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1 园 艺 学 报 2013,40(2): Acta Horticulturae Sinica http: // www. ahs. ac. cn 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 * 马 宁 宁, 李 天 来 ( 沈 阳 农 业 大 学 园 艺 学 院, 辽 宁 省 设 施 园 艺 重 点 实 验 室, 沈 阳 ) 摘 要 : 利 用 PCR-DGGE 技 术, 研 究 了 裸 地 及 不 同 连 作 年 限 的 设 施 番 茄 栽 培 土 壤 中 细 菌 和 真 菌 的 群 落 结 构 及 多 样 性 的 变 化 情 况 结 果 表 明 : 设 施 条 件 下 种 植 番 茄 明 显 改 变 了 土 壤 土 著 细 菌 的 群 落 结 构, 但 连 作 年 限 对 土 壤 细 菌 多 样 性 影 响 较 小, 细 菌 群 落 结 构 变 化 不 大 ; 土 著 真 菌 的 群 落 结 构 稳 定 性 优 于 土 著 细 菌, 但 土 壤 真 菌 的 优 势 种 群 在 不 同 连 作 年 限 的 土 样 中 变 化 较 大, 连 作 显 著 降 低 了 某 些 真 菌 的 数 量, 同 时 显 著 增 加 了 另 一 些 真 菌 的 数 量, 其 中, 连 作 20 年 番 茄 的 土 壤 真 菌 新 出 现 的 优 势 种 群 最 多, 且 与 非 优 势 种 群 的 真 菌 数 量 差 异 较 大, 这 种 番 茄 连 作 后 改 变 土 壤 真 菌 种 群 平 衡 的 现 象 可 能 是 导 致 番 茄 产 生 连 作 障 碍 的 重 要 原 因 之 一 通 过 电 泳 条 带 的 回 收 测 序, 可 知 所 取 土 样 中 的 细 菌 优 势 种 群 属 于 Clostridium butyricum Uncultured bacterium Bacillus 和 Arthrobacter, 真 菌 优 势 种 群 属 于 Saccobolus dilutellus Uncultured fungus Lasiobolus ciliatus Spooneromyces laeticolor 和 Lasiobolidium orbiculoides 关 键 词 : 番 茄 ; 长 期 连 作 ; 土 壤 微 生 物 ;PCR-DGGE; 群 落 结 构 ; 多 样 性 中 图 分 类 号 :S 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : X(2013) Effect of Long-term Continuous Cropping of Protected Tomato on Soil Microbial Community Structure and Diversity MA Ning-ning and LI Tian-lai * (College of Horticulture,Shenyang Agricultural University,Liaoning Province Key Laboratory of Protected Horticulture, Shenyang ,China) Abstract:Community structure and diversity of microorganism in bare soil and continuous cropping protected tomato field were studied with PCR-DGGE technology. Results showed that soil indigenous bacterial community structure was significantly influenced by planting tomato under protected field,but soil bacterial community structure and diversity were not sensitive to continuous cropping years. Compared with soil indigenous bacteria,indigenous fungal community structure was more steady,but the dominant fungi were more different in the fields with different continuous cropping years,continuous cropping significantly decreased the number of some fungi,meanwhile,the number of some other fungi was significantly increased,most dominant fungi populations were enriched in soil with tomato continuous cropping years of 20,and which number was quite different with the non-dominant fungi populations. The 收 稿 日 期 : ; 修 回 日 期 : 基 金 项 目 : 十 二 五 国 家 科 技 支 撑 计 划 项 目 (2011BAD12B03); 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专 项 资 金 项 目 (CARS-25); 辽 宁 省 重 大 科 技 攻 关 项 目 ( ); 沈 阳 市 农 业 科 技 发 展 专 项 (F ) * 通 信 作 者 Author for correspondence( [email protected])

2 256 园 艺 学 报 40 卷 change of soil fungi population balance that caused by tomato continuous cropping maybe one of the important reasons for the tomato continuous cropping obstacle. Recycling and sequence analysis of prominent electrophoretic bands showed that the dominant bacteria of soil sample belong to Clostridium butyricum,uncultured bacterium,bacillus and Arthrobacter,while the dominant fungus belong to Saccobolus dilutellus,uncultured fungus,lasiobolus ciliatus,spooneromyces laeticolor and Lasiobolidium orbiculoides. Key words:tomato;long-term continuous