引 物, 引 物 对 5 种 土 壤 的 微 生 物 群 落 的 DNA 没 有 特 异 的 选 择 性, 因 而, 扩 增 的 总 条 带 数 可 以 间 接 反 映 5 种 土 壤 微 生 物 群 落 在 DNA 序 列 组 成 上 的 差 异, 扩 增 的 条 带 越 多 则 DNA 序 列 的 种 类 相 对 越 丰 富 RAPD 扩 增 条 带 数 作 为 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 丰 富 度 S 表 4 的 结 果 表 明, 在 连 作 土 壤 中, 连 续 种 植 黄 瓜 7 年 的 土 壤 微 生 物 丰 富 度 指 数 (2.778) 低 于 连 作 2 年 的 土 壤 (3.889) 在 轮 作 土

4 10 期 吴 凤 芝 等 : 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 中 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 的 变 化 及 其 与 产 量 品 质 的 关 系 2277 壤 中, 种 植 蔬 菜 18 年 的 土 壤 微 生 物 丰 富 度 指 数 最 高 (4.667), 种 植 21 年 的 土 壤 微 生 物 丰 富 度 指 数 显 著 降 低 (P<0.05) 对 于 不 同 种 植 方 式, 轮 作 土 壤 微 生 物 丰 富 度 指 数 明 显 高 于 连 作 土 壤 表 3 9 种 引 物 对 5 种 土 壤 微 生 物 群 落 总 DNA 的 扩 增 结 果 Table 3 Nine primers amplified outputs to total DNA of five soils microbial communities 引 物 Primer 扩 增 条 带 数 Amplified fragments 非 多 态 性 条 带 数 Non-polymorphic fragments 多 态 性 条 带 数 Polymorphic fragments 多 态 性 条 带 所 占 比 例 Ratio of polymorphic fragments to total fragments (%) A O V M 总 计 Total 轮 作 18 年 土 壤 ;2. 轮 作 15 年 土 壤 ;3. 轮 作 21 年 土 壤 ;4. 连 作 7 年 土 壤 ;5. 连 作 2 年 土 壤 ;M. Marker 1. Cucumber and tomato-18; 2. Cucumber and wheat-15; 3. Cucumber and tomato-21; 4. Cucumber-7; 5. Cucumber-2; M. Marker 图 1 引 物 235 扩 增 的 电 泳 图 Fig. 1 Amplified template DNA electrophoretogram with primer 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 的 Shannon-Weaver 指 数 及 其 均 匀 度 指 数 的 变 化 从 表 4 可 以 看 出, 在 盛 果 期, 连 作 黄 瓜 7 年 的 土 壤 Shannon-Weaver 指 数 为 最 低 值 (0.858), 明 显 低 于 连 作 2 年 的 土 壤 轮 作 土 壤 中, 种 植 18 年 的 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 多 样 性 指 数 为 最 高,21 年 的 土 壤 稍 降 低, 差 异 不 显 著 (P<0.05) 两 种 不 同 种 植 方 式 比 较 而 言, 轮 作 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 多 样 性 指 数 仍 然 均 高 于 连 作 的 土 壤 而 在 均 匀 度 方 面, 连 作 2 年 的 土 壤 微 生 物 群 落 均 匀 度 指 数 高 于 连 作 7 年 的 土 壤 ; 而 对 于 轮 作 土 壤 而 言, 种 植 21 年 的 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 均 匀 度 指 数 最 高 (0.325), 种 植 15 年 的 土 壤 仅 次 之 (0.322) 轮 作 土 壤 间 差 异 不 显 著 (P<0.05) 从 表 6 中 可 以 明 显 看 出, 轮 作 土 壤 微 生 物 群 落 均 匀 度 指 数 高 于 连 作 土 壤 综 合 而 言, 种 植 黄 瓜 15 年 的 土 壤 微 生 物 多 样 性 指 数 及 其 均 匀 度 均 较 高, 这 可 能 与 其 在 秋 冬 季 节 种 植 小 麦, 进 行 麦 菜 轮 作 有 较 大 关 系 露 地 土 壤 尽 管 丰 富 度 及 多 样 性 指 数 较 高, 但 其 均 匀 度 却 较 低 2.2 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 对 产 量 品 质 的 影 响 设 施 连 作 和 轮 作 对 黄 瓜 产 量 的 影 响 图 2 是 设 施 土 壤 连 作 和 轮 作 对 黄 瓜 产 量 的 影 响 结 果 表 明, 表 4 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 