23, Vol.3, No. 大肠杆菌和假单胞菌在猪背最长肌上混合 预测模型的建立 金 鑫 禹迎迎 吴菊清 徐幸莲 周光宏* (南京农业大学 教育部肉品加工与质量控制重点实验 江苏 南京 摘 295) 要 将大肠杆菌和假单胞菌混合接种到猪背最长肌上 分别贮藏在 5 2 条件下 并做3 和22 两个验证温度 结果表明 修正的Gompertz方程能很好地拟合大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线 采用Belehradek模 型能很好地描述温度对最大比生长速率(μmax)和延滞时间(Lag)的影响 采用3 和22 两个验证温度验证模型的可 靠性 表明模型是可靠性的 关键词 大肠杆菌 假单胞菌 混合 预测模型 Predictive Modeling of Simultaneous Growth of Escherichia coli and Pseudomonas spp. in Inoculated Pork longissimus dorsi Muscle JIN Xin YU Ying-ying WU Ju-qing XU Xing-lian ZHOU Guang-hong* (Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 295, China) Abstract Pork longissimus dorsi muscle was inoculated with both Escherichia coli and Pseudomonas spp., and then stored at, 5, 2 or. The results showed that growth curves of E. coli and Pseudomonas spp. at different temperatures could be well described by a modified Gompertz model. The influence of temperature on growth rate (μmax) and lag phase (Lag) was well described by Belehradek model. The model developed in this study was confirmed to be reliable by validation experiments at 3 and 22. Key words Escherichia coli Pseudomonas mixed strains predictive modeling 中图分类号 TS.5 文献标志码 A 文章编号 -3(23)--5 doi:.5/spkx-3-232 预测食品微生物学(predictive food microbiology PFM)是一门建立在食品微生物学 数学 统计学和计算 现象 单一优势腐败菌模型不能很好地反映肉类真实的腐 机科学基础上的新兴学科 通过计算机技术对食品中微 败情况 目前 国外已有很多混合预测模型的研究[-] 生物的延迟 生长 残存和死亡进行数量化的预测 为 而国内大部分的预测模型主要还是选用一种优势腐败菌 食品行业提供数据库和软件包 目的是在不进行传统微 或致病菌来建立预测模型 李苗云等[]通过选用种冷却 生物检测的条件下快速对食品的安全性和货架期进行预 肉的优势腐败菌建立动力学生长预测模型 本研究选择 测 实现从原料到生产流通整个过程的计算机智能化管 鲜猪肉的主要优势腐败菌大肠杆菌和假单胞菌 建立混 理和监控 保证食品的质量和安全[-3] 合预测模型 以期为将来的混合预测模型研究提供理论 传统的微生物检测技术一直依赖于对原材料及最终 肉类的菌相复杂 且细菌之间存在复杂的群体感应 支持 产品的微生物检验[] 不能很好的监测肉品在整个生产流 通过程中的微生物变化规律 微生物预测技术通过建立 材料与方法 数学模型 可以在不进行传统微生物检测的条件下快速 对食品的安全性和货架期进行预测 可以高效的监测肉 品在生产流通过程中的微生物安全问题 保障肉品的质 量和安全[5]. 