cropping;soil microbial;pcr-dgge;community structure;diversity 番 茄 是 设 施 栽 培 中 重 要 蔬 菜 作 物 之 一, 通 常 连 作 较 为 普 遍, 从 而 导 致 土 壤 退 化, 产 量 和 品 质 下 降 ( 吴 凤 芝 等,1997) 土 壤 微 生 物 是 土 壤 生 态 系 统 中 最 重 要 和 最 活 跃 的 组 分, 它 控 制 着 土 壤 生 态 系 统 功 能 的 许 多 关 键 过 程, 在 促 进 土 壤 养 分 转 化 循 环 维 持 系 统 稳 定 性 以 及 可 持 续 利 用 中 占 主 导 地 位 ( 章 家 恩 和 廖 宗 文,2000;Schutter et al.,2001), 可 以 说 土 壤 微 生 物 的 变 化 是 产 生 作 物 连 作 障 碍 的 主 要 因 素 因 此, 研 究 设 施 作 物 连 作 土 壤 微 生 物 的 变 化 规 律, 对 于 进 一 步 研 究 解 决 作 物 连 作 障 碍 问 题 具 有 重 要 意 义 传 统 的 土 壤 微 生 物 研 究 主 要 采 用 分 离 培 养 法, 但 这 种 方 法 能 够 分 离 培 养 出 来 的 微 生 物 十 分 有 限, 大 量 微 生 物 不 能 分 离 培 养 出 来, 因 此, 影 响 研 究 结 果 的 正 确 性 近 年 来, 采 用 分 子 生 物 学 技 术 研 究 土 壤 微 生 物 的 报 道 越 来 越 多, 其 中 吴 凤 芝 和 王 学 征 (2007) 采 用 RAPD 技 术 研 究 黄 瓜 土 壤 微 生 物 群 落 物 种 多 样 性 Buchan 等 (2003) 采 用 T-RFLP 技 术 研 究 沼 泽 枯 草 腐 败 过 程 中 细 菌 和 真 菌 的 群 落 动 态 演 替 及 优 势 种 群, 宋 亚 娜 和 林 智 敏 (2010) 采 用 PCR-DGGE 技 术 研 究 水 稻 生 长 过 程 中 稻 田 土 壤 氨 氧 化 细 菌 和 氨 氧 化 古 菌 群 落 结 构 的 变 化 等 均 取 得 较 好 结 果 本 研 究 中 以 番 茄 不 同 连 作 年 限 土 壤 为 材 料, 采 用 PCR-DGGE 技 术, 分 析 土 壤 微 生 物 的 群 落 结 构, 旨 在 明 确 设 施 栽 培 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 的 演 替 规 律, 为 克 服 连 作 障 碍 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 土 壤 样 品 供 试 土 样 采 自 沈 阳 市 于 洪 区 马 三 家 镇 拉 马 台 村 种 植 番 茄 的 日 光 温 室, 该 村 早 在 20 世 纪 80 年 代 中 期 就 进 行 了 温 室 蔬 菜 栽 培, 番 茄 的 栽 培 生 产 历 史 长, 栽 培 模 式 和 管 理 措 施 较 为 规 范 统 一, 番 茄 一 年 两 茬, 每 茬 6 穗 果, 底 肥 为 粪 肥 复 合 肥 配 施, 冲 施 肥 追 肥, 无 大 规 模 病 害 发 生 2009 年 4 月 选 择 该 村 连 续 种 植 番 茄 和 20 年 的 日 光 温 室, 按 照 5 点 取 样 法 采 集 番 茄 冠 幅 内 0 ~ 20 cm 的 耕 层 土 壤, 同 时 以 温 室 附 近 未 种 植 任 何 作 物 的 露 地 0 ~ 20 cm 土 壤 为 对 照, 置 于 无 菌 袋 内 带 回 实 验 室, 过 2 mm 土 筛 后 于 80 保 存 备 用 1.2 研 究 方 法 土 壤 微 生 物 基 因 组 DNA 的 提 取 和 纯 化 土 壤 微 生 物 DNA 的 提 取 在 吴 敏 娜 等 (2007) 的 方 法 基 础 上 略 有 改 进 称 取 0.5g 土 样 及 0.5g 灭 菌 后 的 石 英 砂 于 核 酸 提 取 管 中, 加 入 850 μl 提 取 缓 冲 液 (100 mmol L -1 Tris-HCl,pH 8.0,100 mmol L -1 钠 EDTA,pH 8.0;100 mmol L -1 磷 酸 钠,pH 8.0;1.5 mol L -1 NaCl;1% CTAB), 涡 旋 振 荡 1 min 后 用 核 酸 提 取 仪 振 荡 30 s, 加 入 50 μl 溶 菌 酶 (100 mg ml -1 ) 50 μl 蜗 牛 酶 (120

3 2 期 马 宁 宁 等 : 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 257 mg ml -1 ) 和 50 μl 纤 维 素 酶 (120 mg ml -1 ),37 温 浴 振 荡 1 h; 加 入 100 μl 20% SDS, 混 匀 后 65 恒 温 处 理 30 min, 每 10 min 振 荡 1 次, r min -1 离 心 10 min; 取 上 清 液 加 入 0.2 倍 体 积 的 KAc(8 mol L -1 ), 冰 浴 20 min 后 r min -1 离 心 20 min; 取 上 清 液 加 入 0.5 倍 体 积 的 PEG (20%) 和 0.1 倍 体 积 的 NaCl(5 mol L -1 ), 混 匀, 室 温 放 置 1 h 后 r min -1 离 心 10 min; 弃 去 上 清 液, 沉 淀 物 用 500 μl 70% 的 预 冷 乙 醇 充 分 漂 洗, r min -1 离 心 10 min; 待 乙 醇 完 全 干 燥 后 加 入 700 μl TE 和 等 体 积 的 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 ( ), 充 分 混 合 后 r min -1 离 心 10 min; 取 水 相 再 加 入 等 体 积 的 氯 仿 / 异 戊 醇 (24..1) 抽 提 1 遍, r min -1 离 心 10 min; 取 水 相 上 清 液, 加 入 0.1 倍 体 积 的 NaAc(3 mol L -1 ) 和 0.6 倍 体 积 的 预 冷 异 丙 醇, 混 匀 后 室 温 放 置 1 h, r min -1 离 心 10 min; 弃 上 清 液, 沉 淀 物 用 500 μl 70% 的 预 冷 乙 醇 充 分 漂 洗 后 溶 于 50 μl TE 中, 得 到 DNA 粗 提 液 粗 提 DNA 样 品 用 博 大 泰 克 (BioDev) 的 B 型 小 量 DNA 片 段 快 速 纯 化 回 收 试 剂 盒 纯 化 后 20 保 存 用 0.8% 的 琼 脂 糖 凝 胶 检 测 DNA 的 完 整 性, 以 λ-hind Ⅲ digest( 购 自 TaKaRa) 作 为 Marker 样 品 DNA 的 PCR 扩 增 分 别 采 用 细 菌 通 用 引 物 341f-GC/U758(Phillips et al.,2008) 和 真 菌 通 用 引 物 403f/662r-GC(Diouf et al.,2006) 对 土 壤 微 生 物 总 DNA 进 行 PCR 扩 增, 引 物 具 体 信 息 如 表 1 所 示 细 菌 PCR 扩 增 