646 文章编号 :1673 8640(2014)06 0646 05 中图分类号 :R446.5 文献标志码 :A DOI:10.3969/j.isn.1673 8640.2014.06.016 临床分离的美罗培南和环丙沙星共同耐药的铜绿假单胞菌耐药机制的研究 张国栋 1, 王莹 2 1, 朱红胜 [1. 南京医科大学附属苏州医院, 苏州市立医院 ( 东区 ) 检验科, 江苏苏州 215001; 2. 南京市浦口区疾病预防控制中心, 江苏南京 210031] 摘要 : 目的探讨临床分离的对美罗培南和环丙沙星均耐药的铜绿假单胞菌的耐药机制 方法收集经 VITEK 2Compact 微生物分析系统检测为美罗培南和环丙沙星耐药的铜绿假单胞菌 30 株, 琼脂稀释法复查最小抑菌浓度 (MIC) 值 改良三维试验检测碳青霉烯酶, 聚合酶链反应 (PCR) 扩增耐药基因, 逆转录 PCR 分析细菌外排系统表达情况 结果琼脂稀释法与 VITEK 2Compact 微生物分析系统检测结果相同 所有菌株均未产碳青霉烯酶,PCR 扩增测序未发现基因改变, 逆转录 PCR 检测外排系统发现以 mexx 和 mexc 基因表达增加为主, 其调控基因扩增测序发现 4 株 mexc 过度表达的调控基因 nfxbgly Val(GGC GTC),6 株 mexx 过度表达的调控基因 mexzval Gly(CTG CAG) 结论外排系统调控基因突变而引起的外排系统 MexXY OprM 和 MexCD OprJ 过度表达是引起美罗培南和环丙沙星耐药的主要原因 关键词 : 铜绿假单胞菌 ; 耐药机制 ; 美罗培南 ; 环丙沙星 ; 外排系统 Research on thedrugresistancemechanismsofmeropenem and ciprofloxacin in clinicalisolatesof Pseudomonasaeruginosa ZHANG Guodong 1,WANG Ying 2,ZHU Hongsheng 1. [1.DepartmentofClinical Laboratory,theAfiliatedSuzhouMunicipalHospital(East Section) ofnanjingmedicaluniversity,jiangsusuzhou 215001,China;2.PukouDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,JiangsuNanjing210031,China] Abstract:Objective Toinvestigatethedrugresistancemechanismsofbothmeropenem andciprofloxacinin clinicalisolatesofpseudomonasaeruginosa.methods Atotalof30isolatesofPseudomonasaeruginosawhichhadbeen testedresistancetobothmeropenemandciprofloxacinbyvitek 2Compactwerecolected.Agardilutionmethodwas usedtoreexaminetheminimalinhibitoryconcentrations(mic)ofmeropenemandciprofloxacin.carbapenemaseswere detectedbymodifiedthree dimensionaltest.theresistancegeneswereanalyzedbypolymerasechainreaction(pcr) amplification.theexpresionofefluxsystemswasanalyzedbyreversetranscriptionpcr.results Thesameresults wereshowedbetweenagardilutionmethodandvitek 2Compact.Carbapenemaseswerenotdetectedbymodifiedthree dimensionaltest.theoverexpresionofmexx andmexc genesweredetectedbyreversetranscriptionpcr.the sequencingofregulatorygenesshowedthattherewere4isolateswhichthegly(ggc)ofnfxbwassubstituteforval (GTC)and6isolateswhichtheVal(CTG)ofmexZwassubstituteforGly(CAG).Conclusions Theoverexpresion ofthemexxy OprM andmexcd OprJefluxsystem,duetothemutationofregulatorygenesofefluxsystem,is contributedtothedrugresistancetobothmeropenemandciprofloxacinofpseudomonasaeruginosa. Keywords:Pseudomonasaeruginosa;Drugresistancemechanism;Meropenem;Ciprofloxacin;Efluxsystem 铜绿假单胞菌是医院获得性感染最常见的致病菌之一, 其耐药率也逐年上升 碳青霉烯类的美罗培南以及喹诺酮类药物环丙沙星均是治疗其感染的主要药物之一 据国外研究报道, 引起铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制是碳青霉烯酶的产生 外膜蛋白缺失和外排系统的过度表达等 [1] 对喹诺酮类药物的耐药机制也包括耐药基因的突变和外排系统的表达 [2] 本 研究是对临床上出现的对亚胺培南敏感而对美罗培南和环丙沙星同时耐药的铜绿假单胞菌耐药机制的分析 材料和方法一 材料 1. 菌株来源收集 2012 年 3 至 12 月苏州市立医院各临床科室分离的 30 株铜绿假单胞菌 作者简介 : 张国栋, 男,1981 年生, 学士, 主管技师, 主要从事临床微生物检验工作 通讯作者 : 朱红胜, 联系电话 :0512 62364338
检验医学 2014 年 6 月第 29 卷第 6 期 LaboratoryMedicine,June2014,Vol29.No6. 647 ( 编号 :1~30, 无重复标本 ), 经 VITEK 2Compact 微生物分析系统 ( 法国生物梅里埃公司 ) 鉴定, GN 13 药物敏感性卡检测表型为亚胺培南敏感, 美罗培南和环丙沙星耐药 质控菌株为铜绿假单胞菌 (ATCC 27853) 肺炎克雷伯菌 (ATCC 700603)[ 产超广谱 β 内酰胺酶 (extended spectrumbeta lactamase,esbls) 株 ] 2. 试剂和仪器亚胺培南 ( 默沙东公司, 美国 ) 美罗培南 ( 住友制药株式会社, 日本 ) 头孢他啶 ( 葛兰素史克公司 ) 头孢吡肟 ( 中美上海施贵宝制药有限公司 ) 环丙沙星 ( 朗致集团万荣药业有限公司 ) 阿米卡星 ( 丽珠医药集团股份有限公司 ) 克拉维酸 ( 江西制药厂原料药 ); 水解酪蛋白胨琼脂 药物敏感性纸片和 LB 培养基 (Oxoid 公司 );TaqDNA 聚合酶 dntps 为 TaKaRa 公司产品 ;Mastercyler gradient 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 扩增仪 (Eppendorf 公司 );RNAisoPlus(D9108A) 总 RNA 提取试剂盒 (TaKaRa 公司 );iscript TM cdna Synthesis Kit 和 itaq TM Universal SYBRGreen Supermix(Bio Rad, 美国 ),801 凝胶电泳图像分析系统 ( 捷达公司 ),Bio rad 电泳系统 ( 美国 ),ABI 7500real timepcrsystem(abi, 美国 ) 二 方法 1. 药物敏感性试验按美国临床实验室标准化协会 (Clinicaland Laboratory Standards Institute,CLSI)(2012 版 ) 标准用琼脂稀释法检测和判读菌株对亚胺培南 美罗培南 环丙沙星 头孢他啶 头孢吡肟和阿米卡星的最低抑菌浓度 (minimalinhibitoryconcentration,mic) 值 2. 