快速参考手册 Q View OT2 试剂盒 Catalog Number A29900 Pub. No. MAN0014580 Rev. C.0 2. 将 2 个装有 Ion OneTouch Breaking Solution 的回收 管装入离心机的相应位置 注 : 有关安全性和生物危害指南, 请参阅 Q View OT2 Kit User Guide (Pub. no. MAN0014579) 中 安全性 附录 请阅读安全性数据表 (Safety Data Sheets (SDS)) 并遵循操作指导 操作时请穿戴合适的护目镜 保护性的实验服及实验手套 重要! 如果您在 Ion OneTouch Dx 系统上使用 Torrent Suite Assay Development Software 1, 请参阅 Ion PGM Hi-Q View OT2 Kit on the OneTouch Dx System in Assay Development Mode User Guide (Pub. No. MAN0015753) 运行 ION ONETOUCH 2 仪器... 1 配置 ION ONETOUCH 2 仪器... 1 开始运行... 2 回收带模板的 ISPS... 3 清洗 ION ONETOUCH 2 仪器... 3 富集带模板的 ION PGM HI-Q VIEW ISPS... 4 运行 Ion OneTouch 2 仪器 重要! 确认仪器已更新最新版固件配置 更新固件的方法请参阅 Ion OneTouch 2 System User Guide(Pub. No. MAN0014388) 中的详细介绍 1. 关闭离心机盖, 点击主屏幕上的 Run 按钮 2. 点击下拉菜单, 根据您的文库读长, 选择 PGM: Ion PGM Hi-Q View OT2 Kit 200, 或者 PGM: Ion PGM Hi-Q View OT2 Kit 400, 然后点击 Next 3. 点击 Assisted 并在屏幕提示下完成配置, 或者点击 Expert 并根据以下指导完成仪器配置 配置 Ion OneTouch 2 仪器 安装 Ion OneTouch 回收管和 Ion OneTouch 回收搭 桥 1. 在两个 Ion OneTouch 回收管中各添加 150μL Ion OneTouch Breaking Solution 1 Ion OneTouch Dx 系统使用的 Torrent Suite Assay Development Software 仅限于科学研究, 不用于临床诊断 1 3. 在离心机中央处装好回收搭桥 4. 关上离心机盖 安装 Ion OneTouch 扩增板 移除已使用过的清洗适配器, 装入扩增反应板, 拉动手柄以 合上热盖 将一次性胶管穿过胶管阀 安装一次性针头 注意! 表面灼热 在此区域附近工作时请小心不要被灼热的部件烫伤 警告! 安全危害 请不要将易燃易爆物品用于本仪器 为确保安全, 请仅选用本仪器专用试剂耗材 注意! 身体伤害危害 一次性针头的末端可能会刺破您的皮肤 请勿用手触碰一次性针头末端 插入一次性针头, 然后通过按压 - 释放注射针头插孔来确认一 次性针头在回收搭桥上已自动固定到正确位置 您应该能听到一声 咔嗒 安装试剂管 1. 在仪器左前方标记处添加 Ion One Touch Oil 颠倒混匀 Ion One Touch Oil 试剂瓶 (450 ml 试剂瓶 ) 三次 然后向试剂管中注入 Oil 至半满, 将试剂管安装 回原处 尽量减少气泡 2. 在仪器右前方标记处添加 Ion One Touch Recovery Solution 颠倒混匀 Recovery Solution 试剂 瓶三次, 然后向试剂管中注入约 1/4 体积的 Recovery Solution 将试剂管安装回原处 尽量减少气泡
