138 波 谱 学 杂 志 第 19 卷 Nelson 等 归 属 出 了 羊 水 中 18 种 代 谢 物 的 360 MHz 1 H NMR 谱 [16]. 此 后, 有 关 人 羊 水 中 部 分 代 谢 物 的 含 量 及 其 与 孕 期 和 胎 儿 生 长 状 况 的 关 系 的 NMR

波 谱 学 杂 志 第 19 卷 第 2 期 Vol.19No.2 2002 年 6 月 ChineseJournalofMagneticResonance Jun.2002 文 章 编 号 :10004556(2002)02013706 鸡 胚 羊 水 的 核 磁 共 振 波 谱 分 析 冯 越 1,2, 常 建 华 1, 张 许 2, 刘 买 利 2 (1. 西 北 大 学 化 学 系, 陕 西 西 安 710069;2. 中 国 科 学 院 武 汉 物 理 与 数 学 研 究 所 波 谱 与 原 子 分 子 物 理 国 家 重 点 实 验 室, 湖 北 武 汉 430071) 摘 要 : 羊 水 是 胚 胎 的 正 常 发 育 必 不 可 少 的 物 质, 因 此, 分 析 鸡 胚 羊 膜 内 羊 水 的 组 成 及 含 量, 对 于 研 究 鸡 胚 的 发 育 及 发 育 过 程 中 卵 内 发 生 的 生 物 化 学 变 化 有 着 极 为 重 要 的 意 义. 本 文 应 用 高 分 辨 核 磁 共 振 波 谱 技 术 对 鸡 胚 发 育 过 程 初 期 羊 水 中 的 主 要 代 谢 物 进 行 了 分 析, 检 测 到 了 氨 基 酸 脂 类 葡 萄 糖 乳 酸 等 29 种 代 谢 物, 并 对 它 们 的 1 H NMR 谱 进 行 了 归 属. 关 键 词 : 鸡 胚 羊 水 ; 1 H NMR 归 属 ; 代 谢 物 中 图 分 类 号 :O482.53 文 献 标 识 码 :A 1 引 言 鸡 蛋 的 孵 化 过 程 是 一 个 十 分 复 杂 的 生 命 活 动 过 程, 其 中 包 括 多 种 多 样 的 生 物 化 学 和 生 物 物 理 变 化. 在 鸡 胚 孵 化 的 第 3 天, 羊 膜 腔 形 成, 其 中 很 快 就 积 聚 了 羊 水. 胚 胎 始 终 漂 浮 在 羊 水 中, 这 样 可 以 减 小 外 界 碰 撞 对 胚 胎 的 损 伤, 同 时, 胚 胎 在 羊 水 中 的 运 动 对 其 正 常 发 育 有 促 进 作 用 [1,2]. 从 第 13 天 开 始, 胚 胎 逐 渐 吸 收 羊 水, 当 胚 胎 发 育 成 熟 时 ( 约 18 天 ), 羊 水 几 乎 全 部 被 吸 收 掉 [1]. 在 胚 胎 的 发 育 过 程 中, 羊 水 血 液 和 尿 囊 中 的 营 养 物 质 之 间 存 在 着 荷 尔 蒙 调 控 的 单 向 或 双 向 交 换 [3~6]. 尿 囊 液 与 羊 水 之 间 的 交 换, 可 以 防 止 鸡 胚 胎 腹 部 畸 形 的 发 生 [4,5]. 因 此, 分 析 羊 水 的 组 成 及 相 对 含 量 对 于 研 究 鸡 胚 的 发 育 有 重 要 的 意 义. 核 磁 共 振 波 谱 法 (NMR) 集 定 性 定 量 和 分 离 技 术 于 一 体, 在 复 杂 体 系 ( 如 体 液 组 织 或 植 物 提 取 液 等 ) 的 无 损 分 析 中 具 有 重 要 用 途, 在 研 究 药 物 的 毒 性 和 代 谢 等 方 面 发 挥 着 越 来 越 大 的 作 用 [8~12]. 早 在 1980 年 代 初 期 就 有 人 把 NMR 用 于 研 究 人 羊 水 [13~15]. 收 稿 日 期 :20011207; 收 修 改 稿 日 期 :20020125 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (29925515) 作 者 简 介 : 冯 越 (1975), 男, 陕 西 咸 阳 人, 硕 士 研 究 生 通 讯 联 系 人 电 话 :027-87869107 传 真 :027-87885291 Email:ml.liu@wipm.ac.cn

138 波 谱 学 杂 志 第 19 卷 Nelson 等 归 属 出 了 羊 水 中 18 种 代 谢 物 的 360 MHz 1 H NMR 谱 [16]. 此 后, 有 关 人 羊 水 中 部 分 代 谢 物 的 含 量 及 其 与 孕 期 和 胎 儿 生 长 状 况 的 关 系 的 NMR 研 究 报 道 不 断 出 现 [17~21]. 作 为 鸡 胚 胎 发 育 过 程 的 核 磁 共 振 成 象 和 波 谱 学 研 究 的 第 一 步, 我 们 把 NMR 技 术 用 于 鸡 胚 羊 水 的 分 析, 鉴 定 并 且 归 属 了 29 种 组 分 的 1 H NMR 谱. 2 实 验 实 验 用 新 鲜 的 受 精 鸡 蛋, 在 孵 化 箱 中 进 行 孵 化, 温 度 311±0.2K, 相 对 湿 度 70%. 取 孵 化 5 天 的 鸡 蛋, 固 定 好 之 后 用 镊 子 小 心 地 剥 去 顶 部 的 一 小 部 分 蛋 壳 和 壳 膜, 暴 露 出 胚 胎, 用 一 次 性 注 射 器 抽 取 其 羊 水 0.5mL, 加 入 0.05mL 重 水 (D 2O) 用 于 谱 仪 频 率 锁 定, 制 成 待 测 样 品. 所 有 NMR 实 验 在 BrukerARX500 高 分 辨 核 磁 共 振 谱 仪 进 行, 质 子 共 振 频 率 500. 13 MHz. 使 用 5mm 双 共 振 反 相 探 头. 实 验 温 度 298.2K. 采 用 预 饱 和 脉 冲 (2s,50Hz) 抑 制 水 共 振 峰,30 激 发 角 单 脉 冲 方 法 采 集 一 维 (1D) 1 H NMR 谱, 谱 宽 6kHz, 采 样 点 数 16k, 累 加 次 数 128.Fourier 变 换 (FT) 前 用 高 斯 函 数 (0.4 Hz) 对 时 域 数 据 作 权 重 处 理, 同 时 填 零 至 32k, 以 提 高 分 辨 率. 二 维 (2D) 1 H 1 H COSY 实 验 的 谱 宽 为 4.5kHz, 犉 1 和 犉 2 维 采 样 点 数 分 别 为 512 和 2048, 累 加 32 次, 在 恢 复 期 间 (2s) 和 演 化 期 间 均 进 行 水 峰 抑 制 (50Hz),Fourier 变 换 前 犉 1 维 填 零 至 1024. 3 1 H NMR 谱 的 归 属 从 图 1 所 示 的 羊 水 的 1D 1 H NMR 谱 ( 部 分 区 域 作 了 放 大 ) 可 以 看 出, 羊 水 中 所 含 的 物 质 十 分 复 杂, 除 含 量 较 大 的 水 ( 吸 收 峰 已 被 抑 制 ) 和 脂 类 物 质 ( 图 中 较 宽 的 共 振 峰 ) 之 外, 还 有 种 类 繁 多 的 氨 基 酸 有 机 酸 糖 类 和 其 他 一 些 有 机 小 分 子 物 质 [27]. 其 中 部 分 物 质 由 于 含 量 较 低, 1 H NMR 信 号 很 弱, 在 高 场 区 (δ0.5~4.5) 谱 峰 严 重 重 叠, 这 些 都 给 [12] 谱 峰 的 归 属 带 来 困 难. 由 于 鸡 胚 羊 水 NMR 谱 没 有 报 道, 人 羊 水 的 NMR 数 据 也 不 全, [27] 而 鸡 胚 羊 水 中 的 代 谢 物 绝 大 多 数 也 存 在 于 血 清 中, 比 较 羊 水 的 1 H NMR 谱 和 人 血 清 的 1 [9] H NMR 谱 可 以 发 现, 除 了 羊 水 中 蛋 白 质 含 量 较 少 外, 尖 锐 的 共 振 峰 的 位 置 和 形 状 极 为 相 似, 说 明 两 者 所 含 的 小 分 子 代 谢 物 的 种 类 基 本 相 同. 这 些 小 分 子 共 振 峰 的 相 对 强 [10] 度 不 同, 表 明 它 们 的 相 对 含 量 有 差 异. 比 较 已 有 的 NMR 数 据 就 可 以 对 鸡 胚 羊 水 的 1 H NMR 谱 中 的 大 多 数 共 振 峰 进 行 可 靠 归 属. 如 在 δ1.33 的 双 峰 和 δ4.12 的 四 重 峰, 在 COSY( 图 2) 谱 中 相 应 的 位 置 上 有 明 显 的 交 叉 峰, 可 以 分 别 指 定 为 乳 酸 的 甲 基 和 αh 的 共 振 峰.