反 应 条 件 是 94 预 变 性 4 min,94 变 性 1 min,55 退 火 1 min,72 延 伸 45 s, 每 个 循 环 加 1 s, 共 35 个 循 环, 之 后 72 延 伸 10 min 真 菌 PCR 扩 增 反 应 条 件 是 94 预 变 性 5 min,94 变 性 1 min, 50 退 火 40 s,72 延 伸 1 min, 共 35 个 循 环,72 延 伸 10 min 引 物 341f 和 662r 的 5 端 分 别 加 GC 夹 用 来 防 止 DNA 片 段 在 进 行 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 时 过 早 解 链 细 菌 和 真 菌 的 PCR 反 应 体 系 均 为 50 μl, 其 组 成 为 DNA 模 板 1 μl,10 PCR 反 应 缓 冲 液 5 μl,2.5 mmol L -1 dntp 混 合 液 4 μl, 20 pmol L -1 前 后 引 物 各 1 μl,5 U μl -1 Taq 酶 0.4 μl, 加 灭 菌 去 离 子 水 至 总 体 积 为 50 μl Table 1 表 1 PCR 扩 增 引 物 Primers used for PCR amplification 目 的 序 列 Target sequence 细 菌 16S V3-V4 Bacterial 16S V3-V4 引 物 Primer 341f-GC * 引 物 序 列 (5 3 ) Primer sequence(5 3 ) CCTACGGGAGGCAGCAG U758 CTACCAGGGTATCTA ATCC 真 菌 28S Fungal 28S 403f GTGAAATTGTTGAAAGGGAA r-GC * GACTCCTTGGTCCGTGTT * GC 夹 (GC clamp):5 -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3. 片 段 长 度 /bp Fragment size PCR 产 物 的 DGGE DGGE 采 用 D-Code system(bio-rad Laboratories Inc,Hercules,CA,USA), 细 菌 和 真 菌 分 别 采 用 6% 和 8% 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶, 变 性 梯 度 均 为 30% ~ 60%(100% 变 性 相 当 于 7 mol L -1 尿 素 和 40% 去 离 子 甲 酰 胺 ),PCR 产 物 上 样 量 为 40 μl, 在 1 TAE 缓 冲 液 中 (40 mmol L -1 Tris,20 mmol L -1 冰 乙 酸,1 mmol L -1 Na 2 -EDTA),60 恒 温,200 V 电 压 条 件 下 电 泳 5 h, 电 泳 后, 用 Genefinder 染 料 (1 TAE 稀 释 倍 ) 染 色 40 min, 然 后 利 用 Bio-Rad 凝 胶 成 像 系 统 拍 照 DGGE 图 谱 优 势 条 带 的 回 收 和 测 序 将 经 过 Genefinder 染 色 照 相 后 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 置 于 紫 外 灯 下, 用 灭 菌 的 手 术 刀 片 小 心 切 下 凝 胶 中 较 为 明 亮 清 晰 的 条 带, 用 无 菌 的 去 离 子 水 冲 洗 掉 残 留 的 染 色 剂 后 将 胶 条 完 全 浸 于 30 μl TE 中, 4 放 置 过 夜, 使 胶 条 中 的 DNA 片 段 溶 出 以 DNA 浸 出 液 为 模 板, 分 别 用 相 应 的 细 菌 带 夹 引 物 341f-GC/U758 和 真 菌 带 夹 引 物 403f/662r-GC 按 照 前 述 程 序 进 行 PCR 扩 增, 扩 增 产 物 再 用 DGGE 验 证 扩 增 片 段 与 所 回 收 条 带 的 电 泳 行 为 是 否 一 致, 确 定 回 收 条 带 的 正 确 位 置 后, 按 照 前 面 所 述 的 方 法

4 258 园 艺 学 报 40 卷 再 次 切 胶, 以 回 收 后 的 DNA 为 模 板, 用 不 带 夹 的 引 物 341f/U758 和 403f/662r 再 进 行 PCR 扩 增, 扩 增 产 物 送 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 (TaKaRa) 纯 化 测 序 1.3 数 据 处 理 使 用 图 像 分 析 软 件 Quantity One(4.3.1) 对 DGGE 图 谱 进 行 分 析, 电 泳 条 带 的 数 量 用 来 代 表 细 菌 和 真 菌 的 群 落 丰 富 度 (S); 利 用 DGGE 图 谱 的 数 字 化 结 果 分 别 计 算 土 壤 样 品 中 细 菌 和 真 菌 群 落 的 多 样 性 指 数 (H),Shannon-Wiener 多 样 性 指 数 H = (P i )ln(p i ), 其 中 P i = n i /N,n i 为 某 个 带 的 峰 强 度,N 为 该 带 所 在 泳 道 的 所 有 带 峰 强 度 之 和 ; 用 非 加 权 组 平 均 法 (UPGMA) 对 土 壤 样 品 进 行 聚 类 分 析, 形 成 聚 类 树 状 图 将 测 序 结 果 输 入 NCBI 数 据 库 通 过 BLAST 软 件 与 已 知 序 列 比 对, 获 取 同 源 性 较 高 的 相 关 基 因 序 列 2 结 果 与 分 析 2.1 土 壤 微 生 物 基 因 组 DNA 的 提 取 及 PCR 扩 增 结 果 由 图 1 可 见, 各 处 理 土 壤 样 品 中 所 提 取 出 的 DNA 片 段 大 小 相 近 且 均 约 为 23 kb, 条 带 纯 度 和 完 整 性 较 好, 可 以 作 为 模 板 用 于 PCR 扩 增, 各 处 理 条 带 亮 度 有 差 异 可 能 是 样 品 中 所 含 的 微 生 物 数 量 不 同 造 成 的 图 1 土 壤 微 生 物 DNA 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 谱 Fig. 1 Agarose gel(0.8%)electrophoresis of microbial DNA extracted from soil 通 过 浓 度 为 1.5% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 PCR 扩 增 结 果, 如 图 2 所 示, 各 处 理 的 细 菌 16S 和 真 菌 28S rdna 扩 增 条 带 的 纯 度 和 亮 度 都 比 较 好, 没 有 出 现 非 特 异 性 扩 增, 且 扩 增 产 物 与 目 的 片 段 长 度 相 近, 分 别 约 为 400 bp 和 260 bp,pcr 扩 增 效 果 良 好, 扩 增 产 物 可 以 进 行 DGGE 实 验 图 2 PCR 扩 增 产 物 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 谱 Fig. 2 Agarose gel(1.5%)electrophoresis of PCR amplification products

