Ion-S5-520&530-Chef试剂盒快速参考手册

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1 快速参考手册 Ion 520 & Ion 530 Chef 试剂盒 Catalog Numbers A27757, A3000 Pub. No. MAN Rev. D.0 注 : 有关安全性和生物危害指南, 请参阅 Ion 520 & 530 Kit Chef User Guide (Pub. no. MAN000846) 中 安全性 附录 请阅读安全性数据表 (Safety Data Sheets(SDS)) 并遵循操作指导 操作时请穿戴合适的护目镜 保护性的实验服及实验手套 创建实验计划... 稀释样品文库... 稀释质控文库 ( 如使用 )... 准备文库和耗材... 配置 ION CHEF 系统... 2 开始 ION CHEF 运行... 3 拿出芯片并准备测序... 4 当需要手动清洗测序仪时... 4 初始化测序仪... 4 开始测序反应运行... 4 清洗 ION CHEF 仪器... 4 创建实验计划. 使用 Torrent Browser 登陆 Ion Torrent 服务器 (Torrent Sever) 浏览页面 2. 选择 Plan 标签页, 点击 Templates, 选择将要运行的应用类型 ( 如 Whole Genome), 然后选择 Plan Run 或者 Plan New Run 3. 在实验计划的向导页面, 查阅每一页屏幕内容并根据实验进行编辑 在 Kits 标签页中, 选择 Ion Chef, 并在 Template Kit 下拉菜单中选择 Ion 520 & 530 Kit Chef 选项 ; 在 Sequencing Kit 下拉菜单中选择 Ion S5 Sequencing Kit 选项 ; 然后在 Plan 标签页中的 Sample Tube Label 区域输入或者扫描 Ion Chef Library Sample Tube 的条形码 (Barcode) 4. 当完成了全部选择以后, 点击 Plan 标签页右下方的 Plan Run 按钮以保存实验计划 保存好的实验计划会以您录入的名称呈现在 Planned Run 页面的列表中, 并会在加载相关样品的时候自动被 Ion Chef 系统调用 稀释样品文库 根据下表稀释 200bp 和 400bp 的文库储液 如果有必要的话, 根据测序结果中多克隆和低质量的过滤结果来进一步调整文库用量以达到最优上样浓度 文库读长 推荐浓度 每 25μL 的分子数 实验计划中选择的模板长度 <300bp 40-60pM x bp 80-20pM.2-.8 x 稀释质控文库 ( 如使用 ) 如果您是在故障排查实验中运行质控文库 (control library), 请在 Ion S5 Control Kit Plus (Cat. no.a30729) 中找到 Human CEPH Control 200 Library 或者 E. coli DH0B Control 400 Library, 根据下表进行稀释 : 质控文库文库体积无核酶水体积 Human CEPH Control 200 Library E. coli DH0B Control 400 Library 准备文库和耗材 μl 24 μl μl 84 μl. 使用前 45 分钟打开 Ion 520 & 530 Chef Reagent Cartridge 的包装, 使其平衡至室温 重要! 反应试剂盒 (reagent cartridge) 必须在使用前 45 分钟置于室温中 2. 用移液器吸取 25μL 稀释后的文库 ( 见第 页的 稀释样品文库 部分 ), 加至 Ion Chef Library Sample Tube 的管底 ( 带标志的样品管 ) 3. 盖上管盖并将两个稀释好的文库放置在冰上待用, 等待 Ion Chef 上机 4. 拆掉所有耗材及试剂盒的外包装, 将所有耗材放在 Ion Chef 仪器旁的实验台上待用 重要!. 使用前将带有反应液的反应试剂盒轻轻在试验台上敲打使管内溶液全部落于管底 2. 瞬离 NaOH 管 (Reagent Cartridge, 位置 C) 以收集所有液体 文库长度是指插入片段平均长度加上接头后的长度

