AxyPrep 总 RNA 小量制备试剂盒 本试剂盒用于从各种动物组织 植物组织 细胞 细菌 酵母和丝状真菌中提取总 RNA 提取的总 RNA 分子完整 纯度高, 适用于 Northern Blot RT-PCR 体外翻译 Primer Extension S1 核酸酶作图 RNase 保护测定 构建 cdna 文库等各种分子生物学实验 一 试剂盒组成 贮存 稳定性 Cat. No. AP-MN-MS-RNA-4 AP-MN-MS-RNA-50 AP-MN-MS-RNA-250 Kit size 4 preps 50 preps 250 preps Spin/vac mini column 4 50 250 2 ml Microfuge tube 4 50 250 1.5 ml Microfuge tube 8 100 500 Buffer R-Ⅰ 3 ml 25 ml 125 ml Buffer R-Ⅱ 1 ml 10 ml 50 ml Buffer W1A concentrate 2.4 ml 24 ml 120 ml Buffer W2 concentrate 2.4 ml 24 ml 2 72 ml Buffer TE 1 ml 6 ml 30 ml Protocol manual 1 1 1 Spin/vac mini column: 小量制备管 Buffer R-Ⅰ: 细胞裂解液 室温密闭贮存 Buffer R-Ⅱ: 中和液 室温密闭贮存 Buffer W1A concentrate: 洗涤液 使用前, 根据瓶上指定的体积加入乙醇, 混合均匀, 室温密闭贮存 可用无水乙醇或 95% 乙醇 Buffer W2 concentrate: 去盐液 使用前, 根据瓶上指定的体积加入乙醇, 混合均匀, 室温密闭贮存 可用无水乙醇或 95% 乙醇 Buffer TE : 洗脱液 10 mm Tris-HCl,0.1 mm EDTA,pH 7.5 室温密闭贮存 二 注意事项 Buffer R-Ⅰ 和 Buffer W1A 含刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套和眼镜, 避免沾染皮肤 眼睛和衣服, 谨防吸入口鼻 若沾染皮肤 眼睛时, 要立即用大量清水或生理盐水冲洗, 必要时寻求医疗咨询 三 实验准备 1. 第一次使用时, 在 Buffer W1A concentrate 和 Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定体积加入无水乙醇或 95% 乙醇 2. 所有试剂用 DEPC 处理过的溶剂配制 请选用 RNase-free 枪头和离心管, 以避免提取过程中 RNA 被 RNase 降解 Page 1
四 操作步骤 不同的样品提取总 RNA 的操作中略有区别, 具体步骤分述如下 : 从动物组织中提取总 RNA 1. 取 20-40 mg 组织, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : RNA 丰富的组织 ( 如肝脏 ) RNA 含量低的组织 ( 如肌肉 ) 当使用的组织量小于 20 mg 时当使用的组织量大于 40 mg 时 不超过 30 mg 不超过 100 mg R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 2. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有 21-25 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,12,000 g 离心 5 min 4. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 2
8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从植物组织中提取总 RNA 1. 取 30-150 mg 组织, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : 植物叶子植物纤维组织当植物叶组织量小于 30 mg 时当植物叶组织量大于 80 mg 时当植物纤维组织量大于 150 mg 时 通常用量 10-80 mg 通常用量 100-150 mg R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 2. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有 18-23 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,12,000 g 离心 5 min 4. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml( 试剂盒内提供 ) 离心管中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g Page 3
8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g 离心 1min 8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从细胞中提取总 RNA 步骤 1-4 根据细胞培养的方式不同可以选择 a 或 b 两种实验方法 a. 悬浮培养的动物细胞或从培养皿 培养瓶中获得的细胞悬浮液或新鲜分离的动物组织单细胞悬浮液 : 1a. 收集 2 10 6-1 10 7 的细胞,2,000 g 离心 5 min, 弃上清 2a. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有 21-25 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3a. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,12,000 g 离心 5 min 4a. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 Page 4
b. 96- 孔, 24- 孔,12- 孔, 或 6- 孔培养板上贴壁培养的细胞 : 1b. 从 96- 孔,24- 孔,12- 孔或 6- 孔培养板里收集细胞, 尽量弃去培养基, 每孔加入 300 μl Buffer R-Ⅰ, 用移液枪上下吹打 8-10 次 2b. 转移上述细胞悬浮液到 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 用装有 21-25 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次 3b. 加入 110 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,12,000 g 离心 5 min 4b. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 200 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 5
8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从细菌中提取总 RNA 1. 收集 0.5-2 10 9 的细菌,6,000 g 离心 10 min, 弃上清 用 50 μl PBS 充分悬浮菌体并转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请进行细菌计数, 对于大肠杆菌而言,1 10 9 /ml 细菌的 OD 600 1 如果细菌量小于 0.5 10 9,R-I,R-II 和异丙醇用量减半 如果细菌量大于 2 10 9,R-I,R-II 和异丙醇按比例增加 2. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有 21-25 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,12,000 g 离心 5 min 4. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 6
8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从酵母中提取总 RNA 本方案用于从 2 10 6-5 10 7 的酵母细胞中提取 RNA 请进行酵母细胞计数, 也可用如下方法估算 : 对于一般酵母培养物而言,3 10 7 /ml 酵母细胞的 OD 600 1 如果酵母量小于 5 10 6,R-I,R-II 和异丙醇用量减半 如果酵母量大于 2 10 7,R-I,R-II 和异丙醇按比例增加 酵母的破碎和裂解方法有两种 : 机械法 ( 如下 a) 和酶法 ( 如下 b) 机械法采用加液氮研磨的方法, 酶法用 Lyticase 破壁形成原生质体 步骤 1-4 根据酵母的破碎和裂解方式不同可以选择 a 或 b 两种实验方法 a. 机械法 1a. 收集 0.5-2 10 7 的酵母细胞,6,000 g 离心 10 min, 弃上清 用 50 μl PBS 充分悬浮酵母细胞并转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 2a. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有 21-25 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3a. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,12,000 g 离心 5 min 4a. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 b. 酶法配置 Buffer YE: 1 M 山梨糖醇 0.1 M EDTA, ph 7.5 使用前加入 0.1% (V/V) 的 β- 巯基乙醇 Page 7
1b. 收集 0.5-2 10 7 的酵母细胞到 1.5 ml 离心管中,6,000 g 离心 10 min, 弃上清 用 1 ml 含有 Lyticase 的 Buffer YE 充分悬浮酵母细胞 30 C 保温 20-30 min, 并不时轻柔颠倒以形成原生质体 3,000 g 离心 5 min, 弃上清 * Lyticase 用量按每 1 10 7 酵母细胞加 50 单位计算 2b. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有 21-25 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3b. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,12,000 g 离心 5 min 4b. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 8
8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从丝状真菌中提取总 RNA 1. 取 30-100 mg 菌丝体, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : 当使用的组织量小于 30 mg 时 当使用的组织量大于 100 mg 时 R-I,R-II 和异丙醇的使用量都减半 R-I,R-II 和异丙醇的使用量按比例增加 2. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有 21-25 号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 15-30 s,12,000 g 离心 5 min 4. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 9
8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g Page 10
五 操作流程图 加入样品和 400 μl Buffer R-I 裂解 加入 150 μl Buffer R-II 12,000 g 离心 5 min 中和 加入 250 μl 异丙醇 结合 加入 500 μl Buffer W1A 加入 700 μl Buffer W2 加入 700 μl Buffer W2 结合 洗涤 加入 70-100 μl Buffer TE ( 或 RNase-free 水 ) 洗脱 Page 11