5 2 期 马 宁 宁 等 : 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 不 同 连 作 年 限 土 壤 细 菌 的 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 图 3 为 不 同 连 作 年 限 土 壤 细 菌 16S rdna 的 PCR-DGGE 图 谱 由 图 3 可 见, 各 连 作 泳 道 的 条 带 数 和 位 置 差 异 不 大, 个 别 条 带 在 亮 度 上 有 一 定 的 差 别,b l c 条 带 出 现 在 所 有 连 作 泳 道, 但 亮 度 不 尽 相 同, 其 所 代 表 的 细 菌 种 群 在 连 坐 初 期 (4 年 ) 数 量 较 多, 连 作 7 年 后 数 量 减 少, 随 着 连 作 年 限 的 增 加, 又 发 生 富 集, 在 连 作 10 年 和 15 年 的 土 壤 中 成 为 优 势 种 群, 但 随 着 连 作 进 一 步 继 续, 它 们 的 优 势 地 位 又 被 其 他 种 群 取 代 ; 个 别 连 作 泳 道 有 其 特 有 的 条 带, 如 连 作 4 年 泳 道 的 h 条 带 15 年 泳 道 的 a i 条 带 和 20 年 泳 道 的 j k 条 带, 这 些 条 带 所 代 表 的 细 菌 种 群 是 相 应 时 期 的 优 势 种 群, 对 照 泳 道 的 d e f g 条 带 在 各 连 作 年 限 泳 道 中 没 有 出 现 或 亮 度 大 大 减 弱, 这 说 明 设 施 番 茄 栽 培 改 变 了 原 土 壤 细 菌 的 群 落 结 构, 一 些 土 著 细 菌 优 势 种 群 消 失 或 数 量 减 少 整 个 DGGE 图 谱 有 35 个 带 型, 各 泳 道 条 带 数 为 22 ~ 27 条 不 等, 其 中 7 年 连 作 泳 道 的 条 带 数 最 多, 但 条 带 间 亮 度 差 异 不 大, 没 有 出 现 绝 对 优 势 种 群, 各 种 群 间 细 菌 数 量 较 平 均, 图 3 土 壤 细 菌 16S rdna 的 PCR-DGGE 图 谱 Fig. 3 Denaturing gradient gel electrophoresis of bacteria 对 照 泳 道 的 条 带 数 最 少 16S rdna PCR amplification products 利 用 DGGE 图 谱 的 数 字 化 结 果 计 算 各 处 理 土 壤 细 菌 的 多 样 性 指 数 如 表 2 所 示, 对 照 的 多 样 性 指 数 数 值 最 小, 细 菌 群 落 多 样 性 最 低 ; 随 着 番 茄 连 作 年 限 的 增 加, 土 壤 细 菌 多 样 性 指 数 略 有 增 大, 连 作 15 年 和 20 年 的 土 壤 细 菌 Shannon-Wiener 指 数 相 同 表 2 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 Table 2 Diversity of soil microorganism community 土 壤 细 菌 Soil bacteria 土 壤 真 菌 Soil fungal 连 作 年 限 丰 富 度 指 数 多 样 性 指 数 丰 富 度 指 数 多 样 性 指 数 Years of continuous cropping Richness index Shannon-Wiener index Richness index Shannon-Wiener index 0( 对 照 Control) 采 用 非 加 权 组 平 均 法 (UPGMA) 对 DGGE 图 谱 进 行 聚 类 分 析 形 成 树 状 图 ( 图 4) 从 图 4 中 可 以 明 显 看 出, 连 作 4 年 和 7 年 的 DGGE 指 纹 图 谱 最 为 相 似, 聚 为 一 类, 其 次 是 连 作 10 年 和 15 年 的, 相 似 性 为 55%, 聚 为 一 簇, 连 作 20 年 作 为 一 个 分 支, 与 4 年 7 年 分 支 的 相 似 性 (0.52) 高 于 与 10 年 15 年 分 支 的 相 似 性 (0.45), 对 照 单 独 成 为 一 个 分 支, 与 各 连 作 处 理 的 相 似 性 最 低, 仅 为 0.34 各 连 作 处 理 的 相 似 性 都 在 0.45 以 上

6 260 园 艺 学 报 40 卷 Fig. 4 图 4 土 壤 细 菌 16S rdna 的 UPGMA 聚 类 分 析 UPGMA cluster analysis of bacteria 16S rdna PCR amplification products 2.3 不 同 连 作 年 限 土 壤 真 菌 的 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 不 同 连 作 年 限 土 壤 真 菌 28S rdna 的 PCR-DGGE 图 谱 如 图 5 所 示 从 图 5 可 以 看 出, 与 细 菌 DGGE 图 谱 相 比, 真 菌 的 电 泳 图 谱 背 景 清 晰, 条 带 明 确, 各 泳 道 间 条 带 数 亮 度 差 异 较 大, 几 乎 每 个 泳 道 都 有 清 晰 可 辨 的 特 有 条 带 ( 如 g a h e i), 连 作 泳 道 间 共 有 条 带 的 亮 度 也 不 同 ( 如 b c f d) 随 着 连 作 年 限 的 增 加,a g h p 条 带 的 亮 度 减 弱 或 消 失,b c n f 条 带 的 亮 度 增 强, 连 作 20 年 的 土 壤 泳 道 出 现 了 新 的 高 亮 度 o 条 带, 条 带 亮 度 的 变 化 反 映 了 其 所 代 表 种 群 的 真 菌 数 量 的 变 化, 虽 然 20 年 连 作 土 壤 的 条 带 数 不 是 最 多 的, 但 有 最 多 的 高 亮 度 条 带, 与 4 年 连 作 土 壤 相 比,20 年 连 作 土 壤 新 增 了 高 亮 度 条 带 n 和 o, 且 条 带 b c k 的 亮 度 大 大 增 强, 而 条 带 d 亮 度 减 弱,g 条 带 消 失, 说 明 番 茄 经 过 长 期 连 作, 土 壤 中 某 些 种 类 的 真 菌 大 量 富 集, 其 他 种 类 真 菌 数 量 减 少 或 消 失, 这 可 能 是 番 茄 根 系 分 泌 物 的 作 用 结 果 与 土 壤 细 菌 不 同 的 是, 种 植 番 茄 并 没 有 明 显 改 变 土 壤 土 著 真 菌 的 群 落 结 构, 除 i 条 带 外, 其 他 条 带 (j k l m) 所 代 表 的 土 著 真 菌 的 优 势 种 群 没 有 因 为 番 茄 连 作 而 消 失, 但 条 带 亮 度 改 变 较 大, 真 菌 数 量 发 生 了 变 化 土 壤 样 品 中 真 菌 基 因 组 DNA 的 DGGE 图 谱 共 有 50 个 不 同 的 带 型, 每 个 处 理 含 有 21 ~ 39 图 5 土 壤 真 菌 28S rdna 的 PCR-DGGE 图 谱 Fig. 5 Denaturing gradient gel electrophoresis of fungal 28S rdna PCR amplification products

