全新一代三重四极杆液质联用 TSQ Quantis 在激素类药物残留检测中的应用 吕辰张婷岚彭蜀莹唐恺赛默飞世尔科技 AN_C_LCMSMS_1_2179Z 摘要 : 本文在 Thermo Scientific 全新液相色谱串联质谱三重四极杆平台 Thermo Scientific TSQ Quantis 上针对国标 SN/T 2222-28 中皮质激素 SN/T 2677-21 中雄激素以及临床研究中常检的孕激素和雌激素共计 8 种激素类药物建立了快速液质检测方法 8 种激素类药物在其相应的浓度范围内线性关系良好 (r 2 >.99),LOD 及 LOQ 均能满足国标对激素类药物残留的检测要求 本方法对激素药物的残留检测及临床检测具有指导意义 关键词 : 激素,TSQ Quantis, 液相色谱串联质谱 引言激素类药物主要包括雄激素 (Androgens) 雌激素 (Estrogens) 孕激素(Progestogens) 糖皮质激素 (Glucocorticoids) 等, 因其具有影响动物性别分化, 缩短生长周期, 促进毛发生长及恢复皮肤弹性等作用, 常被非法添加于各种动物源食品及化妆品中 研究表明, 儿童性早熟 妇女子宫癌 卵巢癌等疾病发病率的上升均与滥用此类药物有关, 因此 CEC 欧盟 国标 日本等均对动物源食品中激素类药物残留限量作出了严格要求 国标 SN/T 2222-28 及 SN/T 2677-21 也分别对进出口动物源性食品中糖皮质激素类兽药残留量及雄性激素类药物残留量检测方法做了相关规定 激素作为由内分泌腺或内分泌细胞分泌的内源性生物活性物质, 在体内作为信使传递信息, 通过调节各种组织细胞的代谢活动从而影响人体的生理活动 虽然激素在人体内的含量很低, 但却对人类健康有很大的影响, 缺乏或过多都会引发各种疾病 因此, 临床上检测人体多种激素的含量对于疾病的诊断具有重大意义 本文针对皮质激素 孕激素 雄激素 雌激素类共 8 种激素类药物建立了快速液相色谱串联质谱检测方法, 既可为激素类药物残留量测定提供技术保障, 亦可为激素的临床检测提供方法借鉴
2. 实验部分 2.1. 仪器与试剂 Thermo Scientific Vanquish Binary Horizon 超高效液相色谱仪 TSQ Quantis 三重四极杆质谱仪甲醇 ( 色谱纯, 美国 Thermo Fisher 公司 ); 实验用水为 Milli-Q 去离子水 ;NH 4 OH( 色谱纯,SIGMA) 2.2. 化合物信息及溶液配制 2.2.1 8 种激素类化合物及其对应内标物信息 ( 见表 1) 2.2.2 取适量激素类化合物标准品混合储备液, 稀释成浓度在.1 ng/ml - 5 ng/ml 范围的标准溶液, 进液质联用仪器分析 2.3. 色谱条件 : 色谱柱 :Thermo Scientific Accucore RP-MS (2.6 µm, 1 2.1 mm); 柱温 :4 ; 进样量 :5 µl; 流动相 :A 为水 ( 含.5% NH 4 OH),B 为甲醇, 梯度洗脱程序 ( 见表 2) 表 2. 梯度洗脱程序 Table 2 Gradient Elution Program 时间 A.5%NH 4 OH- 水 B 甲醇 流速. 85 15.3 1. 85 15.3 1.5 6 4.3 2. 2 8.3 4. 1 9.3 5. 1 9.3 5.5 85 15.3 7. 85 15.3 表 1. 8 种化合物及其对应内标物信息 Table 1 Information of 8 compounds and Internal Standards 类别序号简写英文名中文名 CAS 化学式分子量 1 2 皮质激素 3 4 孕激素 5 雄激素 6 7 雌激素 8 CORT CORT-d8 COR COR-d7 F F-d4 ALD ALD-d7 P P_C3 A2 A2-C3 E1 E1-D4 E2 E2-D3 Corticosterone 皮质酮 5-22-6 C21H3O4 346.46 Cortisone 可的松 53-6-5 C21H28O5 36.44 Cortisol 氢化可的松 / 皮质醇 5-23-7 C21H3O5 362.46 Aldosterone 醛固酮 52-39-1 C21H28O5 36.44 Progesterone 孕酮 57-83- C21H3O2 314.46 Androstenedione 雄烯二酮 63-5-8 C19H26O2 286.41 Estrone 雌酮 53-16-7 C18H22O2 27.37 Estradiol 雌二醇 5-28-2 C18H24O2 272.38 2
2.4. 质谱条件 : 可加热电喷雾电离源 (HESI), 正 负离子切换扫描模式 ; 扫描方式 :SRM; 喷雾电压 (+/-): 35/25V; 离子传输管温度 :35 ; 鞘气压力 3 arb; 辅助气压力 1 arb; 离子 源温度 :35 ; 碰撞气压力 :2 mtorr; 选择反应监测离子对信息见表 3 表 3. 8 种化合物及质谱采集参数 Table 3 MS/MS parameters of 8 compounds and Internal Standard 化合物 电离模式 母离子 (m/z) RFLens 电压 (V) 子离子 (m/z) 碰撞能量 (V) 皮质酮 ESI(+) 347.15 138 293.15* 16 皮质酮 ESI(+) 347.15 138 311.15 16 皮质酮 -D8 ESI(+) 355.2 137 337.23 16 可的松 ESI(+) 361.16 161 121* 3 可的松 ESI(+) 361.16 161 163.12 24 可的松 -D7 ESI(+) 368.2 158 168.12 24 氢化可的松 ESI(+) 363.15 141 121.4 25 氢化可的松 ESI(+) 363.15 141 39.8* 17 氢化可的松 -D4 ESI(+) 367.2 144 331.16 16 醛固酮 ESI(-) 359.18 127 331.2 15 醛固酮 ESI(-) 359.18 127 189* 17 醛固酮 -D7 ESI(-) 366.2 13 338.2 15 孕酮 ESI(+) 315.11 136 96.97* 22 孕酮 ESI(+) 315.11 136 18.97 25 孕酮 -C3 ESI(+) 318.2 139 112 25 雄烯二酮 ESI(+) 287.2 13 19. 24 雄烯二酮 ESI(+) 287.2 13 96.97* 21 雄烯二酮 -C3 ESI(+) 29.2 139 1. 21 雌酮 ESI(-) 269 176 145.* 37 雌酮 ESI(-) 269 176 183. 37 雌酮 -D4 ESI(-) 273 164 147. 37 雌二醇 ESI(-) 271 192 183.* 4 雌二醇 ESI(-) 271 192 145 39 雌二醇 -D3 ESI(-) 274 181 185 4 注 : 带 * 的为定量子离子 3