δ5.24 和 δ4.65 处 的 特 征 的 二 重 峰 分 别 是 α 葡 萄 糖 和 β 葡 萄 糖 1 位 质 子 的 共 振 信 号. 在 δ1.0 附 近 可 以 清 晰 的 分 辨 出 缬 氨 酸 的 两 个 甲 基 质 子 的 两 组 特 征 的 二 重 峰 (δ0. 98,δ1.04), 在 COSY 谱 可 以 清 楚 地 观 察 到 βh(δ2.25) 和 αh(δ3.59) 的 交 叉 峰. 异 亮 氨 酸 的 两 个 甲 基 峰 出 现 在 δ0.92 处 ( 三 重 峰 ) 和 δ1.01 处 ( 二 重 峰 ). 亮 氨 酸 的 两 个 甲 基 峰 别 出 现 在 δ0.94( 二 重 峰 ) 和 δ0.96 处 ( 二 重 峰 ). 低 场 区 (δ8.50~ 6.50) 吸 收 峰 的 特 征 明 显 又 没 有 重 叠, 比 较 容 易 归 属 ( 图 1). 对 于 重 叠 严 重 的 NMR 谱 的 归 属,COSY 谱 的 优 势 能 够 得 到 充 分 体 现. 从 图 2 所 示 的 部 分 COSY 谱 很 容 易 找 到 天 冬 氨 酸 (δ2.64 和 δ2.80) 和 天 冬 酰 胺 (δ2.77 和 δ2.89)

第 2 期 冯 越 等 : 鸡 胚 羊 水 的 核 磁 共 振 波 谱 分 析 139 的 两 个 磁 不 对 称 的 βch 2 之 间 的 交 叉 峰, 进 而 使 αch 的 位 置 得 以 确 定 ( 图 2, 表 1). 肌 醇 瓜 氨 酸 赖 氨 酸 和 苏 氨 酸 等 的 存 在 及 其 共 振 峰 的 化 学 位 移 也 通 过 COSY 谱 中 的 交 叉 峰 得 到 确 证 ( 表 1). 谷 氨 酰 胺 和 谷 氨 酸 αh 的 化 学 位 移 十 分 接 近 并 受 脂 肪 宽 峰 的 影 响 而 分 辨 不 清, 但 它 们 的 两 个 βch 2 的 化 学 位 移 有 所 区 别, 通 过 COSY 谱 中 的 交 叉 峰 可 以 得 到 归 属 ( 图 2). 图 1 鸡 胚 羊 水 的 一 维 1 H NMR 谱. 部 分 区 域 进 行 了 放 大. 标 注 了 主 要 共 振 峰 的 归 属, 其 中 L1L10 为 脂 类 物 质 的 共 振 峰 :L1,CH3;L2,(CH2) 狀 ;L3,CH2CH2CO;L4, CH2 CH ;L5,CH2CO;L6, CHCH2 CH ;L78,CH2OCOR;L9,CHOCOR;L10, CH. Fig.1 500 MHz1D 1 H NMRspectrumofchickamnioticfluid.Partsofthespectrum wereenlargedand plotedasinert.assignmentsofthemajorresonanceswerelabeled,wherel1l10representthereso nancesoflipids:l1,ch3;l2,(ch2) 狀 ;L3,CH2CH2CO;L4, CH2 CH ;L5,CH2CO;L6, CHCH2 CH ;L78,CH2OCOR;L9,CHOCOR;L10, CH. 鸡 胚 羊 水 中 的 脂 类 物 质 有 很 强 的 NMR 共 振 峰 ( 图 1,L1L10), 可 能 与 脂 类 在 卵 黄 中 含 量 比 较 高 有 关. 各 个 共 振 峰 的 位 置 根 据 COSY 谱 ( 图 2) 提 供 的 耦 合 关 系 和 文 献 [9~ 12] 进 行 归 属, 其 中 L1 为 CH 3,L2 为 (CH 2 ) 狀,L3 为 CH 2CH 2CO,L4 为 CH 2 CH, L5 为 CH 2CO,L6 为 CHCH 2 CH,L7,L8 为 甘 油 脂 CH 2OCOR,L9 为 甘 油 脂 CHOCOR,L10 为 CH. 说 明 这 些 脂 类 物 质 中 包 括 低 密 度 脂 蛋 白 (L1L3,L5) 不 饱 和 脂 (L2,L4,L6,L10) 和 甘 油 脂 (L7L9) 等. 表 1 列 出 了 鸡 胚 羊 水 中 所 含 主 要 物 质 及 其 1 H NMR 谱 的 归 属.

140 波 谱 学 杂 志 第 19 卷 表 1 鸡 胚 羊 水 中 主 要 物 质 及 其 1 H NMR 谱 的 归 属 Tab.1 Assignmentsof 1 H NMRofamnioticfluidofchickembryo δ No. Compound 1 Hchemicalshiftandmultiplicity 1 lipid(mainlyvldl) 0.88(t);1.27 (m);1.57(m);2.23(m) 2 isoleucine 0.92(t);1.01(d);1.28;1.47;1.96;3.65(d) 3 leucine 0.94(d);0.96(d);1.70(m);3.72(dd) 4 valine 0.98(d);1.04(d);2.25;3.59(d) 5 3hydroxybutyrate 1.19(d);2.31(m);2.38(m);4.13 6 threonine 1.32;3.60(d);4.25(m) 7 citruline 1.57;1.85(m);3.15(t);3.70(m) 8 proline 1.99;2.05;2.34(m);3.34(m);3.45(m);4.12 9 methionine 2.14(s);2.16(m);2.64(t);3.84 10 pyruvate 2.38(s) 11 glutamine 2.10;2.44(m);3.72(m) 12 glutamate 2.06;2.34(m);3.71(m) 13 alanine 1.47(d);3.77(q) 14 unsaturatedlipids 1.30(m);2.01(m);2.75(m);5.31(m) 15 lactate 1.33(d);4.12(q) 16 lysine 1.48(m);1.72(m);1.92(m);3.03(t);3.75(t) 17 citrate 2.54(d);2.70(d); 18 aspartate 2.64(dd);2.80(dd);3.94(dd) 19 asparagine 2.77(dd);2.89(dd);3.98(dd) 20 tyrosine 3.02(dd);3.17(dd);3.90(dd);6.88(d);7.18(d) 21 histidine 3.08(dd);3.26;3.95(t);7.03(s);7.74(s) 22 choline 3.22(s);3.66(m);4.29(m); 23 βglucose 3.25(dd);3.41(t);3.45(dd);3.47(m);3.72(m);3.92(dd);4.65(d) 24 αglucose 3.42(t);3.53(dd);3.71(t);3.76(m);3.83(dd);3.84(m);5.24(d) 25 phenylalanine 3.08(dd);3.26;3.92(t);7.33(d);7.37(t);7.43(t) 26 tryptophan 3.11;3.23;4.65;7.19;7.28(t);7.54(d);7.75(d) 27 myoinositol 3.28(t);3.56(dd);3.63(dd);4.06(t) 28 glyceryloflipids 4.07(m);4.27(m);5.20(m) 29 formate 8.46(s) :s,singlet;d,doublet;dd,doubletdoublet;t,triplet;m multiplet.chemicalshiftreferencedtoch3oflactateat 1.33for 1 H. 4 结 论 本 文 应 用 1D NMR 和 2DCOSY 方 法 确 定 了 羊 水 中 主 要 代 谢 物 及 其 共 振 峰 的 归 属, 结 果 表 明 羊 水 的 高 分 辨 1 H NMR 谱 能 够 提 供 丰 富 的 生 化 组 成 信 息. 由 于 NMR 实 验 无 需 任 何 样 品 预 处 理, 因 此, 能 够 准 确 反 映 和 监 测 鸡 胚 的 自 然 孵 化 和 发 育 过 程 中 的 生 物 化 学 过 程. 此 外, 利 用 定 量 NMR 的 方 法 还 可 对 孵 化 过 程 中 羊 水 中 代 谢 物 的 物 质 含 量 变 化 进

第 2 期 冯 越 等 : 鸡 胚 羊 水 的 核 磁 共 振 波 谱 分 析 141 行 跟 踪 观 测, 进 而 研 究 鸡 胚 发 育 过 程 中 所 吸 收 的 营 养 物 质 和 代 谢 的 产 物 是 否 有 种 类 或 数 量 上 的 改 变. 图 2 鸡 胚 羊 水 的 二 维 1 H 1 H COSY 谱. 图 中 交 叉 峰 的 归 属 (1~29) 见 表 1 Fig.2 500 MHz2D 1 H 1 H COSYspectrumofamnioticfluidofchickembryo.Assignmentsofthe numberedcrosspeaksaregivenintab.1 参 考 文 献 [1] SmithA H,AbbotU K,MorzentiA.Physiologist[J],1984,27:141-142. [2] 蒋 日 希 东. 鸡 胚 发 育 图 谱 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,1983. [3] HohlwegA,HareT,MilakofskyL, 犲 狋 犪 犾.GenCompEndocrinol[J],1999,114(3):378-386. [4] OlgunerM,AkgurF M,OzdemirT, 犲 狋 犪 犾.PediatrNeurosurg[J],2000,33(5):252-256. [5] AktugT,UcanB,OlgunerM, 犲 狋 犪 犾.EurJPediatrSurg[J],1998,8(6):326-328.

