使用三重串联四极杆 GC/MS 对香薰草本混合物中的合成大麻素进行鉴定和定量 应用简报 法医学 作者 Anthony Macherone 博士 Thomas J. Gluodenis, Jr. 博士安捷伦科技有限公司 Centerville 路 2850 号威明顿特拉华州 19808 美国 摘要 随着含有合成大麻素的香薰草本混合物快速而危险地流行, 现在的法医学实验室面临着如何对复杂基质中痕量水平的特定形式化合物进行可靠定性和定量的挑战 本文对 30 多种已知合成大麻素中 17 种代表性化合物进行了分析, 以证明三重串联四极杆 GC/MS 方法的适用性 方法的高选择性降低了基质干扰, 提高了信噪比, 显著提高了分析结果的可靠性 并且方法无需数据的采集后处理过程, 如质谱的解卷积等
前言 合成大麻素是拟大麻类化合物, 最初合成用于药物研究 这些化学品在青少年中越来越广泛的吸食使用, 以及便利店 毒品店和互联网等越来越普遍的获取渠道引起了包括美国在内的世界各国的密切关注 合成大麻素可分为如图 1 所示的三种结构形式 第一种 (1A) 具有类似四氢大麻酚的支架结构 第二种 (1B) 为合成萘甲酰基吲哚类似物 第三种 (1C) 含有苯基环己烷基团 对大多数合成大麻素, 最常见的固有结构为一个短脂肪链, 已知其能与大麻素 CB1 和 CB2 受体相互作用 合成大麻素通常以成分形式添加在植物基质中 ( 图 2), 标示为香薰草本产品出售 其只在隐蔽位置标识不能用于公众消费, 因而逃脱了美国食品药品监督管理局 (FDA) 的监管, 从而缺乏对其生产过程 原材料质量 效能和整体安全性的控制 这些混合物一致性差, 效能不稳定, 会导致无意中摄入过量造成的严重的短期并发症, 包括抽搐 焦虑 心跳加剧 血压升高 呕吐 产生幻觉 妄想症和定向障碍 长期健康影响还不清楚 OH A HU-210 H OH 分子式 C 25 H 38 O 3 精确质量 386.2821 H O m/z 386.28 (100%) 387.29 (27.6%) 388.29 (4.3%) 元素分析 C 77.68 H 9.91 O 12.42 图 2. 合成大麻素常常混迹于植物基质中 虽然很多国家, 包括美国, 已经颁布了针对某些特定形式化合物 的禁止令, 但合成大麻素家族庞大并且数目不断增加, 因而大大 限制了法令的效力 一旦通过立法禁止使用某一种形式的大麻, O B JWH-018 分子式 C 24 H 23 NO 另外一种新形式的大麻就会被合成并进入市场 考虑到吸食这些大麻对健康造成的严重风险和对公众的威胁, 美国缉毒局 (EDA) N 精确质量 341.1780 m/z 341.18 (100%) 342.18 (26.3%) 343.18 (3.5%) 行使其紧急权力, 在至少一年的时间内对 5 种特定的合成大麻素进行管控, 同时它和美国卫生和公众服务部 (DHHS) 共同决定是否有必要进行永久性管控 [1,2] DEA 目前管控的大麻种类有 : JWH-018 HO C CP-47, 497 (C7) 类似物 分子式 C 21 H 34 O 2 精确质量 318.2559 JWH-073 JWH-200 CP-47,497 (C7) HO m/z 318.26 (100%) 319.26 (23.2%) 320.26 (2.9%) CP-47,497 (C8) HU-210 根据 DEA 以前的规定进行管控 但有超过 20 种形式未 元素分析 C 79.19 H 10.76 O 10.05 被列入管控范围, 并且这个数目还在增长 图 1. 合成大麻素可分为三种截然不同的结构形式 2
使用单四极杆气相色谱质谱 (GC/MS) 对合成大麻素类似物和同系物进行鉴定和定量会遇到很多分析难题 首先, 植物基质往往很难进行研磨 随后的萃取步骤也因为合成大麻素含有大量不同的官能团而需要使用一种通用的萃取方法 但通用的萃取方法会提取出大量的植物基质成分, 这些基质成分在色谱图中会形成很多的干扰峰, 影响目标物的分析 香薰草本混合物通常混有合成大麻素, 这些大麻素间结构相似, 包含同分异构体形式, 会在色谱中发生共流出, 从而会形成叠加的质谱图 更麻烦的是, 合成大麻素药效非常强, 所以相对植物基质往往仅以痕量浓度存在 虽然有以往的文献表明单四极杆 GC/MS 是一种有效且易于重复的分析方法 [3, 4], 但其在分析本实验中的基质时会产生非常复杂的数据, 如果不借助如质谱解卷积这种特殊的数据采集后处理软件, 很难做出合理的解释 本应用对具有代表性的香薰草本混合物样品进行分析, 验证替代方法 GC/MS/MS 检测合成大麻素的适用性, 该方法具备更强的选择性和灵敏度, 