3. 实验结果与讨论 3.1 灵敏度测试采用上述仪器分析方法,8 种激素类化合物及其内标物在 7 分钟内均可获得良好的色谱峰, 图 1 为 8 种激素类化合物在 LOQ 处的选择离子流提取图, 各化合物灵敏度测试结果见表 4 3.2 线性范围测试采用上述仪器分析方法, 对 8 种激素类化合物进行线性范围测试, 线性相关系数 r 2 均.99, 线性关系良好 8 种激素类化合物线性方程及线性相关系数结果见表 4, 选取部分化合物线性方程图见图 2 表 4. 8 种化合物的线性范围 线性方程及相关系数 Table 4 Linear Ranges, Linear equations and correlation coefficients of 8 compounds 化合物 线性范围 (ng/ml) 线性方程 (r 2 ) 相关系数 LOD (pg/ml) LOQ (pg/ml) 皮质酮.5-1 y=-94.681+73526.1*x.9989 1 5 可的松.5-1 y=2714.25+8818.3*x.9991 1 5 氢化可的松.5-1 y=-1921.51+64621.4*x.9964 1 5 醛固酮.5-5 y=796.593+1944.2*x.9948 1 5 孕酮.5-1 y=1245.64+43947*x.9995 1 5 雄烯二酮.5-1 y=-523.444+9385*x 1. 1 5 雌酮.5-5 y=-167.166+29794.7*x 1. 1 5 雌二醇.1-5 y=-245.945+6928.3*x.9977 5 1 RT: 2. - 5. 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 RT: 3.4 AA: 3261 RT: 3.4 AA: 794288 RT: 3.24 AA: 66 RT: 3.25 AA: 147777 RT: 3.31 AA: 2226 RT: 3.3 AA: 318411 RT: 3.24 AA: 5639 RT: 3.18 AA: 7665 Cort Cort-D8 Cor Cor-D7 5 ALD-D7 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. F F-D4 ALD NL: 1.67E3 m/z= 292.65-293.65 F: + c ESI SRM ms2 347.15 [293.154-293.156, 311.154-311.156, 329.136-329.138] MS ICIS 5ppt_1 NL: 3.18E5 m/z= 336.73-337.73 F: + c ESI SRM ms2 355.2 [337.237-337.239] MS ICIS 5ppt_1 NL: 1.7E3 m/z= 12.5-121.5 F: + c ESI SRM ms2 361.162 [12.999-121.1, 163.124-163.126, 343.136-343.138] MS ICIS 5ppt NL: 5.1E4 m/z= 167.62-168.62 F: + c ESI SRM ms2 368.2 [168.124-168.126] MS ICIS 5ppt NL: 1.38E3 m/z= 38.58-39.58 F: + c ESI SRM ms2 363.15 [121.41-121.43, 39.82-39.84, 327.136-327.138] MS ICIS 5ppt NL: 1.28E5 m/z= 33.66-331.66 F: + c ESI SRM ms2 367.2 [331.166-331.168] MS ICIS 5ppt NL: 2.63E3 m/z= 188.5-189.5 F: - c ESI SRM ms2 359.18 [189.7-189.72, 331.27-331.29] MS ICIS 5ppt NL: 2.79E4 m/z= 337.73-338.73 F: - c ESI SRM ms2 366.2 [338.237-338.239] MS ICIS 5ppt RT: 2. - 5. 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 P P-C3 A A-C3 E1 E1-D4 E2 RT: 3.85 AA: 25471 RT: 3.86 AA: 2366228 AA: 5475 AA: 22956 RT: 3.51 AA: 1337 RT: 3.51 AA: 72237 RT: 3.48 AA: 297 RT: 3.47 AA: 21797 5 E2-D3 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. NL: 8.88E3 ms2 315.112 [96.969-96.971, 18.969-18.971, 297.136-297.138] MS ICIS 5ppt NL: 9.17E5 m/z= 111.5-112.5 F: + c ESI SRM ms2 318.2 [111.999-112.1, 256.219-256.221] MS ICIS 5ppt NL: 1.82E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 5ppt NL: 9.4E4 m/z= 99.5-1.5 