清空废液缸 合理处置废液 准备扩增反应液 1. 准备如下试剂 : 试剂 Q Reagent Mix Q Enzyme Mix Q ISP 准备 1. 使用前使试剂恢复至室温 2. 涡旋震荡 30s, 瞬离 2s 3. 使用时将试剂放置在室温 溶解后未用的试剂请保存在 2-8 C 用前瞬离 2s, 放置在冰上待用 使用前放置在室温待用 顺序 试剂 管盖颜色 体积 1 无核酶水 25 μl 2 Q View 棕色 50 μl Enzyme Mix 3 稀释后的文库 ( 不是文库保存液 ) 25 μl 4 Q View ISPs 黑色 100 μl 总体积 1000 μl 重要! 如果您是进行没有参考序列的 de novo 测序, 请向扩增反应液中加入 10 μl Ion PGM Calibration Standard (Cat. No. A27832), 并将无核酶水的体积降至 15 μl 并在 Torrent Browser 中创建测序计划时, 在 Kits 标签页的 Base Calibration Mode 下拉菜单中选择 Enable Calibration Standard 5. 将第 4 步中准备好的全部扩增反应液使用最大转速涡旋震荡 5s 2. 根据您的文库类型和浓度, 按照下表稀释文库 稀释后的文库请在 48 小时内使用 Ion Ampliseq DNA 文库 Ion Ampliseq RNA 文库 gdna 片段化文库或扩增子文库 Ion Total RNA- Seq 文库 文库浓 100 pm 100 pm 100 pm 100 pm 度 文库体 2 μl 4 μl 6.5 μl 5 μl 积 无核酶 23 μl 21 μl 18.5 μl 20 μl 水 总体积 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl a. 涡旋震荡稀释后的文库 5s, 然后瞬离 2s b. 将稀释后的文库放置在冰上待用 3. 准备 Q View ISPs: a. 最大速度涡旋震荡 ISPs 1min 以充分重悬 ISP 微珠 b. 将 ISPs 瞬离 2s c. 用移液器反复吹吸混匀 ISPs d. 立即进行下一步操作 4. 在含有 800 μl Q View Reagent Mix 的 2mL 管 ( 紫盖 ) 中, 按指定顺序加入以下组分 每加入 一种组分后, 使用移液器吹吸混匀扩增反应液 立即进行 填充并安装 Ion OneTouch Reaction Filter 填充并安装 Ion OneTouch Reaction Filter 重要! 我们推荐您在 PCR 扩增前制备区或者可控的 PCR 反应制备通风橱中完成反应过滤器填充 请不要混用其他模板制备试剂盒中的反应过滤器 (reaction filter) 1. 用移液器吸取 1000 μl 制备好的扩增反应液, 从加样孔加入 Ion OneTouch Reaction Filter 2. 用移液器吸取 850 μl Ion OneTouch Reaction Oil (25mL 试剂瓶 ), 从加样孔加入 Ion OneTouch Reaction Filter 3. 更换移液器吸头并再次从加样孔加入 850 μl Ion OneTouch Reaction Oil 4. 翻转 Reaction Filter 并将其完全安装到 Ion OneTouch 2 仪器顶部三孔的对应位置 开始运行 1. 安装好 Ion OneTouch Reaction Filter 后, 点击 Next 以开始程序运行 重要! 请确认开始运行前在每个回收管内加入 150 μl Ion OneTouch Breaking Solution 当屏幕上出现提醒时, 确认此项并点击 Yes 2
d. 用移液器从管中吸去上清, 留下 100 μl Wash Solution 请注意从液表面以及沉淀的对侧吸取上清 6. 从 Ion OneTouch ES Supplies 试剂盒中取出一个 8 联管 确认 8 联管方形的一侧在左侧 注 : 如果您想放弃本次运行, 点击 Abort, 然后点击 Yes 2. 请在开始运行后 16h 内从仪器上取下样本 在运行结束后的屏幕提示行点击 Next 将直接进入 回收带模板的 ISPs 步骤 回收带模板的 ISPs 1. 运行结束时, 按屏幕提示对样本离心 重要! 如果您在 Ion OneTouch 2 Instrument 仪器对样本离心前取下了样本, 或者在离心后 15min 内没有处理样本, 请在仪器上离心样本 在仪器主屏幕上, 点击 Open Lid, 然后点击 Final Spin, 根据屏幕提示对样本进行离心 注意! 