指 数 的 变 化 Table 4 Diversity index of soil microbial community DNA sequences 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 指 数 连 作 Monocropping (year) 轮 作 Rotation (year) Diversity index of soil microbial community DNA sequences 丰 富 度 指 数 (S)Richness index 3.889b 2.778c 4.111b 4.667a 4.000b Shannon-Weaver 指 数 (D sh )Shannon-Weaver index 1.222a 0.858b 1.334a 1.418a 1.263a 均 匀 度 指 数 (Jsh)Evenness index 0.285ab 0.257b 0.322a 0.317a 0.325a 小 写 字 母 表 示 P<0.05 水 平 ; 同 一 列 中 不 同 字 母 代 表 差 异 显 著 Small letter expresses P<0.05 level; Means with the different letters are significantly different

5 2278 中 国 农 业 科 学 40 卷 连 作 2 年 土 壤 的 黄 瓜 产 量 达 到 最 高 值, 与 其 它 处 理 达 到 了 差 异 显 著 水 平 (P<0.05), 连 作 7 年 黄 瓜 的 土 壤 的 产 量 达 最 低 值, 显 著 低 于 其 它 处 理 连 作 土 壤 有 随 着 连 作 年 限 的 增 加 产 量 下 降 的 趋 势, 轮 作 土 壤 间 的 黄 瓜 产 量 差 异 不 显 著 设 施 连 作 和 轮 作 对 黄 瓜 品 质 的 影 响 表 5 是 设 施 连 作 和 轮 作 对 黄 瓜 品 质 的 影 响 结 果 表 明, 硝 酸 盐 含 量 与 栽 培 方 式 的 关 系 没 有 规 律 性, 但 与 土 壤 的 碱 解 氮 含 量 有 关 ( 表 1), 连 作 7 年 的 土 壤 碱 解 氮 含 量 最 低, 硝 酸 盐 含 量 也 最 低 连 作 土 壤 盆 栽 的 黄 瓜 V C 含 量 低 于 轮 作 土 壤 盆 栽 的 黄 瓜 V C 含 量, 连 作 7 年 的 土 壤 盆 栽 的 黄 瓜 V C 含 量 最 低 而 对 于 亚 硝 酸 盐 固 形 物 含 水 量 3 项 品 质 指 标, 轮 作 与 连 作 之 间 没 有 规 律 性 3 讨 论 柱 型 图 上 方 的 不 同 字 母 表 示 差 异 达 到 显 著 水 平 (P< 0.05) Means with the different letters above the square column are significantly different (P < 0.05) 图 2 设 施 连 作 和 轮 作 土 壤 对 黄 瓜 产 量 的 影 响 Fig. 2 Effect of rotation and monocropping on cucumber yield in protective soil 由 于 RAPD 分 子 标 记 技 术 可 以 从 DNA 水 平 上 研 究 土 壤 微 生 物 群 落 的 变 化, 并 得 到 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 的 有 关 量 化 信 息, 因 此 这 方 面 的 研 究 也 直 线 上 升 [28] 本 文 利 用 RAPD 分 子 标 记 技 术 研 究 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 对 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 的 影 响, 突 破 了 传 统 方 法 由 于 培 养 微 生 物 种 类 有 限 ( 仅 为 1%), 造 成 大 量 有 益 信 息 丢 失 的 缺 憾, 更 能 全 面 详 细 地 了 解 土 壤 微 生 物 群 落 组 成 等 方 面 的 差 异 研 究 表 明, 设 施 连 作 和 轮 作 对 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 的 多 样 性 产 生 影 响,DNA 序 列 Shannon-Weaver 表 5 设 施 土 壤 轮 作 和 连 作 对 黄 瓜 品 质 的 影 响 Table 5 Effect of rotation and monocropping on cucumber quality in protective soil 品 质 指 标 连 作 Monocropping (year) 轮 作 Rotation (year) Quality index 硝 酸 盐 Nitrate 27.0± ± ± ± ±1.5 亚 硝 酸 盐 Nitrite 0.20± ± ± ± ±0.1 V C Vitamin C (mg/100g FW) 5.81± ± ± ± ±0.9 固 形 物 Dry matter (%) 5.5± ± ± ± ±0.6 含 水 量 Water content (%) 93.99± ± ± ± ±1.0 指 数 及 其 均 匀 度 指 数 和 丰 富 度 均 随 着 连 作 年 限 