F: + c ESI SRM ms2 29.2 [99.999-1.1, 242.237-242.239] MS ICIS 5ppt NL: 8.44E2 m/z= 144.5-145.5 F: - c ESI SRM ms2 269.62 [144.999-145.1, 183.53-183.55] MS ICIS 5ppt NL: 2.96E4 m/z= 146.5-147.5 F: - c ESI SRM ms2 273.82 [146.999-147.1] MS ICIS 5ppt NL: 2.13E2 m/z= 182.5-183.5 F: - c ESI SRM ms2 271.82 [145.41-145.43, 183.41-183.43] MS ICIS 1ppt NL: 9.27E3 m/z= 184.5-185.5 F: - c ESI SRM ms2 274.92 [185.53-185.55] MS ICIS 1ppt 图 1. 八种化合物及其内标物的色谱图 (LOQ) Fig.1 EIC Chromatogram of 8 Compounds and Internal Standards (LOQ) 4
3.3. 仪器相对标准偏差 RSD 性能展示采用上述仪器分析方法, 对 8 种激素类化合物进行相对标 准偏差测试 (n=6) 实验结果证明 8 种化合物相对标准偏差 RSD% 均 5% 其中, 雄烯二酮 5 pg/ml (n=6) RSD% 为 3.39%;1 pg/ml (n=6) RSD% 为 1.4%( 图 3) 1 5 Androstenedione Y = -523.444+9385*X R^2 = 1. W: 1/X 雄烯二酮..5 1. 1.5 Aldosterone Y = 796.593+1944.2*X R^2 =.9948 W: 1/X 6 5 醛固酮 4 3 2 1 1 2 3 4 5 Estrone Y = -167.166+29794.7*X R^2 = 1. W: 1/X Corticosterone Y = -94.681+73526.1*X R^2 =.9989 W: 1/X 4 3 2 雌酮 8 6 4 皮质醇 1 2..5 1. 1.5..2.4.6.8 1. 1.2 图 2. 部分化合物线性方程图 Fig.2 Linear Ranges, Linear equations and correlation coefficients RT: 2. - 5. 1 5 5 pg/ml-1 AA: 4733 NL: 1.82E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 5ppt_1 RT: 2. - 5. 1 5 1 pg/ml-1 AA: 89379 NL: 3.33E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 1ppt_1 1 5 5 pg/ml-2 AA: 46722 NL: 1.92E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 5ppt_2 1 5 1 pg/ml-2 AA: 8941 NL: 3.45E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 1ppt_2 Relative Abundance 1 5 1 5 5 pg/ml-3 5 pg/ml-4 AA: 43724 AA: 45136 NL: 1.92E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 5ppt_3 NL: 1.79E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 5ppt_4 Relative Abundance 1 5 1 5 1 pg/ml-3 1 pg/ml-4 AA: 88638 AA: 91363 NL: 3.26E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 1ppt_3 NL: 3.19E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 1ppt_4 1 5 5 pg/ml-5 AA: 4532 NL: 2.4E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 5ppt_5 1 5 1 pg/ml-5 AA: 88863 NL: 3.32E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 1ppt_5 1 5 5 pg/ml-6 AA: 45928 NL: 1.98E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 5ppt_6 1 5 1 pg/ml-6 AA: 9776 NL: 3.13E4 ms2 287.2 [96.969-96.971, 18.999-19.1] MS ICIS 1ppt_6 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 图 3. 雄烯二酮选择离子流提取图 n=6 Fig.3 EIC Chromatogram of Androstenedione n=6 5
4. 实验结果与讨论本文建立了三重四极杆液质联用仪 (TSQ Quantis) 分析 8 种激素类药物的检测方法 由实验结果可以看出, 基于 TSQ Quantis 建立的检测方法不仅具有优异的灵敏度和线性范围同时具备优异的重现性, 本方法可用于激素类药物的日常分析检测 赛默飞官方微信 赛默飞色谱与质谱中国 热线 8 81 5118 电话 4 65 5118 www.thermofisher.com For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 217 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified.