乳酸脱氢酶 (LDH) 测试盒 Cat numberkgt02424/kgt02448 Store at -20 for 3 months For Research Use Only( 科研专用 ) 说明书修订日期 2015.07.13 一. 测定原理乳酸脱氢酶 (Lactate dehydrogenase LDH) 能催化乳酸生成丙酮酸, 丙酮酸与 2,4- 二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙, 在碱性溶液中呈棕红色, 通过比色可求出酶活力 二. 试剂盒组份 组份 KGT02424 KGT02448 保存条件 24 assays 48 assays Buffer A 15ml 30ml 4 试剂 B 2 支 3 支 冷冻保存 Buffer C 15ml 30ml 室温避光 Buffer D(4M NaOH) 15mL 30ml 密封保存 丙酮酸钠标准液 (2mmol/L) 1 支 1 支 4 Buffer B 辅酶应用液, 试剂 B 每支粉剂加 1.3ml 双蒸水溶解, 溶解后冻存可保存 2 周, 如需多次使用, 建议分装冷冻, 避免反复冻融 buffer A 基质缓冲液 Buffer C2,4- 硝基苯肼 Buffer D4M NaOH 以蒸馏水稀释 10 倍, 成为 Buffer D 工作液 三. 操作步骤 1. 用前请将样本及试剂放置至室温, 按下表步骤进行检测 试剂 标准管 标准空白管 测定管 对照管 2mmol/L 丙酮酸钠标准液 (ml) a* 蒸馏水 (ml) 0.05 0.05+a* 0.05 样品 (ml) a* a* Buffer A(mL) 0.25 0.25 0.25 0.25 试剂 B 工作液 (ml) 0.05 混匀,37 水浴 15min Buffer C(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 混匀,37 水浴 15min Buffer D 工作液 (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 混匀, 室温放置 3 分钟,440nm, 蒸馏水调零,1cm 光径, 测各管吸光度 * 参考取样量 0.2% 小鼠脑组织匀浆取 10~50µl, 大鼠血清取 10~30µl 若样本中 LDH 酶活力太
大, 可将样本用生理盐水稀释后再测 注 1. 测定空白管中不加辅酶 I 2. 严格按照说明书操作, 不可先加辅酶 I 再加基质液 四. 计算 (1) 血清 ( 浆 ) 乳酸脱氢酶定义及计算公式 1 定义1000ml 血清 ( 浆 )37 与基质作用 15 分钟, 在反应体系中产生 1µmol 丙酮酸为 1 单位 2 计算公式 ODU ODC 血清 ( 浆 ) 中乳酸脱氢酶 ( LDH) 活性 ( U / L) = CS N 1000 OD -OD (2) 组织乳酸脱氢酶定义及计算公式 1 定义 每克组织蛋白 37 与基质作用 15 分钟, 反应体系中产生 1µmol 丙酮酸为 1 单位 2 计算公式 ODU ODC 组织中乳酸脱氢酶 ( LDH) 活性 ( U / gprot) = CS C OD -OD 式中 S S B B prot OD U 测定管吸光度值 ; C S 标准浓度 (2mmol/L); OD B 空白管吸光度值 ; N 样品测试前稀释倍数 ; OD S 标准管吸光度值 ; C prot 待测样本蛋白含量 (gprot/ml) OD C 对照管吸光度值 ; (3) 血清 ( 浆 ). 组织中乳酸脱氢酶活力计算 1 血清( 浆 ) 计算举例 取大鼠血清 0.02ml 检测乳酸脱氢酶活力, 测得测定管吸光度为 0.313, 测定空白管吸光度为 0.099, 标准管吸光度为 0.298, 标准空白管吸光度为 0.075 0.313 0.099 血清中 LDH 活力 ( U / L) = 2 1000 1= 1919.28U / L 0.298 0.075 2 组织计算举例 (1) 取 1% 大鼠肺组织匀浆 0.015ml 检测乳酸脱氢酶活力, 测得测定管吸光度为 0.485, 测定空白管吸光度为 0.069, 标准管吸光度为 0.240, 标准空白管吸光度为 0.070,1% 匀浆蛋白浓度为 0.635mg/ml 即 0.635 10 3 g/ml 0.485 0.069 3 组织中 LDH 活力 ( U / gprot) = 2 (0.635 10 ) = 7707.27U / gprot 0.240 0.070
(2) 取 0.2% 小鼠脑组织匀浆 0.02ml 检测乳酸脱氢酶活力, 测得测定管吸光度为 0.472, 测定空白管吸 光度为 0.264, 标准管吸光度为 0.298, 标准空白管吸光度为 0.075,2% 匀浆蛋白浓度为 0.850mg/ml 即 0.850 10 3 g/ml 0.472 0.264 4 组织中 LDH 活力 ( U / gprot) = 2 (0.850 10 ) = 21946.72U / gprot 0.298 0.075 六 附录 附录一 以 ROCHE 公司的乳酸脱氢酶 LDH 标准品做标准曲线附录二 大鼠血浆 LDH 取样量摸索附录三 0.2% 小鼠脑匀浆 LDH 取样量摸索 附录 ( 一 ) ( 以 ROCHE 公司的乳酸脱氢酶 LDH 标准品做标准曲线 ) 7.5U/ml LDH 标准品的配制 取 10µl LDH 标准液 (37 时活力为 7500U/ml) 稀释并定容至 