2 配置 Ion Chef 系统 重要! Chef 的标称离心速度仅适用于配套离心吊篮和芯片 试剂管耗材和样品制备试剂 芯片上样离心机仅适用于配套离心吊篮在设定转速内对配套芯片和芯片适配器的离心 使用离心机需要注意平衡配置, 安装时请确认吊篮安装 如果使用时发现噪声振动过大, 请检查离心机吊篮安装且已配置平衡 仅使用 Ion 520 & 530 Kit Chef 试剂盒所提供的试剂耗材, 并在离心机标称速度范围内使用 不要移除或者改动离心机转子 每次使用前仔细检查离心吊篮的安装, 确保仪器的正确运行 确认仪器电源已打开并在上次使用后已进行过清洁 确认所有的安装组分在安装至 Chef 仪器前都时干净且干燥的 确认 Chef 仪器上的试剂和溶液模块位置在安装相应组份前没有凝水 请根据如下步骤按顺序配置 Ion Chef 仪器 下图所示为一台完全配置好的 Ion Chef 仪器 5. 下滑吸头锁支架的滑卡, 把吸头锁支架推向仪器内部 在 New Pipette Tip Position 上放置好 Tip Cartridge 后将头锁支架拉回原来位置锁好以固定好移液吸头盒 6. 将新的 PCR 反应板放在热循环模块中, 然后将新的 Frame Seal v2 插入自动加热盖的下方 安装试剂和溶液模块. 在实验台上轻磕 Ion 520 & 530 Chef Reagents Cartridge, 使试剂全部落在反应管底部 2. 将试剂模块安装至仪器的 Reagent Cartridge 位置, 确认它已正确安装到位, 并与台面水平 3. 打开两个装有 25μL 稀释文库的 Library Sample Tubes 的管盖, 别将其放入 reagent cartridge 的 A B 位置 4. 打开反应盒上 C 位置装有 NaOH 的反应管和 D 位置空反应管的盖子 5. 在实验台上轻轻拍打 Ion S5 Chef Solutions Cartridge 使溶液全部落在反应管底部 6. 将反应盒平稳的放在 Solutions 位置中, 使其完好入位 配置 Recovery Tubes and Enrichment Cartridge v2 安装吸头盒及 PCR 板. 点击仪器触摸屏上的 按钮 ( 开门 ) 以打开仪器门, 并等待门闩自动打开 2. 向上抬起仪器门至顶端至门闩卡住 3. 将空的吸头盒安装到旧吸头位置 ( 废液收集区 ), 然后 更换手套 4. 打开一个新的 Tip Cartridge 包装, 去掉包装盖后将吸头 架整个安装至新移液吸头位置 2. 将 6 个 Recovery Tubes (v2) 分别放入 Recovery Centrifuge 中 ( 六个一组, 共两组 ) 2. 将两个 Recovery Station Disposable Lid v2 分别盖在离心机上, 用力下压 沿盖子外延下压以确认盖子完全扣好在仪器上 3. 关上 Recovery Centrifuge 外面的盖子 4. 将 Enrichment Cartridge v2 平稳的放在仪器的相应位置上, 向下轻压使其完好入位 配置芯片加样离心机. 将测序芯片放置在芯片离心篮上, 然后将芯片适配器 (Chip Adapter) 盖到离心篮上

3 a. 将芯片放入芯片篮, 芯片适配器的孔对准芯片孔, 固定芯片适配器的方向使芯片二维码可见 b. 将芯片适配器放在芯片上, 将芯片适配器固定卡扣端卡入芯片篮的卡缝中 c. 轻轻挤压芯片适配器的弹性卡扣端, 使芯片适配器可以卡入芯片篮使其完全锁住 d. 确认芯片适配器的四角都已卡在芯片篮的相应位置 如果芯片适配器安装不合适, 会导致 loading 失败 4. 按照仪器屏幕上的提示关门 关门时首先向上方抬起仪器的门以解开上部门锁, 然后向下关门直至下部电子锁锁上 当门关闭以后, 仪器激活视觉系统 5. 屏幕上出现提示以后, 点击 Start check 以启动 Deck Scan 等待仪器扫描所有耗材和反应试剂的条形码来确认它们的存在和兼容性 6. Deck Scan 完成以后, 点击 Next 使屏幕上显示 Data Destination 页面. 7. 确认仪器显示了正确的试剂盒类型 芯片类型 芯片条形码和创建的运行程序 (Planned Run) 如果正确的运行程序没有显示出来, 点击下拉菜单中的图标来给每一张芯片选择运行程序, 然后点击 Next 2. 将适配器 / 芯片 / 芯片离心篮组合装入芯片加样离心机 3. 确认离心机负载平衡, 确认芯片篮放置平稳 朝向正确 触碰吊篮可使其翻转 90 角 然后合上离心机外盖 确认所有的试剂耗材都已正确安装在进行下一步之前 : 确认每一个试剂盒的朝向和位置正确 按压所有的试剂盒以确认都已平稳的固定在相应位置上 确认 Ion 520 & 530 Chef Reagent Cartridge 上的所有反应管都打开了盖子且固定在指定位置上 确认离心机盖子安装正确, 确认它的 port 朝向仪器背面 确认反应管和芯片离心篮都平稳的安装在相应的 Chiploading 和 Recovery Centrifuge 上的转子支架上, 确认离心机上的所有耗材安装正确 开始 Ion Chef 运行. 