转动伤害 请等待离心机停止转动后再打开盖子 转动的部分会导致受伤 2. 待离心机停止后, 在仪器的显示屏上, 点击 Open Lid 等待离心机盖子弹开, 取下并扔掉 Ion OneTouch 回收搭桥 3. 从仪器上取下两个 Ion OneTouch 回收管并放置在管架上 4. 从回收管中吸去上清, 留下约 100 μl 回收液 暂停点 : 向每一个回收管中加入 500 μl Ion OneTouch Wash Solution 并反复吹吸以分散 ISPs 将悬浊液转移至标记好的新 1.5 ml Eppendorf LoBind 离心管中 ISPs 可在 2-8 C 条件下保存 3 天 富集前,15,500 X g 转速下将 ISPs 离心 2.5min 仔细的从回收管中吸去上清, 留下约 100 μl 回收液 用一个新的移液吸头上下吹打以重悬 ISPs 进行第 6 步 5. 处理 ISPs: a. 向每个回收管中加入 500 μl Ion OneTouch Wash Solution b. 反复吹打 ISPs 使其分散, 然后将悬浊液转移至标记好的新的 1.5 ml Eppendorf LoBind 离心管 注 : 如果有沉淀,50 C 孵育 2 分钟以使其溶解 7. 反复吹吸 ISPs 10 次以混匀, 然后将其转移至 8 联管的孔 1 中 8. 从孔 1 中分装部分未富集的 PGM Hi-Q View OT2 试剂液体用于质控 选择下列一种仪器对带模板的未富集 ISP 进行质控 :Qubit 2.0 或 Qubit 3.0 荧光计, Guava easycyte 5 Flow Cytometer 使用 Ion OneTouch ES 富集带模板的 ISPs, 您可以在 Ion OneTouch 2 仪器进行清洗的时候进行该操作 重要! 不要在 -30 C~-10 C 保存回收的带模板的 ISPs 不要在 Ion PGM OT2 Recovery Solution 中保存 ISPs( 参阅这一部分的第 4 步 ) 清洗 Ion OneTouch 2 仪器 重要! 为确保持续的安全操作, 请定期检查转子和离心机内壁以确保没有裂痕或者其他的物理损伤 根据本节的清洗步骤用清洗适配器对 Ion OneTouch 2 仪器进行清洗 每次运行后都需要执行清洗步骤 1. 选择合适的试剂以对 Ion OneTouch 2 仪器进行维护 如果您是 从其他试剂盒转至 PGM Hi-Q View OT2 试剂盒 已经在用 PGM Hi- Q View OT2 试剂盒 您需要 参阅 Ion One Touch 2 System User Guide (Pub. no. MAN0014388) 第五章 选择对应试剂盒中的试剂对 Ion OneTouch 2 进行维护 执行第 2 步 继续使用 PGM Hi-Q View OT2 试剂盒提供的试剂 3 c. 15,500 x g 将 ISPs 离心 2.5min
2. 确保管中有 20 ml Ion OneTouch Oil( 左边的反应管 ) 如果不足, 向管中倒油至半满 3. 取下并合理丢弃用过的 Ion OneTouch 2 Reaction filter 4. 将一次性的 3 孔清洗适配器紧紧的插入 Ion OneTouch 2 仪器顶部平台的相应 3 个孔里 5. 取一个 50-mL 离心管放在管架上, 然后将带有该管架放在仪器的右侧 条件第一次使用仪器以及每个月的维护期 常规使用时孔 1 和孔 8 中的残液体积 >5.0 μl 常规使用时孔 1 和孔 8 的残液体积 <=5.0 μl 操作执行残液测试 ( 参照 Ion OneTouch ES Instrument installation, setup and maintenance )in the Ion OneTouch 2 System User Guide, Pub. No. MAN0014388 不需要执行残液测试 进行 准备试剂并填充 8 联管 步骤 注 : 步骤 6-9 仅适用于您在从仪器上拿走回收管之前, 没有将一次性的注射针拿掉 6. 轻柔的拉拽阀门两侧的胶管将其从阀门中拉出来 7. 从 Ion OneTouch DL 注射器插孔中拔出一次性针头 注意! 