材料与仪器 取宰后h内 ph值为5..2的第 根肋骨处的 三元猪猪背最长肌 大肠杆菌和假单胞菌菌种均分离于 收稿日期 2-5-2 基金项目 国家国际科技合作项目(29DFA3) 作者简介 金鑫(95 ) 男 硕士研究生 研究方向为肉类加工与安全 E-mail 29@qq.com *通信作者 周光宏(9 ) 男 教授 博士 研究方向为肉品科学 E-mail ghzhou@njau.edu.cn
23, Vol.3, No. 猪肉 营养琼脂 北京陆桥技术有限公司 所用常规化 学试剂均为分析纯 SterilGARD生物安全柜 = blagh(t TminLag) Lag 美国Baker公司 低温生 化培养箱(控温精度±. 温度均匀度± ) 上海 (3) 式中 T是培养温度/ T min 是一个假设概念 指 微生物没有代谢活动时的温度 此时最大比生长速率为 Stik设备有限公司 零 b是方程的常数.2 将公式()求得的μmax Lag和对应的温度代入方程式 (2)和(3) 求得bmaxμ Tminμ blag TminLag这个参数值 建 菌种活化 菌种在实验时分别接种活化3次以上 得到活化的大 肠杆菌和假单胞菌菌液.3 立二级模型 实验数据采用SPSS 3.统计分析软件 进行回归分析 样品处理 在无菌生物安全柜内用燃烧的酒精棉球擦拭整..3 块鲜肉表面两次 再用紫外线杀菌min 用无菌手 模型的验证 为了评价模型的可靠性 采用建立的生长动力学模 术刀剔除表面的肉 将内部的肉分割成g(大小约 型求得3 和22 的预测值 与实际贮藏实验值比较 cm cm cm)的肉样 放入无菌培养皿内 将肉样 采用准确因子(A f)和偏差因子(b f)来验证所建预测模型的 cm cm的两面再用紫外线各杀菌min 平板计数法 可靠性[] Af和Bf分别表示为 稀释倍检测肉样上的微生物 未发现微生物生长. Af = 接种 接种前使用生理盐水分别稀释大肠杆菌和假单胞菌 lg(npre/nobs) n () lg(npre/nobs) n (5) 的菌液 混合菌液 使大肠杆菌与假单胞菌的数量之比 Bf = 约为: 移液枪吸取2µL接种液 在肉样cm cm的 式中 N obs是实验实测值 N pre是采用预测模型得到 两个面各均匀取9个点滴加µL接种液 使肉样的细菌 的与Nobs同一时间所对应的预测值 n是实验次数 数约为(lg(CFU/g)).5 2 肉样贮藏和微生物计数 结果与分析 将盛有接种肉样的平皿表面包一层保鲜膜(氧气透过 率.3cm3/(m2 h Pa) 水蒸气透过量 5g/(m2 h)) 2. 一级模型的构建 选取中间温度3 和22 两个验证温度 适时取出肉 样 用无菌剪刀剪碎 倾入装有2mL无菌生理盐水的 锥形瓶内 摇床上充分振荡5min 梯度稀释 平板计 数法计数(营养琼脂培养基 培养温度3 培养时间 分别贮藏在 5 2 的低温生化培养箱内 并 h) 每个温度做3个重复 每个重复做3个平行..... 5.. 数学模型的建立和验证 一级模型的建立 采用修正的Gompertz函数[9]拟合一级模型 N(t)=N (N max N ) exp{ exp[2.μ max/(n max N) (Lag t)] } () 式中 t为时间/h N(t)为t时所对应的微生物数量 (lg(cfu/g)) Nmax N为最大和初始微生物量(lg(CFU/g)) 2 9... 5.. μmax为细菌的最大比生长速率/h Lag为细菌生长延滞时 迭代法(Gauss iterative) 进行回归分析 二级模型的建立 为了描述温度对一级模型的生长动力学参数的影 [] 响 采用Belehradek(平方根)模型 描述 实验数据采用Statistica.2统计分析软件 采用高斯 2 32 5. c 9.... 5.. (2) 间/h µmax = bmaxµh(t Tminµ). b 9. -..2.. a 9.
