8期

中国农学通报 203,29(8):50-54 Chinese Agricultural Science Bulletin 鸡 猪大肠杆菌 ESBLs 基因型检测及耐药性分析 曲志娜, 张颖, 李玉清, 李梁梁 2, 王娟, 黄秀梅 2, 刘焕奇 ( 中国动物卫生与流行病学中心, 山东青岛 266032; 2 青岛农业大学动物科技学院, 山东青岛 26609) 摘要 : 为检测不同动物源大肠杆菌中超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBLs) 的基因型, 探究 ESBLs 对大肠杆菌耐药性的影响, 指导兽医临床有效防治大肠杆菌病 采用 NCCLS 标准方法和双纸片协同法, 对 02 株大肠杆菌菌株进行抗菌药物敏感性测定和和 ESBLs 检测, 设计合成 4 对引物, 用 PCR 方法进行了 ESBLs 耐药质粒的 DNA 扩增和基因型分析 结果表明 : 以产 ESBLs 细菌的耐药质粒为模板扩增出了与预期片段大小相符的 TEM CTX-M 型 ESBLs 产物, 但均未扩增出 SHV OVA 型 ESBLs 产物 鸡源 猪源产 ESBLs 菌株检出率分别为 8% 6% CTX-M TEM 型为山东莱西地区动物源产 ESBLs 大肠杆菌菌株的流行基因型, 且鸡源产 ESBLs 大肠杆菌菌株分布广泛, 应加强当地产酶耐药菌的监测和研究, 以有效防治此类细菌引发的疾病 关键词 : 大肠杆菌 ;ESBLs; 耐药性 ; 基因型中图分类号 :S859. 文献标志码 :A 论文编号 :202-2654 Genotype Detection of ESBLs and Antibiotic Resistance Analysis in E. coli Strains from Chickens and Pigs Qu Zhina, Zhang Ying, Li Yuqing, Li Liangliang 2, Wang Juan, Huang Xiumei, Liu Huanqi 2 ( China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao Shandong 266032; 2 Department of Animal Science, Qingdao Agricultural University, Qingdao Shandong 26609) Abstract: In order to detect genotype of extend spectrum β-lactamase (ESBLs) in E. coli isolates from different animal, and explore the influence of ESBLs to E. coli resistance, to instruct to prevent and cure Colibacillosis in veterinary clinic effectively. We detected antimicrobial susceptibility and ESBLs for 02 E. coli strains by NCCLS standard method and Double-disk Synergy Test, and designed and synthetized four pair of primers, studied ESBLs gene type with amplified and analyzed by PCR. The results showed that the ESBLs producing bacteria amplified by PCR with TEM-type and CTX-M-type down-object while SHV-type and OVA-type down-object did not. The detection rate of the ESBLs producing E. coli strains from chickens and pigs was 8% and 6% respectively. CTX-M-type and TEM-type were epidemic genotype of ESBLs in Shandong Laixi Region, and the ESBLs producing E. coli strains from chickens were widespread. We should reinforce monitoring and studying about the ESBLs producing drug-resistant bacteria in order to prevent and cure Colibacillosis in veterinary clinic effectively. Key words: E. coli; ESBLs; resistance; gene type 0 引言 ESBLs(Extended-Spectyumβ-Lactamase,ESBLs) 是质粒介导的能水解氧亚氨基 β- 内酰胺酶类抗菌药的 一类 β- 内酰胺酶, 主要由大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌 属产生, 因其理化性质和耐药性的差异, 不同地区流行 的基因型不尽相同 [] ESBLs 多数以质粒编码, 能通 第一作者简介 : 曲志娜, 女,970 年出生, 山东龙口人, 副研究员, 硕士, 从事动物卫生及食品安全研究 通信地址 :266032 青岛市南京路 369 号,Tel: 0532-85643269,E-mail:quzhina@hotmail.com 通讯作者 : 刘焕奇, 男,970 年出生, 山东巨野人, 教授, 博士, 从事临床兽医学研究 通信地址 :26609 青岛市城阳区长城路 700 号,Tel: 0532-86080737,E-mail:huanqiliu@26.com 收稿日期 :202-07-30, 修回日期 :202-0-2

曲志娜等 : 鸡 猪大肠杆菌 ESBLs 基因型检测及耐药性分析 5 过接合 转化和转导等形式使耐药基因在细菌中扩散, ESBLs 产生菌的广泛耐药已成为目前临床治疗的突出问题 本实验以山东莱西地区不同动物来源大肠杆菌为研究对象, 进行了 ESBLs 基因型检测和耐药性分析, 以期为当地畜牧业生产中大肠杆菌病的控制提供依据 材料与方法. 材料.. 菌株来源 49 株猪源大肠杆菌和 53 株鸡大肠杆菌 ( 从山东莱西地区养殖场分离获得 ), 以及大肠埃希菌 ATCC25922, 由中国动物卫生与流行病学中心提供 ; 肺炎克雷伯菌 ATCC700603( 产 SHV 型 ESBLs), 购自上海复祥生物科技有限公司..2 药敏纸片及药敏板药敏纸片 : 头孢噻肟 (CTX, 30 μg/ 片 ) 头孢他啶 (CAZ,30 μg/ 片 ) 氨曲南 (AZT, 30 μg/ 片 ) 头孢曲松 (CRO,30 μg/ 片 ) 阿莫西林 / 克拉维酸 (AMX/Clav,20/0 μg/ 片 ) 头孢他啶 / 克拉维酸 (CAZ/Clav,30/0 μg/ 片 ) 头孢噻肟 / 克拉维酸 (CTX/ Clav,30/0 μg/ 片 ), 购自北京天坛药物生物技术开发公司 药敏板 : 含有氨苄西林 (AM) 奥格门丁 (A/C) 头孢唑啉 (CZ) 头孢噻呋 (EFT) 庆大霉素 (GM) 卡那霉素 (K) 大观霉素 (SPT) 四环素 (TE) 氟苯尼考 (FFC) 磺胺异恶唑 (SF) 新诺明 (SXT) 恩诺沙星 (ENR) 二氟沙星 (DIF) 多粘菌素 E(PME) 等 4 种受试药物, 购自中国兽医药品监察所..3 培养基和试剂胰蛋白大豆胨肉汤 胰蛋白大豆胨肉汤平板 MH 肉汤 M-H 平板, 购自北京陆桥技术有限责任公司 ; 质粒小提试剂盒, 购自天根生化科技有限公司..4 主要仪器电热恒温培养箱 ( 上海爱朗仪器有限 公司 EYELS SLI-700 型 ) 分光光度计 ( 上海精科有限 责任公司棱光 722N) 比浊仪 ( 英国 OXOID 公司 ) 快 速涡匀器 ( 中外合资深圳天南海北有限责任公司 SK-) PCR 仪 (BIORAD 公司 ).2 方法.2. 