7 2 期 马 宁 宁 等 : 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 261 种 带 型 ( 表 2), 除 对 照 和 连 作 4 年 处 理 之 外, 所 有 处 理 条 带 数 都 大 于 30, 其 中 连 作 10 年 的 条 带 最 多, 有 39 条, 随 着 连 作 年 限 的 增 加, 土 壤 真 菌 的 丰 富 度 指 数 呈 先 上 升 后 下 降 的 变 化 趋 势, 与 细 菌 相 比, 不 同 连 作 年 限 土 壤 真 菌 多 样 性 指 数 有 较 大 差 异, 连 作 4 年 土 壤 真 菌 多 样 性 指 数 最 低 (2.55), 连 作 10 年 多 样 性 指 数 最 高 (3.28), 其 余 处 理 由 低 到 高 依 次 为 对 照 < 连 作 20 年 < 连 作 15 年 < 连 作 7 年 图 6 是 不 同 处 理 土 壤 真 菌 DGGE 结 果 的 聚 类 分 析 图 由 图 6 可 见, 各 处 理 的 DGGE 指 纹 图 谱 差 异 较 大, 相 似 性 较 低, 除 连 作 15 年 和 20 年 的 相 似 性 达 到 0.56 以 外, 其 他 处 理 的 相 似 性 均 低 于 0.5, 其 中 连 作 4 年 处 理 与 其 他 处 理 的 相 似 性 最 低, 仅 为 0.25, 连 作 7 年 和 10 年 的 处 理 相 似 性 为 0.43, 聚 成 一 类 ; 对 照 (0 年 ) 和 连 作 4 年 处 理 与 其 他 处 理 相 似 性 较 低, 分 别 形 成 分 支, 其 中, 对 照 (0 年 ) 与 15 年 20 年 分 支 相 似 性 是 0.39, 与 7 年 10 年 分 支 相 似 性 是 0.29 Fig. 6 图 6 土 壤 真 菌 28S rdna 的 UPGMA 聚 类 分 析 UPGMA cluster analysis of fungal 28S rdna PCR amplification products 2.4 不 同 连 作 年 限 土 壤 微 生 物 的 优 势 种 群 分 析 选 择 图 3 中 亮 度 较 高 且 比 较 清 晰 可 辨 的 条 带 进 行 切 胶 回 收, 经 PCR 后 测 序, 条 带 a ~ d 测 序 成 功 从 图 3 可 以 看 出, 除 了 7 年 连 作 土 壤 外, 其 他 连 作 处 理 都 有 条 带 a 和 c, 但 条 带 亮 度 有 差 异, 条 带 b 存 在 于 所 有 连 作 处 理, 代 表 一 种 番 茄 连 作 土 壤 中 的 细 菌 优 势 种 群, 条 带 d 只 出 现 在 对 照 中, 可 能 是 自 然 土 壤 中 细 菌 的 优 势 种 群 通 过 NCBI 查 找 比 对, 选 择 与 测 序 序 列 相 似 性 最 高 的 前 两 条 序 列 为 参 考 对 象, 如 表 3 所 示, 测 序 序 列 与 已 发 表 序 列 的 相 似 性 达 到 92% ~ 100%, 多 数 属 于 未 经 培 养 的 细 菌, 条 带 d 序 列 与 已 发 表 的 Arthrobacter sp. 和 Actinomyces sp. 序 列 相 似 性 最 高, 达 到 100% 对 土 壤 真 菌 DGGE 凝 胶 中 的 条 带 进 行 分 离 回 收,PCR 扩 增 后 测 序, 结 果 即 图 5 中 的 条 带 a ~ e 测 序 成 功, 条 带 a 是 连 作 7 年 处 理 特 有 的 条 带 ; 条 带 b 存 在 于 除 7 年 和 对 照 之 外 的 4 条 泳 道,15 年 20 年 处 理 的 亮 度 较 高 ;c 条 带 出 现 在 所 有 土 壤 样 品 中, 其 中 连 作 年 处 理 的 亮 度 最 高 ; 除 了 7 年 条 带 d 在 所 有 连 作 处 理 泳 道 中 的 亮 度 都 较 高, 且 并 未 出 现 在 对 照 泳 道 中 ;e 条 带 只 见 于 7 年 和 10 年 泳 道, 后 者 亮 度 明 显 高 于 前 者 将 所 有 测 得 序 列 与 NCBI 中 已 发 表 序 列 进 行 比 对, 得 到 与 本 试 验 条 件 下 土 壤 真 菌 优 势 种 群 序 列 同 源 性 较 高 的 真 菌 ( 表 3),LF-e 与 Lasiobolidium orbiculoides 序 列 相 似 性 为 100%, 可 能 是 同 属 真 菌, 其 余 测 序 序 列 与 已 发 表 序 列 相 似 性 为 87% ~ 97%

8 262 园 艺 学 报 40 卷 Table 3 表 3 土 壤 微 生 物 的 DGGE 回 收 条 带 序 列 分 析 Sequence analysis of bands excised from DGGE gel derived from soil microorganism 条 带 编 号 Band No. 序 列 同 源 性 较 高 的 微 生 物 Microorganism with the highest identity from NCBI 相 似 性 % Similarity LB-a Clostridium butyricum strain W5(DQ831124) 97 Uncultured organism clone ELU0147-T221-S-NIPCRAMgANa_000420(HQ800997) 97 LB-b Uncultured bacterium clone BFA_100(EF443777) 99 Uncultured bacterium clone SSD120_A12(JQ358480) 99 LB-c Uncultured Bacillus sp. clone OTU76(JQ217331) 92 Bacillus sp. LKC-YN001(JN854133) 92 LB-d Arthrobacter sp. TXc7-10(HQ333015) 100 Actinomyces sp. YACS-36(DQ649438) 100 LF-a Saccobolus dilutellus isolate AFTOL-ID 1299(FJ176870) 90 Uncultured soil fungus clone Fung.dry.ECATDBG02(GU376216) 89 LF-b Uncultured fungus clone gbfc_3b38_043(dq901003) 95 Pezizales sp. BC2(DQ317324) 87 LF-c Lasiobolus ciliatus voucher KS (DQ167411) 97 Lasiobolus cuniculi voucher C F-54526(DQ168338) 97 LF-d Spooneromyces laeticolor(dq220434) 93 Uncultured Ascomycota clone A9YE16RM1(FJ568096) 93 LF-e Lasiobolidium orbiculoides(dq062995) 100 Pseudombrophila merdaria(dq062992) 96 注 :LB-a ~ LB-d 对 应 图 3 中 条 带 a ~ d,lf-a ~ LF-e 对 应 图 5 中 条 带 a ~ e Note:LB-a LB-d correspond to the bands a ~ d in figure 3,LF-a LF-e correspond to the bands a e in figure 5. 