并且无需进行质谱解卷积处理 实验对照标准品和样品 如表 3 所列, 从 30 多种已知的合成大麻素中选择 17 种用于 GC/ MS/MS 方法的开发 这 17 种化合物涵盖了当前流行的草药混合物中包括的各种合成大麻素结构 分析选择的草药混合物样品为 EX 565 K2 Blondie K4 Purple Haze K3 XXX Lunar Diamond Zombie 和 K2 Diamond 样品制备研磨作为合成大麻素载体的植物材料, 如达迷草 ( 特纳草 ), 往往非常柔软轻盈, 这些特性使其难以粉碎均匀以进行代表性取样 本实验中, 将大约 500mg 样品夹在两张 5 英寸 5 英寸的 100 号砂纸间进行研磨, 直到磨成极细的粉末 萃取合成大麻素中多种不同的官能团需要采用通用的萃取方法 本实验采用酸 / 碱联合萃取再离心分离的方法 也可以采用甲醇浸提的萃取方法 任何一种萃取方法都会提取出大量的基质化合物 使用酸 / 碱联合萃取法, 首先向 50-100mg 研磨好的粉末样品中加入 1mL 去离子水, 然后加入 3 滴 10% 的盐酸进行酸化 接着加入 1mL 溶剂 (95% 的二氯甲烷 /5% 异丙醇,v/v), 充分混匀 然后将样品离心, 移出下层的溶剂层, 备用 再向剩下的水层 ( 上层 ) 中加入 2 滴浓氨水和 1mL 溶剂 (95% 的二氯甲烷 /5% 异丙醇, v/v), 再次混匀并离心 移取底层溶剂层, 和第一次移出的溶剂层合并, 稍作混匀, 准备进样, 进行 GC/MS/MS 分析 衍生化一些合成大麻素, 如 HU-210, 含有多个活性高的极性官能团, 如酚基和醇基, 这些官能团使其不适合进行 GC/MS 分析 为改善色谱分离, 提高方法灵敏度, 可以使用含 1%TMCS( 三甲基氯硅烷 ) 的 BSTFA(N,O - 双 ( 三甲基硅基 ) 三氟乙酰胺 ) 对其进行衍生化, 将官能管覆盖, 生成更有利于定性和定量的离子 本实验中所测定的化合物无需进行衍生化 GC/MS/MS 分析使用安捷伦 7000 系列三重串联四极杆 GC/MS, 即 7890A 气相色谱配置 7000B 质谱仪的联用系统进行 GC/MS/MS 分析 安捷伦 7890A 气相色谱仪配置 HP-5MS UI 色谱柱, 表 1 列出了气相色谱仪的运行条件 安捷伦 7000B 质谱采用电子轰击电离源 (EI) MS/MS 模式对所有分析物和对照标准品进行多反应监测 (MRM) 分析 表 2 为质谱的运行条件 3
表 1. 气相色谱运行条件 安捷伦 7890A 仪器条件 色谱柱 1 HP-5MS UI( 安捷伦 Santa Clara, CA) 进样模式 脉冲不分流 进样口温度 300 C 进样体积 1 ml 载气 氦气, 恒流,1.2 ml/min 柱箱升温 80 C( 保持 0.17 min),30ºc/min 升温至 300 C( 保持 0.5 min),5 C/min 升温至 340 C ( 保持 5 min) 传输线温度 325 C 表 2. 质谱运行条件 安捷伦 7000B 质谱仪运行条件 调谐 自动调谐 增益系数 50 采集模式 电子轰击离子化, 多反应监测模式 碰撞气体 氮气,1.5 ml/min 氦气冷却气体 :2.25 ml/min 溶剂延迟 7.0 min MS 温度 离子源 300 C, 四极杆 150 C 根据以往经验, 为确定用于分析的 MRM 离子对, 首先采集对照标准品的全扫描质谱图, 然后进行产物离子扫描, 以识别最优的母离子 / 产物离子对 接着, 对碰撞池能量进行优化, 以使每个特定的离子对都能获得最大的离子强度 表 3 为各分析物的母离子 产物离子以及优化的碰撞能量 表 3. 各分析物的母离子 产物离子和优化的碰撞能量 化合物 母离子 产物离子 碰撞能量 保留时间 (min) AM-694 435 232 27 10.918 AM-694 435 220 13 CP-47-497-C8 377 191 29 7.967 CP-47-497-C8 377 167 33 HU-211 530 446 13 9.306 HU-211 446 299 21 JWH-015 327 310 10 10.684 JWH-015 310 268 23 JWH-018 341 167 23 11.375 JWH-018 324 254 23 JWH-073 327 167 23 10.875 JWH-073 310 254 23 JWH-081 371 197 23 13.238 JWH-081 354 269 31 JWH-122 338 268 23 12.226 JWH-122 298 181 12 JWH-133 