Power qpcr PreMix(SYBR Green)User Manual 实时荧光定量试剂盒说明书 I. 试剂盒组成 产品组成 GK8020-200 20ul X 200 reactions GK8020-600 20ul X 600 reactions GK8020-1000 20ul X 1000 reactions 2 X Power qpcr PreMix (with SYBR Green I) 2X 1 ml 6X 1 ml 10X 1 ml 50 ROX Reference Dye 1 X 80 ul 3X 80 ul 5 X 80 ul II. 储存条件 收到试剂盒后, 请置于 -20 保存 本产品于 -20 条件下至少可稳定保存一年 使用时, 将 2 X Power qpcr PreMix(SYBR Green) 和 50 ROX Reference Dye 置于冰上溶解, 轻轻混匀并短暂离心后使用 为保证 使用效果, 试剂盒保存于 -20, 避免长期储存于 4 或室温下 III. 产品介绍与特点以 SYBR Green 荧光染料嵌合法为基础的 Power qpcr PreMix 可快速有效的进行实时荧光定量 试剂组份包含高保真热启动 DNA 聚合酶 优化的反应缓冲液和高质量 dntps, 即使用于低拷贝基因, 同样可以特异 灵敏的进行扩增 Power qpcr PreMix 提供了一种通用 qpcr 反应条件, 减少实验设计时间, 适用于几乎所有引物和大多数 qpcr 仪器类型 产品特点 1. 适用于 Real Time PCR 反应的 2 X PreMix, 预先混有 SYBR Green I, 反应体系经过优化,PCR 配制时, 只需加入模板 引物和灭菌蒸馏水, 操作方便 2. 2 X PreMix 中含有的高保真热启动 DNA 聚合酶为采用特殊修饰的金牌 Taq 酶, 能有效避免非特异性扩增及引物二聚体产生 3. 产品扩增效率高, 能在宽广的范围内进行精确定量 产品检测的灵敏度较高, 即使检测低拷贝基因也可以得到较好结果
IV. 实验前准备请注意 : 开始实验前请仔细阅读产品使用手册 在处理化学制品前, 请穿戴实验服 一次性手套和护目镜 为保证使用效果, 试剂盒保存于 20 C, 避免储存或放置于 4 C 或室温条件下 轻柔颠倒离心管数次以使试剂混合均匀, 避免产生泡沫, 短暂离心后备用 使用 PCR 级纯水配制 qpcr 反应混合液, 整个配制过程保持在冰上进行 按照实验流程进行操作, 避免核酸污染和非特异性扩增 V. 实验步骤 1. 将 2 X Power qpcr PreMix and 50 ROX Reference Dye 置于冰上融解, 融解后轻柔混匀, 短暂离心 ( 使管壁上的溶液聚集到管底部 ) 后置于冰上保存 2. 按照下表准备 PCR 反应液, 确保整个准备过程在冰上进行 反应液组份 体积 终浓度 2 X Power qpcr PreMix 10 µl 1 正向引物 (2 µm) 2 µl 0.2 µm 反向引物 (2 µm) 2 µl 0.2 µm 模板 2 µl 50 Rox Reference Dye 0.4 µl 1 双蒸水 3.6 µl Final volume 20 µl 注意事项 : 确保 2 X Power qpcr PreMix 体积占 qpcr 反应终体积的 50%, 并且相应调整其他组份用量 如需调整 qpcr 反应终体积, 务必保证每个组份所占比例 ( 维持每个组份的终浓度 ) 不变 引物浓度应保持 0.2 µm ~ 0.6 µm 范围 通常条件下,0.2 µm 浓度的引物即可得到较好结果 如果 PCR 扩增效率较低, 可以考虑提高引物浓度 但是引物浓度的提高同样有可能增加非特异性扩增产物以及过多引物二聚体的形成 通常情况下,DNA 模板的加入量应低于 100 ng 由于不同模板包含的靶基因拷贝数不同, 有必要对模板进行梯度稀释以决定 DNA 模板的最佳用量 如果使用逆转录的 cdna 作为模板, 务必在使用前对 cdna 进行稀释 cdna 原液的加入量不要超过 qpcr 反应终体积的 5% ROX Reference Dye 仅用于需要参比荧光染料校正的 qpcr 仪器 3. 彻底混匀 qpcr 反应液, 短暂离心 ( 使管壁上的反应液聚集到管底部 ) 4. 启动 qpcr 反应 ( 推荐按照下表中的 3 步法 qpcr 反应设置程序 )
循环数步骤温度时间检测 1 预变性 95 C 10 min 否 变性 95 C 10 sec 否 40 退火 55 C ~ 60 C 20 sec 否 延伸 72 C 至少 15 sec 是 注意事项 : 2 X Power qpcr PreMix 中使用的热启动 DNA 聚合酶经过特别的化学修饰,95 C 预变性 10 分钟能够充分激活这种聚合 酶的活性 实际退火温度需要根据引物解链温度进行调整, 一般在 55 C ~ 60 C 范围 但最佳退火温度可能超过这个范围, 请根据实 际反应条件调整退火温度 不同型号仪器的延伸时间略有不同, 请参照仪器使用说明书进行相应调整 应用荧光染料 SYBR Green 监测 qpcr 反应时, 在 qpcr 反应后必须进行融解曲线分析 请参照 qpcr 仪器使用说明书, 设置相应的融解曲线分析程序 ( 下表所列是 Bio-Rad iq5 qpcr 系统的熔解曲线分析程序 ) 温度范围加热速率持续时间检测 72 C ~ 95 C 0.5 C / time 10 sec / time 是 30 C 30 sec 否 VI. 