3 讨 论 许 多 研 究 已 表 明 : 作 物 连 作 导 致 土 壤 微 生 物 群 落 改 变 是 产 生 作 物 连 作 障 碍 的 重 要 原 因 之 一 然 而, 以 往 研 究 土 壤 微 生 物 群 落 变 化 多 采 用 微 生 物 培 养 方 法, 这 种 方 法 受 培 养 条 件 影 响 较 大, 不 仅 可 培 养 出 的 微 生 物 有 限, 而 且 研 究 结 果 也 存 在 一 定 差 异 ( 孙 艳 艳 等,2010; 华 菊 玲 等,2012) 近 年 来, 采 用 分 子 生 物 学 方 法 进 行 作 物 连 作 土 壤 微 生 物 研 究 已 有 一 些 进 展 吴 凤 芝 和 王 学 征 (2007) 利 用 RAPD 技 术 研 究 了 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 对 土 壤 微 生 物 群 落 DNA 序 列 多 样 性 的 影 响, 结 果 发 现 连 作 7 年 的 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 指 数 丰 富 度 及 均 匀 度 指 数 均 小 于 连 作 2 年 的 李 坤 等 (2009) 采 用 PCR-DGGE 技 术 研 究 葡 萄 连 作 对 土 壤 细 菌 和 真 菌 种 群 结 构 及 多 样 性 的 影 响, 发 现 种 植 葡 萄 30 年 的 连 作 园 土 壤 细 菌 和 真 菌 的 多 样 性 都 大 于 种 植 葡 萄 3 年 的 新 植 园 土 壤 胡 元 森 等 (2007) 采 用 DGGE 技 术 研 究 黄 瓜 连 作 对 土 壤 微 生 物 区 系 的 影 响, 发 现 连 作 并 未 造 成 土 壤 菌 群 大 量 丢 失, 菌 群 构 成 仍 较 稳 定, 但 土 壤 部 分 种 群 的 数 量 发 生 了 明 显 变 化 本 研 究 中 采 用 DGGE 技 术 研 究 结 果 表 明, 设 施 番 茄 栽 培 土 壤 细 菌 丰 富 度 指 数 真 菌 丰 富 度 指 数 和 多 样 性 指 数 均 随 连 作 年 限 的 延 长 呈 先 上 升 后 下 降 的 变 化 趋 势, 但 连 作 20 年 番 茄 的 土 壤 细 菌 及 真 菌 丰 富 度 和 多 样 性 指 数 仍 大 于 连 作 4 年 的 土 壤 这 说 明 本 试 验 条 件 下, 番 茄 长 期 连 作 增 加 了 土 壤 细 菌 和 真 菌 的 丰 富 度 和 多 样 性, 这 与 吴 凤 芝 和 王 学 征 (2007) 用 RAPD 技 术 对 黄 瓜 连 作 土 壤 微 生 物 的 研 究 结 果 不 一 致, 结 合 胡 元 森 等 (2007) 采 用 DGGE 技 术 研 究 认 为 黄 瓜 连 作 土 壤 菌 群 构 成 较 为 稳 定, 未 出 现 丢 失 的 结 果, 认 为 本 研 究 与 吴 凤 芝 和 王 学 征 (2007) 的 研 究 结 果 不 一 致 的 原 因 可 能 与 RAPD 和 DGGE 两 种 分 子 生 物 学 技 术 有 关, 且 与 随 机 引 物 的 选 择 和 多 少 有 关, 当 然 作 物 的 不 同 以 及 土 壤 质 地 和 施 肥 等 均 会 影 响 结 果, 有 关 方 面 还 需 做 进 一 步 研 究 本 研 究 中, 尽 管 土 壤 细 菌 及 真 菌 的 丰 富 度 指 数 和 多 样 性 指 数 均 随 连 作 年 限 的 延 长 而 增 加, 但 土 壤 细 菌 种 群 数 量 差 异 不 大, 群 落 结 构 较 为 相 似, 只 是 优 势 种 群 的 种 类 和 数 量 略 有 不 同 ; 而 与 细 菌 相 比, 土 壤 真 菌 对 连 作 的 反 应 更 敏 感, 连 作 显 著 降 低 了 某 些 真 菌 的 数 量, 同 时 真 菌 DGGE 的 每 条 泳 道 均 有 独 立 且 亮 度 较 高 的 条 带, 这 说 明 每 个 不 同 连 作 年 限 的 土 壤 样 品 中 均 有 降 低 的 真 菌 种 群 和 升 高 的 真 菌 种 群, 其 中, 连 作 20 年 土 壤 的 真 菌 优 势 种 群 最 多, 且 与 非 优 势 种 群 的 真 菌 数 量 差 异 较 大, 某 些

9 2 期 马 宁 宁 等 : 设 施 番 茄 长 期 连 作 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 分 析 263 真 菌 数 量 大 幅 增 加, 富 集 现 象 明 显, 这 种 番 茄 连 作 后 改 变 土 壤 真 菌 优 势 种 群 平 衡 可 能 是 导 致 番 茄 产 生 连 作 障 碍 的 重 要 原 因 之 一 一 些 研 究 (Saïdou et al.,2006;wakelin et al.,2008; 张 海 燕 等,2010) 也 证 实 土 壤 细 菌 与 土 壤 类 型 密 切 相 关, 而 土 壤 真 菌 与 土 壤 管 理 密 切 相 关, 其 原 因 是, 细 菌 在 土 壤 中 数 量 最 多, 且 群 落 结 构 稳 定, 对 环 境 变 化 的 适 应 力 强 ; 而 真 菌 的 数 量 远 远 少 于 细 菌, 且 对 土 壤 环 境 变 化 敏 感 对 于 土 壤 土 著 微 生 物 来 说, 土 著 真 菌 的 群 落 结 构 稳 定 性 优 于 土 著 细 菌, 优 势 种 群 没 有 因 为 受 到 温 度 湿 度 人 为 耕 作 措 施 等 的 影 响 而 消 失 测 序 结 果 显 示,5 条 真 菌 DGGE 条 带 所 代 表 的 真 菌 种 群 都 属 于 子 囊 菌 纲, 其 中 a c e 都 属 于 盘 菌 目, 细 菌 DGGE 条 带 中 d 条 带 所 代 表 的 土 著 细 菌 优 势 种 群 是 放 线 菌 的 一 种, 而 a b c 所 代 表 的 连 作 土 壤 细 菌 优 势 种 群 分 别 属 于 酪 酸 梭 菌 未 经 培 养 的 细 菌 和 芽 孢 杆 菌, 这 些 微 生 物 在 土 壤 中 的 作 用 还 有 待 于 进 一 步 研 究 PCR-DGGE 技 术 在 研 究 自 然 界 微 生 物 群 落 的 遗 传 多 样 性 和 种 群 差 异 方 面 具 有 明 显 的 优 越 性, 自 从 Muyzer 等 (1993) 首 次 将 这 项 技 术 应 用 于 微 生 物 生 态 学 研 究 以 来, 已 有 越 来 越 多 的 人 将 其 作 为 主 要 的 分 子 工 具 之 一, 用 于 研 究 微 生 物 群 落 结 构 多 样 性 以 及 微 生 物 种 群 的 动 态 变 化 (Martina et al., 2004; 秦 华 等,2010; 顾 美 英 等,2012) 目 前 国 内 利 用 DGGE 技 术 研 究 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 及 多 样 性 方 面 多 偏 重 于 研 究 土 壤 细 菌, 而 对 于 土 壤 真 菌 的 研 究 少 见 报 道 本 研 究 的 结 果 表 明, 以 403f/662r-GC 为 引 物 用 于 土 壤 真 菌 的 DGGE 分 析, 得 到 的 电 泳 图 谱 背 景 明 确 条 带 清 晰 可 分 辨 条 带 数 量 较 多, 可 以 用 于 研 究 不 同 处 理 下 土 壤 真 菌 群 落 的 演 变 情 况 以 往 研 究 者 多 针 对 细 菌 16S rdna 的 V3 可 变 区 设 计 引 物 用 于 DGGE 实 验 (Cindy et al.,2000; 王 旭 熙 等,2012), 由 于 片 段 较 短, 一 些 相 近 的 细 菌 不 能 被 区 分 开 来, 致 使 细 菌 的 分 类 地 位 确 定 不 够 具 体 精 确 本 次 试 验 中 以 细 菌 16S rdna 的 V3 ~ V4 可 变 区 为 目 的 序 列 进 行 PCR 扩 增, 在 满 足 DGGE 实 验 条 件 的 前 提 下 增 大 了 片 段 长 度, 有 利 于 进 一 步 区 分 亲 缘 关 系 较 接 近 的 细 菌 种 群, 但 扩 增 片 段 的 增 大 也 带 来 了 一 些 问 题, 如 电 泳 条 带 增 多 导 致 条 带 间 分 离 不 完 全, 电 泳 图 谱 背 景 模 糊, 可 分 辨 条 带 数 减 少 等, 这 些 问 题 需 要 通 过 调 整 变 性 剂 浓 度 梯 度 电 压 及 电 泳 时 间 等 实 验 条 件 来 解 决 References Buchan A,Newell S Y,Butler M Dynamics of bacterial and fungal communities on decaying salt marsh grass. Appl Environ Microbiol,69 (1): Cindy H Nakatsu,Vigdis Torsvik,Lise Øvreås Soil community analysis using DGGE of 16S rdna polymerase chain reaction products. Soil Sci Soc Am J,64 (4): Diouf M,Miambi E,Mora P,Delgarde S,Rouland C The impact of termite sheetings age on their fungal communities. European Journal of Soil Biology,42 (1): Gu Mei-ying,Xu Wan-li,Mao Jun,Zhang Zhi-dong,Tang Guang-mu,Ge Chun-hui Microbial community diversity of rhizosphere soil in continuous cotton cropping system in Xinjiang. Acta Ecologica Sinica,32 (10): (in Chinese) 顾 美 英, 徐 万 里, 茆 军, 张 志 东, 唐 光 木, 葛 春 辉 新 疆 绿 洲 农 田 不 同 连 作 年 限 棉 花 根 际 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性. 生 态 学 报, 32 (10): Hu Yuan-sen,Wu Kun,Li Cui-xiang,Jia Xin-cheng Effect of continuous cropping of cucumber on soil microbial population Ⅱ variation analysis based on DGGE approach. Scientia Agricultura Sinica,40 (10): (in Chinese) 胡 元 森, 吴 坤, 李 翠 香, 贾 新 成 黄 瓜 连 作 对 土 壤 微 生 物 区 系 影 响 Ⅱ 基 于 DGGE 方 法 对 微 生 物 种 群 的 变 化 分 析. 中 国 农 业 科 学,40 (10): Hua Ju-ling,Liu Guang-rong,Huang Jin-song Effect of continuous cropping of sesame on rhizospheric microbial communities. Acta Ecologica Sinica,32 (9): (in Chinese) 华 菊 玲, 刘 光 荣, 黄 劲 松 连 作 对 芝 麻 根 际 土 壤 微 生 物 群 落 的 影 响. 生 态 学 报,32 (9): Li Kun,Guo Xiu-wu,Sun Ying-ni,Zhang Li-heng,Hu Xi-xi Effect of grape-replanting on soil bacterial and fungal populations. Chinese

10 264 园 艺 学 报 40 卷 Journal of Applied Ecology,20 (12): (in Chinese) 李 坤, 郭 修 武, 孙 英 妮, 张 立 恒, 胡 禧 熙 葡 萄 连 作 对 土 壤 细 菌 和 真 菌 种 群 的 影 响. 应 用 生 态 学 报,20 (12): Martina S Girvan,Juliet Bullimore,Andrew S Ball,Jules N Pretty,A Mark Osborn Responses of active bacterial and fungal communities in soils under winter wheat to different fertilizer and pesticide regimens. Appl Environ Microbiol,70 (5): Muyzer G,Wall E C D,Uitterlinden A G Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rdna. Appl Environ Microbiol,59 (3): Phillips L A,Germida J J,Farrell R.E,Greer C W Hydrocarbon degradation potential and activity of endophytic bacteria associated with prairie plants. Soil Biology and Biochemistry,40 (12): Qin Hua,Li Guo-dong,Ye Zheng-qian,Xu Qiu-fang,Cao Zhi-hong Evolvement of soil bacterial community in intensively managed Phyllostachys praecox stand and related affecting factors. Chinese Journal of Applied Ecology,21 (10): (in Chinese) 秦 华, 李 国 栋, 叶 正 钱, 徐 秋 芳, 曹 志 洪 集 约 种 植 雷 竹 林 土 壤 细 菌 群 落 结 构 的 演 变 及 其 影 响 因 素. 应 用 生 态 学 报,21 (10): Saïdou Nourou Sall,Dominique Masse,Ndèye Yacine Badiane Ndour,Jean-Luc Chotte Does cropping modify the decomposition function and the diversity of the soil microbial community of tropical fallow soil? Applied Soil Ecology,31 (3): Schutter M E,Sandeno J M,Dick R P Seasonal,soil type,alternative management influences on microbial communities of vegetable cropping systems. Biology Fertility Soils,34: Song Ya-na,Lin Zhi-min Changes in community structures of ammonia oxidizers and potential nitrification rates in red paddy soil at different growth stages of rice. Acta Pedologica Sinica,47 (5): (in Chinese) 宋 亚 娜, 林 智 敏 红 壤 稻 田 不 同 生 育 期 土 壤 氨 氧 化 微 生 物 群 落 结 构 和 硝 化 势 的 变 化. 土 壤 学 报,47 (5): Sun Yan-yan,Jiang Gui-ying,Liu Jian-guo,Zhang Wei,Tang Zhi-min Effects of continuous cropping tomato for processing on soil enzyme activities and microbial flora. Acta Ecologica Sinica,30 (13): (in Chinese) 孙 艳 艳, 蒋 桂 英, 刘 建 国, 张 伟, 唐 志 敏 加 工 番 茄 连 作 对 农 田 土 壤 酶 活 性 及 微 生 物 区 系 的 影 响. 生 态 学 报,30 (13): Wakelin S A,Macdonald L M,Rogers S L,Gregg A L,Bolger T P,Baldock J A Habitat selective factors influencing the structural composition and functional capacity of microbial communities in agricultural soils. Soil Biology & Biochemistry,40 (3): Wang Xu-xi,Wu Fu-zhong,Yang Wan-qin,Luo Yi,Wang Ao Effects of ginger cropping on bacterial diversity in purple soils in different cropping background. Acta Pedologica Sinica,49 (1): (in Chinese) 王 旭 熙, 吴 福 忠, 杨 万 勤, 罗 艺, 王 奥 不 同 种 植 模 式 背 景 下 栽 植 生 姜 对 紫 色 土 细 菌 多 样 性 的 影 响. 土 壤 学 报,49 (1): Wu Feng-zhi,Liu De,Wang Dong-kai,Luan Fei-shi,Wang Wei,Kong Xian-ming The effects of different years of continuous cropping on the vital-itg of root systems and their qualities in the plastic house tomatoes. Journal of Northeast Agricultural University,28 (1): (in Chinese) 吴 凤 芝, 刘 德, 王 东 凯, 栾 非 时, 王 伟, 孔 鲜 鸣 大 棚 番 茄 不 同 连 作 年 限 对 根 系 活 力 及 其 品 质 的 影 响. 东 北 农 业 大 学 学 报, 28 (1): Wu Feng-zhi,Wang Xue-zheng Effect of monocropping and rotation on soil microbial community diversity and cucumber yield,quality under protected cultivation. Scientia Agricultura Sinica,40 (10): (in Chinese) 吴 凤 芝, 王 学 征 设 施 黄 瓜 连 作 和 轮 作 中 土 壤 微 生 物 群 落 多 样 性 的 变 化 及 其 与 产 量 品 质 的 关 系. 中 国 农 业 科 学,40 (10): Wu Min-na,Zhang Hui-wen,Li Xin-yu,Su Zhen-cheng,Zhang Cheng-gang An extraction method of fungal DNA from soils in North China. Chinese Journal of Ecology,26 (4): (in Chinese) 吴 敏 娜, 张 惠 文, 李 新 宇, 苏 振 成, 张 成 刚 提 取 北 方 土 壤 真 菌 DNA 的 一 种 方 法. 生 态 学 杂 志,26 (4): Zhang Hai-yan,He Jiang-zhou,Xu Biao,Gong Ming-fu,Zhang Li-li Variety of soil microbial structure in continuous cropping cotton field in south Xinjiang. Microbiology China,37 (5): (in Chinese) 张 海 燕, 贺 江 舟, 徐 彪, 龚 明 福, 张 利 莉 新 疆 南 疆 不 同 连 作 年 限 棉 田 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 的 变 化. 微 生 物 学 通 报,37 (5): Zhang Jia-en,Liao Zong-wen Discussion on soil ecological fertility and its cultivation. Soil and Environmental Sciences,9 (3): (in Chinese) 章 家 恩, 廖 宗 文 论 土 壤 的 生 态 肥 力 及 其 培 育. 土 壤 与 环 境,9 (3):