的 增 加 而 降 低, 而 种 植 年 限 对 轮 作 土 壤 影 响 不 大, 说 明 种 植 年 限 对 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 有 一 定 的 影 响, 但 并 不 是 造 成 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 差 异 的 惟 一 因 素, 连 作 可 能 造 成 其 土 壤 微 生 物 物 种 的 丧 失 和 某 些 单 一 物 种 的 富 集 设 施 连 作 土 壤 和 轮 作 土 壤 相 比, 轮 作 土 壤 的 微 生 物 群 落 均 匀 度 均 比 连 作 土 壤 的 微 生 物 群 落 均 匀 度 高,Shannon-Weaver 指 数 也 较 高, 可 能 是 不 同 栽 培 制 度 导 致 作 物 残 体 和 根 系 残 留 物 及 根 系 分 泌 物 在 土 壤 中 积 累 不 同, 从 而 使 得 土 壤 微 生 物 所 得 到 碳 源 的 数 量 及 性 质 不 同, 因 此 造 成 土 壤 微 生 物 数 量 及 种 群 结 构 在 不 同 栽 培 制 度 下 表 现 出 差 异 [29] 在 本 研 究 中, 轮 作 土 壤 的 有 机 质 含 量 明 显 高 于 连 作 土 壤, 其 原 因 是, 设 施 菜 田 土 壤 与 露 地 菜 田 ( 或 大 田 ) 土 壤 不 同, 设 施 菜 田 每 年 进 行 大 量 施 肥, 一 般 情 况 下 随 着 种 植 年 限 增 加 轮 作 土 壤 肥 力 有 增 加 的 趋 势, 而 且 肥 力 均 衡 增 加 ; 一 般 情 况 下, 连 作 土 壤 随 连 作 年 限 的 增 加 土 壤 肥 力 有 降 低 的 趋 势, 并 且 是 不 均 匀 的, 由 于 单 一 作 物 对 肥 力 的 吸 收 是 单 一 的 [30] 因 此, 同 一 种 作 物 连 作 后, 可 以 使 某 些 特 定 的 微 生 物 群 落 得 到 富 集, 特 别 是 植 物 病 原 真 菌, 不 利 于 土 壤 中 微 生 物 种 群 的 平 衡, 加 剧 植 物 根 部 病 害 的 发 生, 导 致 作 物 产 量 逐 年 降 低 本 试 验 结 果 表 明, 连 作 土 壤 黄 瓜 产 量 随 种 植 年 限 的 增 加 而 降 低, 而 对 于 轮 作 土 壤, 虽 然 种 植 年 限

6 10 期 吴 凤 芝 等 : 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 中 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 的 变 化 及 其 与 产 量 品 质 的 关 系 2279 [31] 较 长, 但 产 量 却 显 著 高 于 连 作 7 年 土 壤 王 震 宇 等 研 究 发 现 大 豆 重 茬 可 使 土 壤 微 生 物 总 数 减 少, 重 茬 年 限 越 长, 减 少 越 明 显 而 轮 作 有 利 于 保 持 土 壤 微 生 物 的 多 样 性 与 活 性, 同 时 也 有 利 于 作 物 根 系 生 长 和 对 土 壤 的 养 分 吸 收, 从 而 促 进 微 生 物 的 生 长 和 繁 殖, 有 利 于 作 物 的 产 量 形 成 本 研 究 结 果 表 明 种 植 年 限 和 栽 培 制 度 对 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 产 生 影 响, 对 于 具 体 影 响 到 土 壤 微 生 物 的 哪 些 种 类 及 功 能 还 有 待 进 一 步 研 究 但 是, 从 连 作 和 轮 作 对 黄 瓜 品 质 的 影 响 分 析 中 表 明, 两 种 栽 培 制 度 对 黄 瓜 的 品 质 影 响 不 大, 其 具 体 原 因 有 待 于 继 续 研 究 当 然, 应 用 RAPD 技 术 研 究 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 也 存 在 不 足, 目 前, 研 究 土 壤 微 生 物 多 样 性 的 方 法 很 多, 如 BIOLOG 微 平 板 鉴 定 系 统 16S rrna 基 因 序 列 研 究 和 传 统 的 微 生 物 培 养 法 等, 每 一 种 方 法 都 有 其 优 缺 点 本 试 验 对 100 种 引 物 进 行 筛 选, 仅 有 9 种 引 物 可 以 利 用, 如 果 能 筛 选 出 更 多 的 引 物 对 土 壤 进 行 扩 增, 其 结 果 可 能 更 加 客 观 真 实 4 结 论 本 研 究 结 果 表 明, 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 指 数 丰 富 度 及 其 均 匀 度 指 数 均 随 着 黄 瓜 种 植 年 限 的 增 加 而 降 低, 黄 瓜 产 量 显 著 下 降 而 对 于 3 种 轮 作 种 植 的 土 壤, 尽 管 其 种 植 年 限 较 长, 但 其 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 及 均 匀 度 均 高 于 黄 瓜 连 作 的 土 壤, 表 明 轮 作 栽 培 有 利 于 土 壤 微 生 物 种 群 的 多 样 性 和 稳 定 性 的 提 高, 有 利 于 土 壤 生 态 环 境 的 改 善, 