抗生素敏感试验参考 NCCLS 推荐的微量肉汤 稀释法测定各受试药对细菌的最低抑菌浓度 MIC 值, [2] 结果按 NCCLS 标准判读.2.2 ESBLs 表型检测 [2] () 初筛和确证试验 按 NCCLS 标准操作和判 读 初筛试验 : 将受试菌株均匀涂布于 M-H 琼脂平板, 贴 CAZ CTX CRO AZT 纸片,37 培养 8~24 h 当 抑菌圈直径满足以下任一条件 :CAZ 22 mm,cro 25 mm,azt CTX 27 mm, 提示为疑似产 ESBLs 菌 [3] 株, 应进一步作确证试验 同时以肺炎克雷伯菌 ATCC700603 作阳性对照, 以大肠埃希菌 ATCC25922 作阴性对照 确证试验 : 将受试菌株均匀涂布于 M-H 琼脂平 板, 分别贴 CAZ CAZ/Clav 以及 CTX CTX/Clav 2 组 纸片,37 培养 8~24 h 见 2 组中任一组加克拉维酸 比不加克拉维酸抑菌圈直径 5 mm, 可确认为产 ESBLs 菌株 (2) 双纸片协同试验 [2,4-5] 将受试菌均匀涂布于 MH 琼脂平板, 在平板中心贴 AMX/Clav 纸片, 四周贴 CAZ CTX CRO AZT 4 种纸片, 距中心分别为 20 25 30 mm,37 培养 8~24 h, 观察结果并确定最佳距离.2.3 ESBLs 基因型检测 () 引物的设计及合成 根据 GenBank 公布的 ESBLs 基因序列, 用 Primer Express 软件分别设计 TEM SHV CTX-M OXA 型的特异性引物 ( 见表 ), 所有引物均由上海生物工程公司合成 基因型 表 β- 内酰胺酶基因型检测的 PCR 引物序列 上游 下游 TEM SHV CTX OXA 5 -GGGGATGAGTATTCAACTTTCC-3 5 -GGTTATGCGTTATATTCGCCTGTG-3 5 -GGGCTGAGATGGTGACAAAGA G-3 5 -TGAAGGGTTGGGCGATTT-3 5 -GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA-3 5 -TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA-3 5 -CGTGCGAGTTCGATTTATTCAAC-3 5 -TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA-3 (2)PCR 扩增 以质粒小提试剂盒提取的质粒 DNA 为模板进行 PCR 扩增 反应体系为 25 μl, 包括 Taq @ Green Master Mix2.5 μl 上下游引物各 0.5 μl 模板 2 μl 超纯水 9.5 μl 反应条件 :94 预变性 5 min,94 变性 min, 退火 min, 退火温度 55,72 延伸 min, 共 30 个循环,72 延伸 5 min PCR 产物在 含 0.05 μg/l EB 的.0% 琼脂糖凝胶上电泳, 凝胶成像分析系统摄像 同时设大肠埃希菌 ATCC25922 和肺炎克雷伯菌 ATCC700603 作对照 2 结果与分析 2. ESBLs 表型检测结果及分析 2.. 初筛及确证试验结果 53 株鸡源大肠杆菌经表

52 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 型筛选和确证试验, 有 43 株 ESBLs 阳性, 检出率 8% (43/53) 49 株猪源大肠杆菌经表型筛选和确证试验, 仅有 3 株 ESBLs 阳性, 检出率 6%(3/49) 典型图片见图 ~2 图 3 双纸片协同法试验典型图 图 初筛试验典型图图 2 确证试验典型图 2..2 双纸片协同法检测结果双纸片协同法的检测结果与表型筛选和确证试验检测结果完全一致 5 种药敏纸片对于 AMC/CA 分别在 20 25 30 mm 处进行双纸片协同实验结果表明, 在 20 mm 处有重叠现象, 无法判断协同 ; 在 25 mm 处发生明显协同 ; 在 30 mm 处协同现象不明显, 故中心纸片与周围纸片最佳作用距离为 25 mm( 图 3) 2.2 药敏试验结果与分析 53 株鸡源大肠杆菌和 49 株猪源大肠杆菌对 8 类 4 种抗菌药都有不同程度的耐药性, 且均为多重耐药菌株 耐药严重的药物有磺胺类 四环素类和青霉素类, 而对奥格门丁和多粘菌素 E 相对敏感 其中鸡源菌株比猪源菌株耐药严重,2 种药物的耐药率均在 60% 以上,45.3% 的分离菌株为 2 耐菌株 ( 图 4~5) 产 ESBLs 菌株对多数药物的耐药率高于非产 ESBLs 菌株, 且多重耐药严重, 尤其是鸡源大肠杆菌, 除多粘菌素 E 外, 产 ESBLs 菌株对其他 3 种药物的耐药率均高于非产 ESBLs 菌株, 产 ESBLs 多重耐药菌株以 2 耐为主, 占 53%( 图 6~7) 此外, 有 3 株鸡源大肠杆菌和 2 株猪源大肠杆菌虽为产酶菌株, 但均不耐头孢唑啉, 其中 株猪源菌株对头孢唑啉和头孢噻呋均敏感 2.3 ESBLs 基因型的 PCR 扩增结果 43 株产 ESBLs 鸡源大肠杆菌中,40 株 CTX-M 基因和 3 株 TEM 基因阳性,CTX-M 和 TEM 基因型的检出率分别为 93% 72% 其中有 3 株同时检测出 TEM CTX-M 基因, 复合基因型检出率高达 72% 而 3 株产 ESBLs 猪源大肠杆菌全部扩增为 CTX-M 基因 典型图见图 8~9 4 讨论与结论 4. ESBLs 检测方法临床常用的方法有双纸片法 三维试验 Etest 等方法, 其中初筛和确证试验是 CLSI 推荐的标准方法 尽管方法不同, 但其基本原理一致, 就是利用广谱 β- 内酰胺酶抑制剂如克拉维酸的协同作用有无来判断细菌是否携带 ESBLs 本实验所用的 2 种方法检测结果一致, 具有重复性较好 操作较为方便的优点 但实验 鸡源大肠杆菌 猪源大肠杆菌 耐药率 耐菌株 图 4 鸡 猪大肠杆菌药敏实验结果

曲志娜等 : 鸡 猪大肠杆菌 ESBLs 基因型检测及耐药性分析 53 50.00 45.00 40.00 35.00 30.00 25.00 20.00 5.00 0.00 5.00 0.00 鸡源大肠杆菌 猪源大肠杆菌 耐 耐 耐 耐 耐 耐 耐 耐 耐 20 00 80 60 40 20 图 5 鸡 猪源大肠杆菌多重耐药结果 耐菌株鸡源产 菌株鸡源非产 菌株猪源产 菌株猪源非产 菌株 0 图 6 产 ESBLs 菌株和非产 ESBLs 菌株耐药结果 耐药性 鸡源产 菌株鸡源非产 菌株猪源产 菌株猪源非产 菌株 耐 耐 耐 耐 耐 耐 耐 耐 耐 耐药性 2000 bp 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 00 bp 图 7 产 ESBLs 菌株和非产 ESBLs 菌株多重耐药结果 M 2 M 2 3 图 8 分离菌株质粒 PCR 产物图 (TEM 型 ) 2000 bp 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 00 bp M:DL2000; 2 3: 受试菌株 PCR 反应条带 图 9 分离菌株质粒 PCR 产物图 (CTX-M)

54 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 发现双纸片协同法纸片间放置距离的选取对实验结果 [6] 影响较大 Jarlier 等建议以 30 mm 间距为宜, 也有的 学者提出当以 30 mm 间距为准的双纸片法阴性时可 改为 20 mm 间距为准的双纸片法重复 次 [7] 本实验 采用 20 25 30 mm 3 种间距, 结果发现,20 mm 间距会 造成抑菌圈过度重叠,30 mm 则因抑菌圈过小而无法 判断是否有协同作用, 从而确定最佳间距为 25 mm 4.2 分离菌株的抗菌药物耐药性 本实验结果显示, 除了奥格门丁和多粘菌素 E 外, 山东莱西地区动物源大肠杆菌分离菌株对其余 2 种 抗菌药物耐药相对严重, 且所有菌株均呈现 5 种以上 耐药, 尤其是鸡源大肠杆菌耐药现象更为突出,45.3% 的菌株为 2 耐菌株, 产 ESBLs 菌株的检出率高达 8%, 比苑丽等 [8] (60.8%) 和 Sridhar 等 [9] (60.9%) 报道的 检出率高, 明显高于胡功政等 [0] 2006 年 (2.9%) 和付秀 玲等 [] 2007 年 (45%) 的报道结果 由此可见, 山东莱西 地区鸡源大肠杆菌产 ESBLs 菌株分布广泛且耐药严 重, 给临床治疗带来困难, 兽医临床应加强监测和研 究, 对不同动物来源大肠杆菌进行科学合理的防治, 以 遏制此类产酶耐药菌的传播和扩散 4.3 不同地区流行基因型的差异性 本研究发现,CTX-M TEM 型为山东莱西地区产 [2] ESBLs 大肠杆菌的流行基因型, 这与许颖等检出的 产 ESBLs 大肠杆菌主要基因型为 TEM 型相似, 也与杜 [3] 向党等关于 CTX-M 型检出率高的结果相一致, 显示 出中国确以 CTX-M TEM 型为主 而据有关资料, 美 国和韩国以 TEM 型和 SHV 型为主, 德国以 SHV-2 SHV-5 为主, 