. d 9......5..3 5.. 3.2 图 5 2 䌂㮣 ᑺ/ć (a) 5 (b) 2 (c)和 (d)条件下大肠杆菌和 图2 假单胞菌的生长曲线 Fig. 9. μmax 23, Vol.3, No. 温度与最大比生长速率的关系 Temperature dependence of µmax Fig.2 Grown curves of Escherichia coli and Pseudomonas at, 5, 2 or 根据在 5 2 贮藏条件下 大肠杆菌 /Lag 和假单胞菌在肉样上生长实验的实测值 采用修正的 Gompertz函数拟合得到图生长曲线和如下方程式 Y =.5 + 5.5 exp { exp[.59 (3. t )+ ]} 5 Y =. + 5.3 exp { exp [.9 (3.2 t )+ ]} 2 Y =. +.9 exp { exp[. (.99 t )+ ]} Y =.39 + 5.23 exp{ exp [.9 (.9 t )+ ]}.9....5..3.2 5 图3 表 2 䌂㮣 ᑺ/ć 5 2 贮藏条件下大肠杆菌和假单胞菌在 温度与延滞期的关系 Temperature dependence of Lag Fig.3 猪背最长肌上的生长动力学参数 Table Kinetic parameters of Escherichia coli and Pseudomonas grown in longissimus dorsi muscle at, 5, 2 or 温度/ N(lg(CFU/g)) Nmax(lg(CFU/g)).5 9.5 Lag/h R2.9.99.999.995. 5. 9.. 2..39 9.33 9.32.22..99.9 模型验证 根据公式()和() 可分别求出3 和22 条件下大 μmax/h- 3. 3.2 2.3 由表可知 修正的Gompertz方程能较好的拟合本 研究中大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线 在 5 2 贮藏条件下所得到的回归相关系数(R 2 )分别 肠杆菌和假单胞菌在热鲜猪肉上的生长动力学参数μ max 和Lag 再将μ max和lag代入公式()中可得到大肠杆菌和 假单胞菌在3 和22 条件下的生长预测曲线 并由公 式()和(5)得出Af分别为.23. Bf分别为.92.3(表2) 图 5分别为预测生长曲线和实测生长曲线 的对比图 可以直观的看出预测模型可以很好的预测大 肠杆菌和假单胞菌的生长曲线 为.99.999.995和. 说明拟合效果较好 表2 在 5 2 贮藏条件下的μ max 分别为.9 Table 2 -..22.h Lag分别为3. 3.2.99.9h 说明贮藏温度升高 μmax越大 微生物生长速率越 快 同时Lag越小 微生物生长的延滞时间越短 2.2 3 和22 条件下大肠杆菌和假单胞菌生长预测值的Af和Bf Af and Bf of predicted values of Pseudomonas and Escherichia coli grown in pork at 3 or 22 验证温度/ 3 22 实验次数(n) Bf Af.92.3.23. 二级模型的构建 9 µmax =.h(t +.3) () =.3h(T.3) Lag () 二级模型描述温度对一级模型的生长动力学参数 的影响 采用Belehradek(平方根)模型描述 [] 得到 Belehradek模型如下 ᅲ 乘 5 2 9 由图2 3可知 采用Belehradek模型能很好地描述温 度对μmax和Lag的影响 方程呈现良好的线性关系 两个 方程的回归相关系数(R2)值分别为.9和.923 图 Fig. 3 条件下的预测值与实测值 Growth curves predicted and observed at 3
9 23, Vol.3, No. 研究的µmax明显高于姜英杰等[]的实验结果而低于李苗云 9 等[]的结果 呈现接种菌种种类越多 µmax越大的现象 这可能主要与实验接种的混合菌种产生的群体感应有 5 3 ᅲ 乘 关 群体感应是指细菌通过分泌自诱导物信号分子进行 胞表面或者细胞内的受体结合 调节基因的表达 协调 交流 当信号分子达到一定的浓度时 可以与群体中细 2 图5 Fig.5 群体中所有细菌细胞的行为 从而使细菌群体表现出单 22 条件下的预测值与实测值 个细菌无法具有的生理功能或行为[] 细菌中常见的自 Growth curves predicted and observed at 22 诱导物信号分子有多肽(oligopeptide) 酰基高丝氨酸内酯 (acylated homoserine lactone AHL)和LuxS/Autoinducer-2 3 讨 论 (AI-2) 它们介导的信号传递系统分别存在于革兰氏阳性 菌 革兰氏阴性菌以及两类细菌之间[] 上述建模的鲜肉 微生物行为是导致鲜肉腐败的主要原因之一 温度 是影响鲜肉腐败最重要的因素 [] 优势腐败菌之间的群体感应可能相互促进了生长[9-2] 有研究表明在不同的 随着贮藏温度的升高 细菌的延滞时间(Lag)从 温度范围内 鲜肉的优势腐败菌是不同的 低温下假单 3.h下降到.9h 说明贮藏温度越高 细菌生长 胞菌是主要的优势腐败菌 当温度超过 时 则是由 其他细菌占据优势地位 如大肠杆菌 [3] 同时 国内已 有大量关于大肠杆菌和假单胞菌预测模型的研究 所以 本研究选择假单胞菌及大肠杆菌作为研究对象 建立大 肠杆菌和假单胞菌混合预测模型 一级模型使用修正的Gompertz模型函数[9] 能很好地 拟合混合菌种大肠杆菌和假单胞菌的生长曲线 在 5 2 条件下所得到的回归相关系数R 2 分别为.99.999.995和. 