改良三维试验反复冻融法制备酶粗提取液, 以亚胺培南 美罗培南为底物检测碳青霉烯酶, 将新鲜培养的大肠埃希菌 (ATCC25922) 用生理盐水调至 0.5 麦氏单位, 均匀涂布水解酪蛋白胨琼脂平板, 平板中央贴测试药物敏感性纸片 距药物敏感性纸片边缘 5mm 处用无菌刀片由内向外放射状切割 4 个 10mm 2mm 长的槽 用微量加样器分别吸取 ddh 2 O40mL( 空白对照 ) ddh 2 O36μL 和 4μL200μg/mL 克拉维酸 ( 对照 ) 酶粗提液 36μL 和 ddh 2 O4μL( 酶活性检测 ) 酶粗提液 36μL 和克拉维酸 4μL( 酶活性抑制检测 ) 加入各自的检测槽 判定标准 :35 培养 18h, 铜绿假单胞菌 (ATCC27853) 和肺炎克雷伯菌 (ATCC700603) 为阴性对照, 铜绿假单胞菌 产 IMP 1 型金属酶为阳性对照 若酶活性检测槽与抑菌圈交界处出现向内凸起的细菌生长区即为三维试验阳性 ; 与酶活性检测槽的细菌生长区相比, 若酶活性抑制检测槽与抑菌圈交界处细菌生长区缩小即为酶抑制试验阳性 [3] 3. 泵抑制剂 CCCP 对抗菌药物 MIC 的影响采用琼脂稀释法测定耐药铜绿假单胞菌加入 CCCP 前后对美罗培南和环丙沙星的 MIC 试验组在琼脂平皿中加入 CCCP 的终浓度为 5mg/L [4], 同时加入相同量的 CCCP 溶解液 ( 蒸馏水 ) 为对照组 比较加入 CCCP 试验组和蒸馏水对照组前后菌株对 2 种抗菌药物 MIC 值的变化,MIC 降低为原值的 1/4 或更低则判断为外排泵阳性菌株 [5] 4. 喹诺酮类耐药基因及外排系统调控基因扩增与测序对喹诺酮类药物耐药基因 gyra parc 和外排系统过度表达菌株外排泵基因的调控基因 nfxb(mexc) mexz(mexx) 进行扩增测序, 以煮沸法提取细菌 DNA, 使用的引物见表 1, 由上海 Invitrogen 公司合成, 反应体系 50μL, 按试剂盒说明加引物和检测试剂,94 预变性 5min 后, 按 94 30s 退火温度为 53 parc 退火温度为 54,72 1 min, 共 30 个循环,72 延伸 10min, 产物长度 gyra227bp parc363bp, 送上海 Invitrogen 公司测序, 测序结果与 GenBank 数据库上 gyra parc 基因对比 5. 外排系统基因表达量检测随机选取 10 株细菌, 采用逆转录实时定量 PCR 检测 mexa mexc mexe 和 mexx4 种外排基因的表达量 方法如下 : 用日本 TaKaRa 公司的 RNAisoPlus 试剂盒, 按说明书操作提取细菌的总 RNA, 再使用 Bio RAD 公司的 iscript TM cdnasynthesiskit 试剂盒, 按说明书进行总 RNA 逆转录成 cdna, 采用 itaq TM UniversalSYBRGreenSupermix 试剂盒在 ABI7500real timepcrsystem 定量分析外排系统 4 种基因 mrna 的表达量 所用引物 ( 由上海英骏公司合成 ) 见表 1, 铜绿假单胞菌 (ATCC 27853) 为正常对照组,rspl 基因为内参基因 反应体系 20μL, 按试剂说明书进行加样和设置 PCR 反应条件 三 统计学方法使用 SPSS16.0 软件进行统计, 用配对 χ 2 检验分析美罗培南和环丙沙星使用 CCCP 前后铜绿假单胞菌对美罗培南和环丙沙星的耐药率间的差异, 以 P<0.05 为差异有统计学意义
648 表 1 本试验采用的引物 引物 引物序列 (5 3 ) 目的基因 目的 参考文献 mexa F CCTGCTGGTCGCGATTTCGG mexa 实时 PCR [6] mexa R CCAGCAGCTTGTAGCGCTGG [6] mexc F TTGGCTATGGCCATCGCGTT mexc 实时 PCR [6] mexc R ATCGAAGTCCTGCTGGCTGA [6] mexe F ATCCCACTTCTCCTGGCGCT mexe 实时 PCR [6] mexe R GGTCGCCTTTCTTCACCAGT [6] mexx F GCGATGCGGATTGCGGAACA mexx 实时 PCR [6] mexx R TGGTCGCCCTATTCCTGCTG [6] rpsl F GCAACTATCAACCAGCTG rspl 实时 PCR [7] rpsl R GCTGTGCTCTTGCAGGTTGTG [7] MexZ F CCCTTGTGAGGACGTTCA mexz 测序 [8] MexZ R CCCAGAGCGATTGCAGATA 测序 [8] nfxb F CGATCCTTCCTATTGCACG nfxb 测序 [8] nfxb R GCCAAGTGCCAGTATCG 测序 [8] gyra F GGCCTGAAGGTGCAC gyra 测序 [9] gyra R CACGGCGATACCGCTGGA 测序 [9] parc F CGAGCAGGCCTATCTGAACTAT parc 测序 [2] ParC R GAAGGACTTGGGATCGTCCGGA 测序 [2] 结 果 罗培南和环丙沙星耐药 加入 CCCP 抑制剂的美罗培南试验组外排泵阳性菌株为 17 株, 对照组均 一 MIC 检测 30 株铜绿假单胞菌经琼脂稀释法复查, 与 VITEK 2Compact 微生物分析系统鉴定和 GN 13 药物敏感性卡检测结果相同, 对亚胺培南敏感, 美 为阴性, 两组差异有统计学意义 (χ 2 =13.367,P< 0.05); 加入 CCCP 抑制剂的环丙沙星试验组外排泵阳性菌株为 22 株, 对照组均为阴性, 两组差异有统计学意义 (χ 2 =16.588,P<0.05) 见表 2 表 2 铜绿假单胞菌体外药物敏感性试验 (MIC 值 ) 结果 美罗培南 环丙沙星 细菌编号 亚胺培南 头孢吡肟 头孢他啶 阿米卡星 加 CCCP 前 加 CCCP 后 加 CCCP 前 加 CCCP 后 1 2 16 4 16 8 16 32 2 2 1 16 8 64 16 8 4 1 3 1 16 2 8 2 8 4 2 4 2 8 4 16 16 4 16 4 5 0.5 16 2 16 4 8 8 1 6 2 8 2 16 16 4 32 2 7 1 8 4 8 2 8 8 2 8 0.5 16 4 16 8 16 8 1 9 2 16 8 8 0.5 0.5 8 2 10 2 8 2 32 2 4 16 2 11 4 8 4 64 4 >512 4 1 12 2 8 4 32 4 4 16 8 13 1 16 8 16 2 4 32 8 14 2 16 4 32 2 16 32 16 15 0.5 16 4 16 4 >512 2 1 16 2 16 8 16 4 8 32 8 17 1 16 8 64 8 4 32 4 18 0.5 16 1 8 2 16 8 2 19 2 16 4 32 4 8 32 16
检验医学 2014 年 6 月第 29 卷第 6 期 LaboratoryMedicine,June2014,Vol29.No6. 649 续表 2 细菌编号 亚胺培南 美罗培南加 CCCP 前加 CCCP 后 头孢吡肟头孢他啶阿米卡星 环丙沙星加 CCCP 前加 CCCP 后 20 1 8 1 16 2 4 4 1 21 2 16 8 16 2 4 16 4 22 2 16 2 128 16 16 16 8 23 1 16 4 16 16 4 16 2 24 0.5 16 8 16 4 4 16 4 25 2 8 1 16 4 16 8 2 26 2 16 2 16 2 4 16 4 27 1 16 4 16 2 4 16 8 28 0.5 16 8 16 4 4 16 8 29 2 16 8 16 2 4 16 4 30 1 16 2 8 2 64 16 2 二 碳青霉烯酶的检测以亚胺培南 美罗培南为底物的改良三维试验结果显示,30 株铜绿假单胞菌均不产生分解底物的碳青霉烯酶 三 耐药基因扩增及测序结果 30 株铜绿假单胞菌均扩增出 gyra parc 基因, 琼脂糖电泳结果见图 1, 并对测序结果分别与 gyra(geneid:882800) 和 parc(geneid:879741) 基因比对, 未发现有基因改变 扩增和测序, 发现 4 株 mexc 过度表达的调控基因 nfxb 在碱基位点 328 处发生点突变 (G T), 相应氨基酸 (Gly 改变为 Val 6 株 mexx 过度表达的调控基因 mexz 测序发现在基因碱基位点 489 处发生点突变 (T A), 相应氨基酸 (Val) 变为 Gly 表 3 外排系统表达情况 标本号 mexa mexc mexe mexx 铜绿假单胞菌 (ATCC27853) 1 1 1 1 1 1.3750 1.8790 0.2950 9.3911 4 0.5670 0.6410 0.4320 7.6358 7 0.7280 6.3140 0.6580 6.2425 10 3.6300 0.2910 0.8170 1.7790 14 1.9910 2.4080 0.8350 2.6727 19 0.2320 0.6030 0.364010.7970 22 0.2900 5.4010 0.8188 9.9471 23 0.8417 6.9765 0.7653 1.0678 27 0.9633 0.8606 0.6993 7.2760 29 5.2588 5.8177 0.7010 0.8340 讨 论 注 :(a) 为 parc 电泳图 ;(b) 为 gyra 电泳图 ;1 为阳性对照, 2~4 为铜绿假单胞菌试验菌株图 1 parc gyra 琼脂糖电泳图谱四 外排系统基因表达随机选取 10 株铜绿假单胞菌进行外排系统基因表达量检测, 结果显示以 mexx 和 mexc 基因表达量增加为主, 其他外排系统表达个别增加 见表 3 五 外排系统调控基因扩增测序结果对进行逆转录实时定量 PCR 的 10 株铜绿假单胞菌中表达量超过 5 倍的菌株进行调控基因的 本试验选用耐药型特殊的铜绿假单胞菌作为研究对象, 对亚胺培南敏感, 对美罗培南和环丙沙星轻中度耐药 据国内外报道, 铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制是碳青霉烯酶的产生以及外膜蛋白 OprD 缺失和减少, 而对美罗培南耐药主要是碳青霉烯酶的产生以及外排系统的过度表达 [1,10] 本试验通过改良三维试验证实, 所有铜绿假单胞菌均未产碳青霉烯酶, 细菌体外药物敏感性试验也证实对亚胺培南敏感, 因此可以排除由于碳青霉烯酶而引起的美罗培南耐药 目前据国内外报道, 铜绿假单胞菌对喹诺酮
650 类药物的耐药机制主要是 DNA 螺旋酶 (gyra 基因 ) 和拓扑异构酶 IV(parC 基因 ) 发生靶位突 [11] 变以及外排泵 MexAB OprM MexCD OprJ [12] Mex EF OprN 和 MexXY OprM 过度表达而引起 本试验对所有铜绿假单胞菌的 gyra 和 parc 基因进行扩增和测序发现, 均可以扩增出目的基因, 但测序结果对比未发现存在碱基改变, 基本可以排除由于 DNA 螺旋酶 (gyra) 和拓扑异构酶 IV (parc) 发生靶位突变而引起的环丙沙星耐药 外排泵 MexAB OprM MexCD OprJ Mex EF OprN 和 MexXY OprM 过度表达可以引起环丙沙星的耐药 [12], 但 MexAB OprM 和 MexXY OprM 过度表达也可以引起美罗培南的敏感性下降 [13 14] 本试验通过对其中部分菌株的外排泵基因进行逆转录实时定量 PCR 表达量检测, 发现在 4 种外排系统中, 以 MexXY OprM 和 MexCD OprJ 表达增加为主 同时外排泵抑制试验也证实了这一结论 另外对这 2 个表达系统的调控基因扩增测序发现, 调控基因存在点突变, 引起表达的氨基酸发生改变, 这可能是引起外排系统过度表达的主要原因 这同时也说明引起美罗培南敏感性下降的原因可能是 MexXY OprM 外排系统的过度表达 [2] 而在 Pasca 等的研究中也表明,MexXY OprM 和 MexCD OprJ 过度表达也是引起环丙沙星敏感性下降的主要原因, 本试验与其研究结果基本一致 本研究结果表明, 本试验选择的该耐药型铜绿假单胞菌, 外排系统调控基因发生突变而引起的外排系统过度表达是引起美罗培南和环丙沙星耐药的主要原因 参考文献 [1] Rodríguez MartínezJM,PoirelL,NordmannP. Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonasaeruginosa [J].AntimicrobAgentsChemother,2009,53(11): 4783 4788. [2] PascaMR,DalaValeC,DeJesusLopesRibeiro AL,etal.Evaluationoffluoroquinoloneresistance mechanismsin Pseudomonasaeruginosa multidrug resistanceclinicalisolates[j].microbdrugresist, 2012,18(1):23 32. [3] 邵海枫, 刘金波, 张小卫, 等. 用于三维试验的最适酶抑制剂浓度探讨 [J]. 临床检验杂志,2003,21 (6):352 353. [4] CobanAY,EkinciB,DurupinarB.A multidrug eflux pump inhibitor reduces fluoroquinolone resistanceinpseudomonasaeruginosaisolates[j]. Chemotherapy,2004,50(1):22 26. [5] ValdezateS, VindelA, EcheitaA, etal. Topoisomerase Ⅱ and Ⅳ quinolone resistance determiningregionsinstenotrophomonasmaltophilia clinicalisolateswith diferentlevelsofquinolone susceptibility[j]. Antimicrob AgentsChemother, 2002,46(4):665 671. [6] LinaresJF, LópezJA, CamafeitaE,etal. Overexpresion of the multidrug eflux pumps MexCD OprJandMexEF OprN isasociatedwitha reduction of type Ⅲ secretion in Pseudomonas aeruginosa[j].jbacteriol,2005,187(4):1384 1391. [7] HammamiS,GhozziR,BurghoferB,etal. Mechanismsofcarbapenemresistanceinnon metalo beta lactamase producing clinical isolates of Pseudomonasaeruginosa from a Tunisian hospital [J].PatholBiol(Paris),2009,57(7 8):530 535. [8] CampoEsquisabelAB,RodríguezMC,Campo Sosa AO,etal.Mechanismsofresistance in clinical isolatesofpseudomonasaeruginosalessusceptibleto cefepimethan toceftazidime[j]. Clin Microbiol Infect,2011,17(12):1817 1822. [9] HigginsPG,FluitAC,MilatovicD,etal.Mutations ingyra,parc,mexrandnfxbinclinicalisolates ofpseudomonasaeruginosa[j].intjantimicrob Agents,2003,21(5):409 413. [10] 曾章锐, 邵海枫, 王卫萍, 等. 头孢菌素敏感或中介的铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制的研究 [J]. 临床检验杂志,2013,31(1):24 27. [11] LevineC,HiasaH,MariansKJ.DNA gyraseand topoisomerase Ⅳ: biochemical activities, physiologicalrolesduringchromosomereplication, anddrugsensitivities[j].biochim BiophysActa, 1998,1400(1 3):29 43. [12] HocquetD,NordmannP,ElGarchF,etal. InvolvementoftheMexXY OprM efluxsystem in emergenceofcefepimeresistanceinclinicalstrainsof Pseudomonasaeruginosa[J]. Antimicrob Agents Chemother,2006,50(4):1347 1351. [13] MasudaN,SakagawaE,OhyaS,etal.Substrate specificitiesofmexab OprM, MexCD OprJ, and MexXY oprm eflux pumps in Pseudomonas aeruginosa[j]. Antimicrob Agents Chemother, 2000,44(12):3322 3327. [14] KriengkauykiatJ,PorterE,LomovskayaO,etal. Useofanefluxpumpinhibitortodeterminethe prevalenceofefluxpump mediatedfluoroquinolone resistanceandmultidrugresistanceinpseudomonas aeruginosa[j]. Antimicrob Agents Chemother, 2005,49(2):565 570. ( 收稿日期 :2013 07 20) ( 本文编辑 : 姜敏 )