而 且 黄 瓜 V C 含 量 高 于 连 作 土 壤 References [1] Agnelli A, Ascher J, Corti G, Ceccherini M T, Nannipieri P, Pietramellara G. Distribution of microbial communities in a forest soil profile investigated by microbial biomass, soil respiration and DGGE of total and extracellular DNA. Soil Biology & Biochemistry, 2004, 36(5): [2] Buyer J S, Drinkwater L E. Comparison of substrate utilization assay and fatty analysis of soil microbial communities. Journal of Microbiological Methods, 1997, 30: [3] Garland J L, Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level-sole-carbon-source utilization. Applied and Environmental Microbiology, 1991, 57: [4] Salles J F, van Veen J A, van Elsas J D. Multivariate analyses of burkholderia species in soil: effect of crop and land use history. Applied Environmental Microbiology, 2004, 70(7): [5] Kennydy A C, Smith K L. Soil microbial diversity index and the sustainability of agricultural soils. Plant and Soil, 1995, 170: [6] Bollag J M, Senesi N, Huang P M. Interactions Between Soil Minerals and Microorganisms: Impact on the Terrestrial Ecosystem. New York: Marcel Dekker, 1992, [7] Schutter M E, Sandeno J M, Dick R P. Seasonal, soil type, alternative management influences on microbial communities of vegetable cropping systems. Biology Fertility Soils, 2001, 34: [8] Yao H, He Z, Wilson M J, Campbell C D. Microbial biomass and community structure in a sequence of soils with increasing fertility and changing land use. Microbial Ecology, 2000, 40: [9] 姚 健, 杨 永 华, 沈 晓 蓉, 陆 维 忠. 农 用 化 学 品 污 染 对 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 的 影 响. 生 态 学 报, 2000, 20(6): Yao J, Yang Y H, Shen X R, Lu W Z. A preliminary study on DNA sequence diversity of soil microbial community affected by agricultural chemicals. Acta Ecologica Sinica, 2000, 20(6): (in Chinese) [10] Yang Y H, Yao J, Hu S, Qi Y. Effects of agricultural chemicals on DNA sequence diversity index of soil microbial community: A study with RAPD marker. Microbial Ecology, 2000, 39: [11] 尹 睿, 张 华 勇, 黄 锦 法, 林 先 贵, 王 俊 华, 曹 洪 志. 保 护 地 菜 田 与 稻 麦 轮 作 田 土 壤 微 生 物 学 特 征 的 比 较. 植 物 营 养 与 肥 料 学 报, 2004, 10(1): Yin R, Zhang H Y, Huang J F, Lin X G, Wang J H, Cao H Z. Comparison of microbiological properties between soils of rice-wheat rotation and vegetable cultivation. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2004, 10(1): (in Chinese) [12] 范 君 华, 刘 明, 黄 伟. 南 疆 温 室 和 菜 地 土 壤 微 生 物 学 特 性 比 较. 