拟合效果非常好 二级模 型描述温度对μmax和Lag的影响 采用Belehradek模型[]描 述呈现良好的线性关系 两个方程的回归相关系数(R2)值 分别为.9和.923 的延滞时间越短 对比姜英杰 []和李苗云 []等的实验结 果 前者建立的假单胞菌的生长预测模型显示 T= 时 Lag=2.22h T= 时 Lag=3.5h 大肠杆菌 的生长预测模型显示 T= 时 Lag=29.9h T= 时 Lag=5.h 后者建立的预测模型显示 T= 时 Lag=.h T=2 时 Lag=.5h 而本研究的混 合预测模型结果显示 T= 时 Lag=3.h T=5 时 Lag=3.2h T=2 时 Lag =.99h 本研究的Lag 明显比姜英杰等[]的实验结果短 而比李苗云等[]的实验 结果长 基本呈现接种菌种种类越多 Lag越短的现象 这可能主要与实验接种的混合菌种有关 单一的优势腐 模型的验证对于模型的建立和评价具有重要意义 败菌不能快速适应周围的环境 无法快速生长繁殖 所 为了验证模型的可靠性 本研究采用建立的生长动力学 以Lag较长 在菌种种类较多的情况下 鲜肉的优势定腐 模型得到的预测值 与实际在3 和22 条件下贮藏实 败菌之间的群体感应可能促进了生长 缩短了对外部环 验值进行比较 得到的动力学参数的A f 分别为.23. Bf分别为.92.3 表明采用Gompertz函数和 境的适应时间 所以Lag相对较短[2] Belehradek模型建立的优势腐败菌的预测模型具有较高的 种来源和活性等实验条件和方法的差异 也会导致µmax和 可靠性和实用性 Lag存在一定的差异 随着贮藏温度的升高 细菌的µ max从.9h -上升到.h - 说明贮藏温度越高 细菌生长速率越快 在 类似的实验方法下 姜英杰等 [-5] 同时3组实验之间也存在初始接种量 接种方式 菌 结 论 建立的单一的优势腐 败菌假单胞菌及大肠杆菌在猪背最长肌上生长预测模 型 结果表明 假单胞菌的生长预测模型显示 T= 时 µ max =.2h - T= 时 µ max =.5h - 大肠杆 菌的生长预测模型显示 T= 时 µ max =.h - T= 时 µ max=.5h - 同时 李苗云等 []建立的冷 却肉的优势腐败菌的混合生长预测模型显示 T= 时 µmax=.3h- T=2 时 µmax=.h- 而本研究 - 中的混合预测模型结果显示 T= 时 µmax=.9h T=5 时 µmax=.h- T=2 时 µmax=.22h- 本 采用修正的Gompertz函数拟合了 5 2 贮藏条件下的混合菌种大肠杆菌和假单胞菌的生长曲 线 回归相关系数(R 2 )分别为.99.999.995和. 拟合效果非常好 采用Belehradek模型能很好地描述温度对μmax和Lag的影 响 两个方程的回归相关系数(R2)值分别为.9和.923 采用3 和22 两个验证温度下得到的实测值与预 测值进行比较 验证模型的可靠性 A f 分别为.23. Bf分别为.92.3 表明模型的可靠性较好
基础研究 23, Vol.3, No. 9 参考文献 : [] McDONALD K, SUN D W. Predictive food microbiology for the meat industry: a review[j]. International Journal of Food Microbiology, 999, 52(/2): -2. [2] MEMBR J M, LAMBERT R J W. Application of predictive modelling techniques in industry: from food design up to risk assessment[j]. International Journal of Food Microbiology, 2, (): -5. [3] MCMEEKIN T A, OLLEY J, RATKOWSKY D A, et al. Predictive microbiology: towards the interface and beyond[j]. International Journal of Food Microbiology, 22, 3: 395-. [] ROBERTS T A. Microbial growth and survival: developments in predictive modelling[j]. Food Technology, 99, 5: -9. [5] MCMEEKIN T A. Predictive microbiology: quantitative