实验案列 目的 : 以梯度稀释的质粒 DNA 为模板做 qpcr 反应标准曲线, 测试 2 X Power qpcr PreMix 的扩增效率和检测灵敏度 扩增靶序列长 110 bp 仪器 :iq5 instrument (Bio-Rad Laboratories) 步骤 : 1. 以 10 倍浓度差梯度稀释质粒 DNA 模板, 浓度从 10 5 ~ 1 个拷贝数 /µl 共 6 个梯度 2. 按照下表内容, 在冰上准备 qpcr 反应液 3. 彻底混匀 qpcr 反应液, 短暂离心 ( 使管壁上的反应液聚集到管底部 ) 反应液组份 体积 2 X Power qpcr PreMix 10 µl 正向引物 (2 µm) 2 µl 反向 (2 µm) 2 µ ddh 2O 1 µl 共计 15 µl
4. 向上述准备好的 qpcr 反应液中加入 5 µl 已稀释好的质粒 DNA 模板, 至反应液体积为 20 µl 另取 5 µl ddh 2 O 为模板做阴性对照 5. 按照下表设置 qpcr 反应程序和融解曲线分析程序, 启动反应 循环数步骤温度时间检测 1 预变性 95 C 10 min 否 变性 95 C 10 sec 否 45 退火 60 C 20 sec 否 延伸 72 C 15 sec 是 融解曲线分析 72 C~95 C 升温速率 0.5 C / 10 sec 是 冷却 25 C 30 sec 否 6. 反应结束后分析扩增曲线和融解曲线 梯度稀释质粒 DNA 模板的扩增曲线 扩增产物融解曲线的峰值 7. 利用连续扩增曲线的 Ct 值构建标准曲线 标准曲线图
8. 结论 : 实验结果显示可以检测到低至 5 个拷贝的质粒 DNA 模板, 所有反应仅存在单一扩展产物, 说明 2 X Power qpcr PreMix 试剂盒具有很高的检测灵敏度 同时, 梯度稀释的质粒 DNA 模板所得到的 Ct 值显 示出很好的线性关系, 说明该试剂盒具有很高的扩增效率 VII. 常见问题 引物在设计及纯度的质量对 qpcr 影响很大 : 引物长度一般在 18-30 个碱基 GC 含量在 40-60% 为最佳, 引物自身和引物之间避免形成 4 个以上的碱基配对, 以及形成发夹结构 qpcr 引物要求 引物的 Tm 值在 60 左右为最佳选择, 碱基分布较均匀,3` 端避免连续 GC 或是 AT 引物与模板之间的特异性, 是引物在设计质量方面的一个主要指标 特别是引物 3` 端要避 免与模板形成严重及过多的非特异性结合 引物合成时的纯化方式要求较高, 纯化要在 page 级别以上 避免在 PCR 之后有过多的引物残留, 体系中引物浓度一般在 0.2 um -1um 如果引物二聚 体还有残留, 可以在 0.05um-0.1um 尝试 荧光检测温度不正确, 进行相应调整 qpcr 反应精 确度差或者失败 PCR 循环条件 引物浓度 引物序列可能不适合 调整引物浓度和退火温度, 如果仍然不能正常工作, 重新设计引物 模板纯度不够, 需进行纯化 如果模板是逆转录的 cdna, 需使用稀释的 cdna 作为模板进行 qpcr 反应, 必要时可以做梯度稀释, 使用合适的模板浓度 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物 阴性对照出现扩增 如果阴性对照的熔解曲线 T m 值与阳性对照的熔解曲线 T m 一样, 可能存在阳性模板污染 首先排除加样错误, 如果情况还不能改善, 需要更换 PCR 反应用水和新的试剂 融解曲线异常 如果阴性对照熔解曲线 T m 值低于阳性对照的熔解曲线 T m, 可能是存在引物二聚体 可以尝 试提高退火温度, 降低引物体系中引物浓度 引物碱基结构方面, 如果较差, 应该重新设计 引物 同时, 操作应该在冰上准备 PCR 反应液, 或者提高荧光检测温度 阳性扩增中出现 2 个或多个融解曲线峰在没有其他引物存的情况下, 阳性对照存在双峰或多重峰意味着 PCR 反应产生非特异性扩增片段 在冰上准备 PCR 反应液, 优化反应条件, 例如提高 PCR 退火温度 降低引物浓度或提高荧光检测温度 ( 不要超过目的产物的 T m 值 ) 如果情况仍无改善, 请重新设计, 选择出质量较高的引物
检测是否有 PCR 扩增产物以排除仪器故障或程序设置错误 PCR 循环次数不够, 一般在 35 个循环以上, 可根据试验情况增加循环 ( 如 45cycles), 但 高于 45 个循环会增加过多的背景信号 无 Ct 值或 Ct 值过高 模板量不足, 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起 另外, 避免样品制备中 杂质的引入及反复冻融的情况 扩增效率太低或者 PCR 反应条件不够优化, 需重新设计引物或者优化反应条件, 比如, 检 测聚合酶的活性是否降低过多, 更换 PCR 成分