土 壤 肥 料, 2003, (1): Fan J H, Liu M, Huang W. Comparison the microbiology characteristics of greenhouse with vegetable plot of South Xinjiang. Soils and Fertilizers, 2003, (1): (in Chinese) [13] 曲 再 红, 杜 相 革. 土 壤 添 加 物 土 壤 微 生 物 和 番 茄 苗 期 生 长 相 互 关 系 的 研 究. 中 国 农 学 通 报, 2004, 20(4): Qu Z H, Du X G. Study on the interaction among soil additive, soil microorganism and tomato seedling stage. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2004, 20(4): (in Chinese) [14] Arlene Porteous L, John L Armstrong. Recovery of bulk DNA from soil by a rapid, small-scale extraction method. Current Microbiology, 1991, 22:

7 2280 中 国 农 业 科 学 40 卷 [15] Tatiana Volossiouk, Jane Robb E, Ross N. Nazar, direct DNA extraction for PCR-mediated assays of soil organisms. Applied Environmental Microbiolog, 1995, 61(11): [16] Margreti M O R E, James B. Herrick, Margarida C Silva, Williamc Ghiorse, Eugene L. Madsen. Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment. Applied and Enviromental Microbiology, 1994, 60(5): [17] 夏 北 成, Zhou J Z, Tiedje J M. 分 子 生 物 学 方 法 在 微 生 物 生 态 学 中 的 应 用. 中 山 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ), 1998, 37(2): Xia B C, Zhou J Z, Tiedje J M. Application of molecular methods in microbial ecology. Acta Scifntiarum Naturalium Universitatis Sunyaatseni, 1998, 37(2): (in Chinese) [18] Tcherneva E, Rijpens N, Jersek B, Herman L M F. Differentiation of Brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis. Journal of Applied Microbiology, 2000, 88: [19] Tyler K D, Wang G, Tyler S D, Johnson W M. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens. Journal of Clinical Microbiology, 1997, 35: [20] 吴 少 慧, 张 成 刚, 张 忠 泽. RAPD 技 术 在 微 生 物 生 物 多 样 性 鉴 定 中 的 应 用. 微 生 物 学 杂 志, 2000, 20(2): Wu S H, Zhang C G, Zhang Z Z. Application of RAPD in microbial biodiversity identification. Journal of Microbiology, 2000, 20(2): (in Chinese) [21] 丁 志 勇, 许 崇 任. 土 壤 微 生 物 PCR 及 分 子 杂 交 检 测. 微 生 物 学 报. 1999, (4): Ding Z Y, Xu C R. Detecting microorganisms in soil by PCR and molecular hybridization. Acta Microbiological Sinica, 1999, (4): (in Chinese) [22] 陈 廷 贵, 张 金 屯. 山 西 关 帝 山 神 尾 沟 植 物 群 落 物 种 多 样 性 与 环 境 关 系 的 研 究 Ⅰ: 丰 富 度 指 数 均 匀 度 指 数 和 物 种 多 样 性 指 数. 应 用 与 环 境 生 物 学 报, 2000, 6(5): Chen T G, Zhang J T. Plant species diversity of Shenweigou in Guandi mountains (Shanxi, China) Ⅰ. richness, evenness and diversity indexes. Chinese Journal of Applied Environmental Biology, 2000, 6(5): (in Chinese) [23] 马 克 平, 黄 建 辉, 于 顺 利, 陈 灵 芝. 