science delivering quantifiable benefits to the meat industry and other food industries[j]. Meat Science, 2, : -2. [] KAREN M V, ELS J D, JAN F V I. Predictive modeling of mixed microbial populations in food products: evaluation of two-species models[j]. Journal of Theory Biology, 2, : 53-2. [] LEBERT I, ROBLES V O, LEBERT A. Application of polynomial models to predict growth of mixed cultures of Pseudomonas spp. and Listeria in meat[j]. International Journal of Food Microbiology, 2, : 2-39. [] 李苗云, 孙灵霞, 周光宏, 等. 冷却猪肉不同贮藏温度的货架期预测模型 [J]. 农业工程学报, 2, (): 235-239. [9] ZWIETERING M H, JONGENBERGER I, ROMBOUTS F M, et al. Modeling of the bacterial growth curve[j]. Apply Environment Microbiology, 99, 5: 5-. [] RATKOWSKY D A, OLLEY J, McMEEKIN T A, et al. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures[j]. Journal of Bacteriology, 92, 9: -5. [] ROSS T. Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology[j]. Journal of Apply Bacteriology, 99, : 5-5. [] KOUTSOUMANIS K P, TAOUKIS P. Meat safety, refrigerated storage and transport: modeling and management[m]. UK: Wood Head/Publishing Ltd., : 53-5. [3] KOUTSOUMANIS K P, SKANDAMIS P, NYCHAS G J E, et al. Development of a microbial model for the combined effect of temperature and ph on spoilage of ground meat, and validation of the model under dynamic temperature conditions[j]. Apply Environment Microbiology, 2, 2(): -3. [] 姜英杰. 假单胞菌和大肠杆菌在冷却猪肉中生长预测模型的建立 [D]. 南京 : 南京农业大学,. [5] 姜英杰, 邹晓葵, 彭增起. 大肠杆菌在猪背最长肌上生长预测模型的建立 [J]., 2, 29(): 5-9. [] 李苗云. 冷却猪肉中微生物生态分析及货架期预测模型的研究 [D]. 南京 : 南京农业大学, 2. [] WATERS C M, BASSLER B L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria[j]. Annu Rev Cell Dev Biol,, 2(): 39-3. [] 陈林, 杨亮, 段康民. 从进化谈细菌细胞间的群体感应信号传递 [J]. 遗传, 2, 3(): 33-. [9] RAVN L, CHRISTENSEN A B, MOLIN S, et al. Methods for detecting acylated homoserine lactones produced by Gram-negative bacteria and their application in studies of AHL-production kinetics[j]. Journal of Microbiological Methods, 2, : 239-. [2] GRAM L, CHRISTENSEN A B, RAVN L, et al. Production of acylated homoserine lactones by psychrotrophic members of the Enterobacteriaceae isolated from foods[j]. Apply Environment Microbiology, 999, 5: 35-33. [2] 扈麟. 冷却猪肉腐败的细菌群体感应研究 [D]. 长沙 : 湖南农业大学, 2.