请确将所有的试剂和耗材已正确安装 2. 在 Ion Chef 仪器的主页面, 点击 set up run 选项 3. 选择 Step by Step 选项以根据仪器的引导页面进行设置, 或者选择 Quick Start 选项以跳过仪器设置页面 8. 有需要的话, 在 Run Option 屏幕中, 点击相应的选项来结束运行并输入指定的运行结束时间 9. 在 Run Option 屏幕中, 点击 Start Run 来开始运行 0. 请在 Ion Chef 系统结束芯片加样的 40 分钟前初始化 Ion S5 或者 Ion S5 XL 测序仪. 如果您选择暂停运行来分析模板制备的效率, 请在 Ion Chef 仪器提示的时候取出样本进行检测 ( 约运行开始后的 小时 ) a. 当提示取出质控样本 (QC samples) 的时候, 打开仪器的门 b. 从 Ion 520 & 530 Chef Reagents Cartridge 位置 A 和 B 质控样本转移至新的标记好的离心管中 c. 分析质控样本 注 : 详细步骤请参考如下文档 : Ion Sphere Assay on Qubit 2.0 Fluorometer User Guide (Pub. No. MAN006387), 或 Ion Sphere Assay on Qubit 3.0 Fluorometer User Guide (Pub. No. MAN006388) 可在 thermofisher.com/order/catalog/product/ 链接中找到相关文档 d. 如果您要对富集后的样本进行质量评估, 请从 Enrichment Cartridge v2 的 A 和 E 位置上的管子中取出质控样本转移至新的标记号的离心管中 详情请参阅 Ion 520 & 530 Kit Chef User Guide (Pub. no. MAN000846) 附录 B 中的 补充步骤 3

4 e. 关闭仪器的门, 然后点击 Continue 来完成实验运行 2. 当运行结束后, 取出芯片并立即进行测序 如果您需要 此时对样品进行 QC, 可以在 Reagent 及 Enrichment cartridge 中找到 QC 样品 拿出芯片并准备测序. 打开仪器门 : a. 在仪器的触摸屏上, 点击 ( 开门 ) 按钮后等待门 闩打开 b. 向上轻抬仪器门直到听到锁扣卡住的声音后仪器门卡在上部门锁中卡住 2. 打开芯片加样离心机盖, 从 Ion Chef 仪器中小心取出适配器 / 芯片 / 芯片离心篮组合 使用以下步骤取出芯片 : a. 从芯片离心机中取出适配器 / 芯片 / 芯片离心篮组合 b. 用手压芯片适配器的两端, 打开并扔掉芯片适配器 c. 握住芯片的边缘, 小心的将芯片从芯片离心篮中取出, 将芯片放置在干净的 不受静电干扰的平面上, 然后把芯片离心篮放回芯片离心机 3. 关闭仪器的门 关门时首先向上轻推仪器的门以解开仪器上部的门锁, 然后向下压仪器的门直至仪器门闩锁上 4. 将一张或者两张芯片放入 Ion S5 测序仪并按提示开始测序运行程序 如果您不能马上对一个加好样本的芯片进行测序或者计划一次初始化完成对两张芯片的测序, 请将芯片放置在芯片贮存盒 (Chip storage container) 中并保存于 4 C 直至可以开始对芯片进行测序 ( 最长保存 6-8 小时 ) 重要! 如果您选择保存一张加好样本的芯片, 请在对其进行测序 20 分钟前将其从芯片贮存盒中取出放置在暗处干净的平面上至平衡至室温 当需要手动清洗测序仪时 Ion S5 或者 Ion S5 XL 测序仪需要在初始化之前进行清洗 这种清洗通常是在上一次运行结束后自动进行的 然而, 如果在测序前取消勾选了 Enable post-run clean 选框以允许第二个测序直接运行, 但是却没有进行第二次测序, 仪器会在执行了清洗之后才会允许进行初始化 详情请参阅 Ion 520 & 530 Kit Chef User Guide (Pub. No. MAN000846) 如果在对 Ion S5 或者 Ion S5 XL 测序仪进行初始化以后, 24 小时内并未开始测序, 或者由于意外的断电 取消等行动导致测序终止, 不要直接开始清洗程序 在重新初始化之前需要进行仪器的重置, 详情请参阅 Ion 520 & 530 Kit Chef User Guide 初始化测序仪. 在仪器触屏主页面点击 Initialize 仪器门 芯片 反应试剂盒锁将会相应打开 2. 