身体伤害危害 一次性针头的尖端可能会刺破您的皮肤 请远离一次性针头的尖端 准备试剂并填充 8 联管 制备 Melt-Off 溶液 按以下顺序混合如下组分以制备新鲜的 Melt-Off 溶液 顺序 组分 体积 1 Tween Solution 280 μl 2 1 M NaOH 40 μl Total 320 μl 8. 将用过的一次性针头插入仪器右侧管架中的空 50 ml 离心管中 这个 50 ml 离心管将用于收集废液 9. 在仪器的主屏幕上点击 Clean 10. 完成每一项任务, 然后点击 Next 在您点击最后一项任务上的 Next 之后, 屏幕上会出现一个进度条, 提示清洗开始 11. 在清洗运行结束时, 屏幕上显示 Time Remaining 00:00:00, Cleaning Run Complete 点击 Next 然后确认屏幕上出现了黑体的任务提示 Remove plate, injector, conical tube, and waste. 注 : 请在两次运行之间, 将用过的清洗适配器保留在仪器上 12. 选择合适的方法处理 50 ml 离心管中的废液 13. 取下并选择合适的方式处理扩增板, 一次性针头, 以及胶皮管 注意! 表面灼热 在此区间附近工作时请小心不要被灼热的部分烫伤 14. 在仪器的显示屏上点击 Open Lid, 等待离心机盖子弹开的声音, 然后打开离心机的盖子 用一次性的 Kimwipes ( 无尘纸 ) 擦拭离心机盖子上的残液, 然后关上离心机的盖子 15. 点击 Next 以回到仪器主页面 重要! 按需制备 Melt-Off 溶液, 制备 1 天后需使用恰当方式处理 冲洗并重悬 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads 1. 涡旋震荡 30s 以将 beads 重悬, 然后离心 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads 的管子 2s 2. 打开管子, 用新的移液器吸头上下吹打 beads 中的黑色芯块直至所有芯块散开 迅速进行下一步 3. 转移 13 μl Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads 值一个新的 1.5-mL Eppendorf LoBind 管中 4. 将管子放在 DynaMag -2 magnet 磁力架上 2min, 然后小心的吸去上清, 不要触碰底部的 Dynabead MyOne Streptavidin C1 Beads 5. 向管中的 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads 中加入 130 μl MyOne Beads Wash Solution 6. 将管子从磁力架上取下来, 涡旋震荡 30s, 离心 2s 填充 8 联管 1. 确认从 Ion OneTouch 2 仪器上取下来的带模板的 ISPs 悬在 100 μl Ion OneTouch Wash Solution 中并填充在 8 联管的孔 1 中 富集带模板的 Q View ISPs 确认是否需要残液测试 4
2. 如果您还没有对带模板的未富集的 ISPs 珠子进行质控, 可使用 Qubit 2.0 或 Qubit 3.0 荧光计或 Guava easycyte 5 Flow Cytometer 对其进行质控 注 : 参见 Qubit 2.0 Fluorometer User Guide (Pub. No. MAN0016387), 或 Qubit 3.0 Fluorometer User Guide (Pub. No. MAN0016388) 中的详细步骤描述使用 Ion Sphere Assay 检测未富集样品中含扩增模板 ISP 比例 3. 