142 波 谱 学 杂 志 第 19 卷 [6] PiechotaR,MilakofskyL,NibbioB, 犲 狋 犪 犾.CompBiochem PhysiolA MolIntegrPhysiol[J],1998,120(2): 325-337. [7] tenbusch M,MilakofskyL,HareT, 犲 狋 犪 犾.CompBiochemPhysiolAPhysiol[J],1997,116(2):131-136. [8] Liu M L,NicholsonJK,ParkinsonJA, 犲 狋 犪 犾.AnalChem[J],1997,69:1504-1509. [9] NicholsonJK,FoxalPJD,SpraulM, 犲 狋 犪 犾.AnalChem[J],1995,67:793-811. [10] LindonJC,NicholsonJK,EveretJR.AnnualreportsonNMRspectroscopy[J],1999,38:1-88. [11] LindonJC,HolmesE,NicholsonJK.ProgNMRSpectroscopy[J],2001,39:1-40. [12] BelJD.EncyclopediaofNuclearMagneticResonance[M].Chichester:John Wiley&SonsLtd,1996,989-1001. [13] BeneBC.PhysiolChemPhys[J],1980,12(3):241-247. [14] BorcardB,HiltbrandE,MagninP, 犲 狋 犪 犾.PhysiolChemPhys[J],1982,14(3):189-192. [15] BeneGJ,BorcardB,GrafV, 犲 狋 犪 犾.ZNaturforsch[J],1982,37(5-6):394-398. [16] NelsonTR,GiliesRJ,PowelD A, 犲 狋 犪 犾.PrenatDiagn[J],1987,7(5),363-372. [17] SimsCJ,FujitoDT,BurholtDR, 犲 狋 犪 犾.PrenatDiagn[J],1993,13(6):473-480. [18] McGowanPE,ReglinskiJ,WilsonR, 犲 狋 犪 犾.JPharmBiomedAnal[J],1993,11(8):629-632. [19] BockJL.ClinChem1994,40(1):56-61. [20] LeMoyecL,MulerF,EugeneM, 犲 狋 犪 犾.ClinBiochem[J],1994,27(6):475-483. [21] McGowanPE,LawrieW C,ReglinskiJ, 犲 狋 犪 犾.JPerinatMed[J],1999,27(5):404-408. 1 犎 犖 犕 犚 犛 犘 犈 犆 犜 犚 犗 犛 犆 犗 犘 犢 犗 犉 犃 犕 犖 犐 犗 犜 犐 犆 犉 犔 犝 犐 犇 犗 犉 犆 犎 犐 犆 犓 犈 犕 犅 犚 犢 犗 1,2 犉 犈 犖 犌 犢 狌 犲, 犆 犎 犃 犖 犌 犑 犻 犪 狀 犺 狌 犪 1, 犣 犎 犃 犖 犌 犡 狌 2 2, 犔 犐 犝 犕 犪 犻 犾 犻 (1.DepartmentofChemistry,NorthwestUniversity,Xi'an710069,China; 2.StateKeyLaboratoryofMagneticResonanceandAtomicand MolecularPhysics, WuhanInstituteofPhysicsand Mathematics,Wuhan430071,China) 犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋 : 1 H NMRspectroscopyofamnioticfluidofchickembryowasreportedforthe firsttime.29compounds,includingaminoacids,organicacids,carbohydratesandlip ids,wereobservedandtheir 1 H NMRresonanceswereassignedusingoneandtwodi mensionalnmr methods. 犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊 :amnioticfluidofchickembryo; 1 H NMRassignment;metabolites Correspondenceauthor