现欧洲各国产 ESBLs 的大肠杆菌基因型 从以 TEM SHV 型变为以 CTX-M 型为主 [4], 这些资料 也进一步揭示不同地区流行的基因型的确有所差异 对于本实验中未扩增出 4 种基因型但 ESBLs 表型检测 阳性的菌株是否存在其他型 ESBLs, 及其基因亚型情 况有待进一步研究 随着抗菌药物选择性压力不断增大, 以及兽医临 床上抗菌药物的不规范使用, 促进了携带 ESBLs 基因 质粒的转移, 致使 ESBLs 菌株检出率大大提高 因 此, 加强产酶耐药菌的监测和研究, 严格合理应用抗菌药物是防止产 ESBLs 大肠杆菌暴发流行的有效手段 参考文献 [] Bush K, Jacoby G A, Mederios A A. A functional classification scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure [J].Antimicrob Agents Chemother,995,39(6):2-233. [2] 倪语星. 质量介导的超广谱 β- 内酰胺酶的耐药性问题及检测 [J]. 中华医学检验,999,22(5):36-37. [3] 谭瑶, 赵清, 舒为群, 等.K-B 纸片扩散法药敏试验 [J]. 检验医学与临床,200,20(7):2290-229. [4] 孙亚伟, 付秀玲, 李胜利, 等. 纸片协同法检测 ESBLs 的实验条件探讨 [J]. 中国兽药杂志,2007,4():26-29. [5] 侯晓娜, 傅炜昕, 葛海英. 纸片协同试验检测产 ESBLs 方法的探讨 [J]. 中国实验诊断学,2005,9():80-82. [6] Jarlier V, Nicolas M H, Fournier G, et al. Extended broad spectrum β-lactamases conferring transferable resistance to newerβ-lactams against in Enterobacteriaceae:hospital prevahence and susceptibility patterns[j].rev Infect Dis,988,0:867. [7] Thomson K S, Sanders C C. Detection of extended-spectrumβ-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae. Compa rison of the double-isk and three-dimensional test[j].antimicrob Agents Chemother,992(36): 887. [8] 苑丽, 刘建华, 胡功政, 等.30 株鸡大肠杆菌 ESBLs 基因型检测鸡耐药性分析 [J]. 中国预防兽医学报,2009,3(6):438-442. [9] Sridhar R P N, Basavarajappa K G, Leela K G. Detection of extended spectrum beta-lactamase from clinical isolates in Davangere[J].Indian J Pathol Microbiol,2008,5(4):497-499. [0] 胡功政, 匡秀华, 苑丽, 等. 产 ESBLs 鸡肠杆菌科细菌对 2 种抗菌药的敏感性检测 [J]. 中国人兽共患病学报,2006,22(9):884-887. [] 付秀玲, 吴华, 陈红英, 等. 禽致病菌 ESBLs 和 AmpC 酶的检测及药敏分析 [J]. 华中农业大学学报,2007,26(2):27-222. [2] 许颖, 李晓庆, 江俊, 等. 产 ESBLs 大肠埃希菌耐药基因分型研究 [J]. 四川医学,2009,30(9):363-366. [3] 杜向党, 焦显芹, 莫娟, 等. 猪源大肠杆菌 CTX-M 型的分子检测 [J]. 华北农学报,2009,24(2):90-93. [4] Livermore D M, Canton R, Iadkowskim G N, et al. CTX-M: hanging the face of ESBLs in Europe[J].J Antimicrob Chemother, 2007,59(2):65-74.