根据出现的提示, 移除 Ion S5 Wash Solution 试剂瓶 后可拿到废液缸, 取出废液缸并清空 3. 清空废液缸后将其重新安装回原来位置 4. 用已平衡至室温的新 Ion S5 Sequencing Reagent 反 应试剂盒替换掉原来已经过用过的反应试剂盒 5. 打开 Ion S5 Wash Solution 瓶子上的红色封盖, 然后 安装到相应位置 6. 确认前一次运行时使用的测序芯片安装妥当且芯片夹一 直插在芯片槽内部 7. 有必要的话, 安装一瓶新的 Ion S5 Cleaning Solution 8. 关闭仪器门, 点击 Next 9. 初始化结束后 ( 约 ~30-40 分钟 ), 点 Next 回到主页面 仪器现在已经准备就绪, 可以开始测序反应运行 开始测序反应运行 我们推荐您在芯片加样完成并结束初始化后尽快在 Ion S5 或者 Ion S5 XL 测序仪上对加好样的芯片进行测序 仪器初始化后需要 24 小时内开始运行方可成功完成测序反应 注 : 请不要在运行期间按压电源开关 仪器运行期间中断电源可能会导致测序反应失败. 初始化完成后, 在仪器触屏主页面点击 Run 仪器门和芯片夹将会解锁 2. 取出用过的芯片, 将完成加样的测序芯片放入芯片夹 3. 将芯片夹完全推入芯片槽, 关闭仪器门, 点击 Next 4. 确认仪器已自动加载了正确的实验计划 (Planned Run), 然后点击 Review 5. ( 可选项 ) 如果本次测序实验是一次初始化后要进行的两次测序反应中的第一次, 请取消 Post-Run/Clean 选项的复选框然后点击 Review 注 : 除非您点掉了 Post-Run/Clean 选项, 否则仪器会自动执行清洗步骤, 此时将无法直接进行下一个测序 在进行一次初始化的第二个测序实验时, 请确认 Enable post-run clean 选项的复选框已经勾选, 这样仪器在完成测序后将会进行自动清洗 6. 确认其它设置正确, 有必要的话可以用相应按钮和下拉菜单对设置进行修改 7. 确认仪器门关闭, 然后点击 Start run 以开始测序反应 重要! 在反应运行期间, 不要打开仪器的门, 并避免碰触仪器 在测序反应运行期间碰触仪器可能会降低测量的质量. 测序反应运行结束后, 除非取消了 Enable post-run 选项, 仪器将会自动进行清洗 清洗后, 仪器触屏会回到主页面 您可以使用 Torrent Browser 来查阅实验结果 清洗 Ion Chef 仪器 4

5 重要! 请在每次运行后按照如下步骤清洗 Ion Chef 仪器 为了避免污染, 请在清洗之后再对仪器进行操作 取出并扔掉用过的耗材. 在仪器的触屏上, 点击 ( 开门 ) 按钮后等待门闩打开 2. 向上轻抬仪器门直到听到锁扣卡住的声音后仪器门卡在上部门锁中 3. 取下并丢弃 PCR 模块中的 PCR 板 4. 取下并丢弃旧吸头收集位置中的废旧吸头盒 5. 将已经用光的 Tip Cartridge v2 转移至旧吸头收集位置 6. 取下并丢弃以下耗材 : Ion 520 & 530 Chef Reagents cartridge Ion S5 Chef Solutions cartridge Enrichment Cartridge v2 7. 取下并丢弃回收离心机中的耗材, 包括 : Recovery Station Disposable Lids v2 Recovery Tubes v2 8. 合上芯片加样离心机盖 检查并清洗回收离心机和离心吊篮. 检查回收离心机中是否有残留 如果存在过多的液体残留, 请参照 Ion 520 & 530 Kit Chef User Guide (Pub. No. MAN000846) 中介绍的方法清洗离心槽 2. 合上回收离心机盖 开始清洗. 关闭仪器门 关门时首先向上方抬起仪器的门以解开仪器上部门锁, 然后向下关门直至仪器门闩锁上 2. 运行结束后, 在 Ion Chef 仪器的触屏上点击 Next, 启动清洗程序 : 3. 请确认您已从 Ion Chef 仪器中取出除旧吸头盒位置的空吸头盒以外的所有耗材, 然后点击 Next 4. 关闭仪器门以后, 点击 Start 仪器会在执行清洗程序之前启动 Deck Scan Ion Chef 仪器会停止通风设备并启动紫外灯约 分钟 注意!Ion Chef 仪器发射 254nm 波长的紫外光 请在仪器附近操作的时候穿戴合适的护眼镜 保护性的实验服以及实验手套 在仪器执行清洗程序的时候请不要直视仪器的紫外灯 5

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