10ml 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 7.5U/ml LDH 标准品 (ml) 0 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 蒸馏水 (ml) 0.04 0.035 0.03 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0 基质缓冲液 (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 2,4- 二硝基苯肼液 (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.4mol/l 氢氧化钠 (ml) 2.5 2.5 2..5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 混匀, 静置 3 分钟, 在 440nm 处,1cm 光径, 蒸馏水调零, 测各管吸光度 相当于 LDH 单位 0 595 2010 3027 3870 4443 4886 5146 5276 本所吸光度参考值 0.215 0.270 0.396 0.500 0.573 0.626 0.667 0.691 0.703 本所绝对吸光度参考值 0 0.055 0.182 0.285 0.358 0.411 0.452 0.476 0.488 以所测得的吸光度为纵坐标, 以相应的单位为横坐标, 绘制标准曲线
一 操作表 附录 ( 二 ) 大鼠血浆 LDH 取样量摸索 标准管标准管空白管测定管测定管空白管 蒸馏水 (ml) 0.13 0.15 0.05 标准品 (ml) 0.02 不同浓度的样本 (ml) 0.10 0.10 基质缓冲液 (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 辅酶 I 溶液 (ml) 0.05 2,4 二硝基苯肼溶液 (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.4mol/L 氢氧化钠溶液 (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 混匀, 室温放置 3 分钟,440nm, 蒸馏水调零,1cm 光径, 测各管吸光度 二. 结果 管号 0 测定 1 测定 2 测定 3 测定 4 测定 5 测定 6 测定 7 血浆 (ml) 0 0.005 0.010 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 双蒸水 (ml) 0.1 0.095 0.090 0.080 0.060 0.040 0.020 0 测定 OD 值 0.232 0.321 0.390 0.510 0.690 0.796 0.900 0.968 测定空白 OD 0.232 0.260 0.275 0.316 0.391 0.470 0.556 0.611 值 绝对吸光度 0 0.061 0.115 0.194 0.299 0.326 0.344 0.357 二 大鼠血浆检测 LDH 时最佳取样量的摸索曲线 ( 水浴温度为 37 )
参考取样量 大鼠血浆为 10-30µL, 最佳取样量为 20µL 在其范围内酶曲线通过回归曲线的处理, 相对成正 比关系 若取样量过大或过少, 则在实验结束后, 再进行统计学处理时会出现无显著差异 附录 ( 三 ) 一 操作表 0.2% 小鼠脑匀浆 LDH 取样量摸索 标准管标准管空白管测定管测定管空白管 蒸馏水 (ml) 0.13 0.15 0.05 标准品 (ml) 0.02 不同浓度的样本 (ml) 0.10 0.10 基质缓冲液 (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 辅酶 I 溶液 (ml) 0.05 2,4 二硝基苯肼溶液 (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.4mol/L 氢氧化钠溶液 (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 混匀, 室温放置 3 分钟,440nm, 蒸馏水调零,1cm 光径, 测各管吸光度 二 结果 管号 0 测定 1 测定 2 测定 3 测定 4 测定 5 测定 6 测定 7 0.2% 的匀浆 (ml) 0 0.005 0.010 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 双蒸水 (ml) 0.1 0.095 0.090 0.080 0.060 0.040 0.020 0 测定 OD 值 0.232 0.323 0.386 0.472 0.574 0.648 0.688 0.724 测定空白 OD 值 0.232 0.250 0.261 0.264 0.267 0.270 0.272 0.280 绝对吸光度 0 0.073 0.125 0.208 0.307 0.378 0.416 0.444 三 0.2% 小鼠脑匀浆检测 LDH 时最佳取样量的摸索曲线
参考取样量 0.2% 小鼠脑匀浆为 20-50µL, 最佳取样量为 35-40µL 在其范围内酶曲线通过回归曲线的处理, 相对成正比关系 若取样量过大或过少, 则在实验结束后, 再进行统计学处理时会出现无显著差异