根据以下说明填充 8 联管 ( 请参阅第 4 步的图片 ): 孔 1 2 孔 2 孔 3 孔 4 孔 5 孔 6 孔 7 孔 8 孔序号 孔中的试剂 全部回收的 ISP 样本 [100 μl] 130 μl 悬在 MyOne Beads Wash Solution 中的 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads [ 冲洗并重悬 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads 步骤中制备 ] 300 μl Ion OneTouch Wash Solution 300 μl Ion OneTouch Wash Solution 300 μl Ion OneTouch Wash Solution 空孔 300 μl 新鲜制备的 Melt-Off 溶液 [ 制备 Melt-Off 溶液 步骤中制备 ] 空孔 配置 Ion OneTuch ES 每次在 Ion OneTouch ES 仪器上运行富集的时候, 安装一个新的 Eppendorf LoRetention Dualfilter P300 移液吸头和新的 PCR 管 1. 向新的 0.2mL PCR 管中加入 10uL Neutralization Solution 2. 将含有 Neutralization Solution 的 PCR 管开盖后放置在吸头架基座上的孔中, 见步骤 4 中图示 3. 在吸头架中装上一个枪头 从支架上拿下移液臂, 然后将其对准枪头 4. 保持移液臂垂直, 向下压移液臂, 使吸头安装在移液臂上 压住 ~1s 以保证吸头牢固的安装在移液臂上 4. 确认方形的一侧朝左, 然后将 8 联管靠右侧放入槽中 5. 向上抬起移液臂, 使吸头脱离吸头架 6. 将移液臂重新放回支架上 重要! 确认移液臂的后面 / 底部没有倚靠在支架上, 否则会引起移液臂向前倾斜 2 离 8 联管方形一侧近的孔 5 开始运行
开始运行之前 : 确认将加好 Neutralization Solution 的 0.2-mL PCR 管以及新的移液吸头装载完毕, 确认 8 联管装载正确 确认 8 联管孔 1(ISP 样本 ) 在最左侧且 8 联管被推到槽的最右侧 1. 在开始运行前, 用移液器吹吸孔 2 中的 beads 不要在溶液中引入气泡 2. 打开 Ion OneTuch ES 并等待仪器进行初始化 屏幕会显示 rdy 枪头臂会运行一系列初始化的运动并回到起始位置 (~5s) 3. 点击 Start/Stop 屏幕在运行期间会显示 run 运行时间 ~35min 4. 运行结束时, 仪器屏幕显示 End 并鸣响 60s 点击 Start/Stop 按钮关闭警报并为下一次运行重置 Ion OneTuch ES 仪器在多次运行之间无需重启电源 5. 运行结束后迅速将装有富集后的 ISPs 的 PCR 管盖严并从仪器上取下 6. 轻轻的颠倒 PCR 管 5 次以混匀其中的液体 测序或者保存带模板的 ISPs 使用 Q View Sequencing 试剂盒 (Cat. no. A30044) 进行测序 参阅 Ion PGM Hi Q View Sequencing Kit User Guide (Pub. no. MAN0014583) 或者, 保存富集后的 ISPs, 可在 2 C~8 C 最多保存 3 天 进行富集后的 Ion Sphere Particles 质控 您可使用 Guava easycyte 5 Flow Cytometer 检测富集 效率 向 1.5 ml Eppendorf Lobind Tube 中转移 1.0 μl 的富集后的 ISPs 液体 请参阅 Thermofisher 网站 (thermofisher.com) 的 Ion Sphere Particles Quality Assessment Using the Guava easycyte 5 flow Cytometer User Bulletin (Pub. No. MAN0015799) 注 : 确认 0.2 ml 的 PCR 管中含有 >200 μl 含有富集后 ISP 液体 仪器成功运行一次以后, 您应该得到 ~230 μl 含有 Melt-Off Solution, Ion OneTouch Wash Solution, 和 Neutralization Solution 的混合样品 如果管中带有富集后 ISPs 的液体 <<200 μl, 请联系技术支持 7. 取下用过的移液吸头 : 使移液臂保持在支架上, 向上抬起移液臂, 然后从移液臂上取下吸头 重要! 错误的方法取下吸头会导致移液臂上的金属接头松动, 并会影响仪器的运行 8. 取下并丢弃用过的 8 联管 6