北 京 东 灵 山 地 区 植 物 群 落 多 样 性 的 研 究 Ⅱ: 丰 富 度 指 数 均 匀 度 指 数 和 物 种 多 样 性 指 数. 生 态 学 报, 1995, 15(3): Ma K P, Huang J H, Yu S L, Chen L Z. Plant community diversity in [24] 张 宪 政, 谭 桂 茹, 黄 元 极, 宋 玉 华. 植 物 生 理 学 实 验 技 术. 沈 阳 : 辽 宁 科 学 技 术 出 版 社, 1989: 6, Zhang X Z, Tan G R, Huang Y J, Song Y H. Experiment Technology of Botanical Physiology. Shenyang: Liaoning Science and Technology Press, 1989: 6, (in Chinese) [25] 张 红 梅, 温 中 平, 田 俊 学. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 沙 棘 中 的 维 生 素 C 的 含 量. 国 际 沙 棘 研 究 与 开 发, 2004, 2(3): Zhang H M, Wen Z P, Tian J X. The detection of vitamin C in seabuckthorn by HPLC. The Global Seabuckthorn Research and Development, 2004, 2(3): (in Chinese) [26] 刘 钧, 杜 井 雷, 张 淑 伟, 乔 敏, 马 振 苓, 淹 渍 咸 菜 中 硝 酸 盐 含 量 测 定 的 方 法 探 讨. 中 国 调 味 品, 1998, (6): Liu J, Du J L, Zhang S W, Qiao M, Ma Z L. Discussion of determining methods of nitrate content in pickles. Chinese Condiment, 1998, (6): (in Chinese) [27] 胡 长 敏, 赵 丽 辉, 丁 蕴 铮, 袁 星. 新 鲜 蔬 菜 和 水 果 中 亚 硝 酸 盐 测 定 方 法 研 究. 环 境 化 学, 2000, 19(2): Hu C M, Zhao L H, Ding Y Z, Yuan X. A method for measuring nitrite in fresh vegetables and fruits. Chemistry of the Environment. 2000, 19(2): (in Chinese) [28] 谢 冰, 徐 亚 同. 锌 离 子 对 活 性 污 泥 微 生 物 DNA 序 列 多 样 性 的 影 响. 环 境 科 学 研 究, 2003, 16(4): Xie B, Xu Y T. The effect of zinc ions on activated sludge microbes and its DNA sequence diversity analysis. Research of Environmental Sciences, 2003, 16(4): (in Chinese) [29] 王 岩, 沈 其 荣, 史 瑞 和. 土 壤 微 生 物 量 及 其 生 态 效 应. 南 京 农 业 大 学 学 报, 1996, 19(4): Wang Y, Shen Q R, Shi R H. Soil microbial community and their ecological effect. Journal of Nanjing Agricultural University, 1996, 19(4): (in Chinese) [30] 吴 凤 芝, 孟 立 君, 王 学 征. 设 施 蔬 菜 轮 作 和 连 作 土 壤 酶 活 性 的 研 究. 植 物 营 养 与 肥 料 学 报, 2006, 12(4): Wu F Z, Meng L J, Wang X Z. Soil enzyme activities in vegetable rotation and continuous cropping system of under shed protection. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2006, 12(4): (in Chinese) [31] 王 震 宇, 王 英 祥, 陈 祖 仁. 重 茬 大 豆 生 长 发 育 障 碍 机 制 初 探. 大 豆 科 学, 1991, 10(1): Wang Z Y, Wang Y X, Chen Z R. The nature of soybean-soybean cropping. Soybean Science, 1991, 10(1): (in Chinese) Dongling mountain, Beijing ChinaⅡ: Species richness, evenness and species diversities. Acta Ecologica Sinica, 1995, 15(3): (in ( 责 任 编 辑 曲 来 娥 ) Chinese)