312 269 12 7.348 JWH-133 269 93 23 JWH-200 384 100 23 14.373 JWH-200 100 56 17 JWH-203 339 214 3 9.954 JWH-203 214 144 17 JWH-250 335 214 3 10.007 JWH-250 214 144 17 JWH-251 214 144 17 9.553 JWH-251 144 116 12 JWH-398 375 201 23 12.539 JWH-398 318 189 23 RCS-4 321 264 19 10.259 RCS-4 264 135 17 RCS-8 254 158 13 12.463 RCS-8 254 144 19 WIN55 212-3/2 100 70 13 14.373 WIN55 212-3/2 100 56 15 4
结果和讨论 在 GC/MS/MS MRM 实验中, 目标分析物被选择性地从基质中分离 正如图 3 所示, 第一级四极杆质量过滤器分离出能够进入碰撞池的唯一的母离子 在碰撞池中, 母离子被碰撞气体和碰撞电压打碎 该过程称为碰撞诱导解离 (CID) CID 将母离子裂解成特定的可预知的产物离子 第二级四极杆质量过滤器可根据用户需要, 设定为仅允许特定产物离子通过 将响应最强的离子作为定量离子, 用于定量 将与定量离子的丰度比符合实际要求的离子作为定性离子, 用于化合物确认 即使如果某个干扰离子偶然经第一级四极杆进入到碰撞池, 干扰离子生成与分析物母离子相同的产物离子的可能性也是极低的 这样, 化学噪声可彻底和信号分离, 提高了信噪比和灵敏度 与使用单级四极杆质谱进行选择离子监测 (SIM) 相比, 使用 GC/ MS/MS 系统进行 MRM 采集可以检测复杂基质如香薰草本混合物中痕量水平的合成大麻素, 并显著提高选择性和灵敏度 7000A GC/MS (N 2 ) 2 3 1 图 3. 多反应监测 (MRM) 技术 5
图 4 为 100 ng/ml 混标溶液的 MRM 总离子流图 (TIC) 所有 17 种选择用于分析的合成大麻素均被成功鉴定 鉴于 GC/MS/MS 技术的高选择性, 化学噪声完全可以忽略不计, 从而得到一张非常 干净 的总离子流图 10 5 1.40 JWH-203 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0 JWH-133 CP-47-497 (C8) HU-211 JWH-251 JWH-250 RCS-4 JWH-015 JWH-073 AM-694 JWH-081 JWH-122 RCS-8 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 vs (min) JWH-398 JWH-081 JWH-200 WIN55 212-3/2 图 4. 100 ng/ml 混标溶液的 MRM 总离子流图 (TIC), 很容易即可确定所有 17 种合成大麻素 通过向空白基质萃取液中加入已知的对照标准品标, 建立 100~ 400 ppb 范围内的校正曲线 分别对 100ppb 200ppb 和 400ppb 的标样进行 3 次重复进样 所有被分析物的校准曲线得到的相关系数 r 2 均值为 0.99, 标准偏差为 0.012 100ppb 200ppb 和 400ppb 的 RSD 分别为 13% 7% 和 6% 通过对最复杂基质中的 1 ~100 ppb 标样进行分析确定信噪比 10 的定量限 6
图 5 为两种活性非常高的合成大麻素 JWH-018 和 JWH-073 的校准曲线, 浓度范围为 100 ng/ml~400 ng/ml 图 6 为 100 ng/ml JWH-018 的代表性色谱图 10 4 8 7.5 7 6.5 6 5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 JWH-073 3 3 3 3 3 QC y = 233.694499*x 14789.988862 R 2 = 0.99580525 =QC R 2 = 0.996 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 (ng/ml) 10 4 6.5 6 5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 JWH-018 3 3 3 3 3 QC y = 191.009030*x 11294.932076 R 2 = 0.99580875 =QC R 2 = 0.996 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 (ng/ml) 图 5. JWH-018 和 JWH-073 的校准曲线表明了该方法优异的线性 7
Counts 10 3 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0-0.5 11.358 min JWH-018-0.1 11.28 11.30 11.32 11.34 11.36 11.38 11.40 1142 11.44 (min) (%) 10 2 = 39.9 (103.0 %) 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 11.28 11.30 11.32 11.34 11.36 11.38 11.40 1142 11.44 (min) 图 6. 100 ng/ml JWH-018 的结果 阴影部分的峰表示定量离子转换 (324 到 254 m/z), 轮廓线的峰表示定性离子转换 (341 到 167 m/z) 在本方法建立的标准范围 ( 水平虚线 ) 之内 经实验发现, 草药中大麻素组成表现出很大的可变性 所有种类的草药中均检出了 JWH-073 和 JWH-018, 浓度从 50 到 150 ppb 不等 值得注意的是,K2 Blondie 中所含的 JWH-073 和 JWH-018, 如按峰面积计浓度推测可高达 1000 倍 通过使用定性离子和定量离子正确的丰度比和预期保留时间进行确认, 在所有混合物中至少可以鉴定出 2 种合成大麻素 结论 对于分析草药混合物中的合成大麻素, 三重串联四极杆质谱表现出许多优势 但其可消除基质干扰提高信噪比的优势极大地提高了分析结果的可靠性 与单级四极杆相比, 三重串联四极杆质谱降低了假阴性和假阳性出现的概率, 降低了检出限, 无需进行额外的数据采集后处理, 如质谱的解卷积和数据复审, 因此节约了大量的宝贵时间 参考文献 1. Chemicals Used in Spice and K2 Type Products Now Under Federal Control and Regulation. News Release. Public Affairs, U.S. Drug Enforcement Administration. March 1, 2010. http://www.justice.gov/dea/pubs/ pressrel/pr030111.html 2. Notice of Intent to Temporarily Control Five Synthetic Cannabinoids. Office of Diversion Control, U.S. Department of Justice, Drug Enforcement Administration, Federal Register Notices, Rules 2011. http://www.deadiversion. usdoj.gov/fed_regs/rules/2011/fr0301.htm 3. T.J. Gluodenis Jr., Identification of Synthetic Cannabinoids in Herbal Incense Blends. Forensic Magazine. 31-35. June/July 2011. 4. Agilent Technologies, Inc. Identification of Synthetic Cannabinoids in Herbal Incense Blends by GC/MS, Application Compendium. P/N 5990-7967EN. April 2011. 8
致谢 感谢 National Medical Services Laboratory (NMS Labs) 为本实验提供香薰草本混合制品, 同样感谢来自 NMS 的 Fran Diamond 在样品制备和萃取方法上提供的无私帮助 更多信息 有关我们产品和服务的更多信息, 请访问 www.agilent.com/chem/cn 9
www.agilent.com/chem/cn 安捷伦科技公司对本资料中所包含的错误, 以及由于使用本资料所引起的相关损失不承担责任 本资料中的信息 说明和性能指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,2011 2011 年 9 月 14 日, 中国印刷 5990-8987CHCN