3 : 75 [ 1-3 ] ) ; UV-2550 (, ) ; VITEK-2 (, ) ; PCR ( BIO-RAD ) ;, T25 ( IKA ) ; SHP-150, ( ) ; SA-900-1JZ [ 4] ( ) ; Sigma-3K30 BHT ( Sigma ) ; HWS2
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- 存恶 晏
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1 South China Fisheries Science Vol. 12, No. 3 Jun., 2016 doi: / j. issn , ,,,,,, ( 1.,, ; 2., ; 3., ) :, 29, 15, L4L11 L21 VITEK-2 16S rdna L4L11 L21 ( Pediococcus pentosaceus) ( Lactobacillus plantarum) ( L. casei) : ; ; ; ; : TS : A : ( 2016) Screening and identification of antioxidant starter culture strains from salted dried fish WANG Yueqi 1, 2, LI Laihao 1, CAI Qiuxing 3, WU Yanyan 1, WANG Xichang 2, YANG Xianqing 1, ZHAO Yongqiang 1 ( 1. Key Lab. of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture; South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou , China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai , China; 3. College of Food Engeneering, Qinzhou University, Qinzhou , China) Abstract: In order to screen lactic acid bacterias with excellent antioxidant activity, we conducted the preliminary screening based on the requirements of salt toleranced, high and low temperature resistance, high acid production and its tolerance for hydrogen peroxide. Then antioxidant activity of the strains was evaluated in vitro tests including anti-lipid peroxidation assay, hydroxyl radical assay and reducing powder evaluation experiment. A series of experiments show that 15 of selected strains of lactic acid bacterias complied with the requirements. And the antioxidant activity of seven strains was of significant difference. Moreover, L4, L11 and L21 strains demonstrated better capacity on antioxidant activity than the others. VITEK -2 automation microbe system and 16S rdna sequence analysis show that the three strains were Pediococcus pentosaceu, Lactobacillus plantarum and L. casei. Key words: salted dried fish; lactic acid bacteria; antioxidant activity; strain screening; fermentation, ( t) 8. 1%, 2013 ( t) 9. 9% t,, : ; : : ( , ) ; ( A C02 ) ; ( A201301C01) : ( ), ayueqiwang@ 163. com : ( ),,, laihaoli@ 163. com ( ),, cindyqqcai@ 163. com
2 3 : 75 [ 1-3 ] ) ; UV-2550 (, ) ; VITEK-2 (, ) ; PCR ( BIO-RAD ) ;, T25 ( IKA ) ; SHP-150, ( ) ; SA-900-1JZ [ 4] ( ) ; Sigma-3K30 BHT ( Sigma ) ; HWS24 ( ) ; PB-10 ph [ 5] ( Sartorius ) [ 6 ], , [ 10] [ 12], ( Lactic acid bacteria, LAB) ( H 2 S) H 2 O 2, FDA ( generally recognized as safe, [ 7] GRAS), [ 15], min r - 1 [ 8-9 ] 20 min, ;, ph 7. 4 PBS, r min min, 3, PBS , CFUmL - 1, ; 10 min, r 3, min min,, H 2 O 2, min r ml, 1 min, 2 29, L1 L29; MRS PCA MRS, h, [ ] ;, 3 DNA ( ) ; ( V C ) ( Sigma ) ; ( H 2 O 2 ) ( TCA) PBS Ac H 2O 2 ; Ap ( TBA) PBS ; A 0 H 2 O 2 ( FeSO 4 ) ( K 3 [ Fe ( CN) 6 ] ) [ 16] ( FeCl 3 ) 1. 2 Sunrise-basic TACAN ( TECAN 6% 8%, 20 min, PBS 2, PBS, CFU ml - 1, H 2 O % 0. 50% 0. 75%1. 00%PBS, PBS mg H 2 O 2 Ac - Ap ( % ) = - Ap 100 A 0 [ 17], : 1 ml 1 ml PBS ( ph 7. 4) 1 ml Fe- SO 4( 1% ), 0. 5 ml, 37
3 min, 0. 2 ml TCA( 4% ) 2 ml TBA ( 0. 8% ), 30 min min r min, Microsoft Excel nm A, 0. 5 ml SPSS Ac 2 ( mgml - 1 ) V C,, 2. 1 V C A ( % ) = ( 1 - Ac ) 100 A ; Ac 29, [ 18] [ 19] ( mgml - 1 ) V C, L1L4L7L8L11L13L15L17L18, L21L21L24L25 L27, 44. 8% ( 13 / V C 29), [ 20] 0. 5 ml PBS ( ph 7. 4) 0. 5 ml 0. 5 ml 1% min,, H 2 O 2 H 2 O ml TCA ( 10% ), min r 10 min, 1 ml H 2 O 2 1 ml 1 ml FeCl 3,, 10 min 700 nm H 2 O [ 12] 100% 13 H 2 O VITEK-2 ( 1) H 2 O % MRS 13 H 2 O 2, h, % % H 2 O % %, S rdna L25 H 2O 2, 7 H 2 O 2 MRS, 0. 75% 30%, DNA 16S rdna, ( 7F: 5 -GAGTTT- GATCCTGGCTCAG-3 ; 1525R: 5 -AGAA- AGGAGGTGATCCAGCC-3 ), 16S rdna H 2 O 2 PCR, PCR H 2 O 2 16S H 2 O 2, rdna NCBI BLAST, GenBank, Clustal X MEGA S rdna, H 2 SH 2O 2,, 1 8% NaCl ; H 2 S H 2 O 2, 2. 2 H 2 O % VITEK-2, L11 ( % ) H 2 O % % %, h, DNA L4L8L11L13L15L21 L25H 2 O %, 3 ( 0% ), H 2O 2 L %, H 2 O % 30% 7
4 3 : Tab. 1 Fermentation properties of 29 strains of lactic acid bacteria H 2 S H 2 O 2 6% 8% strain H 2 S production H 2 O 2 production gas production acid production fermentation properties mucus production nitrate reductase gelatin 6% salt resistance 8% salt resistance 10 resistance L L ND ND L3 - + ND ND ND ND ND ND ND ND ND L L ND ND ND ND ND ND ND ND L ND ND ND ND ND ND ND ND L L L9 + ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND L ND ND L L ND ND ND ND ND L L ND ND ND ND ND L L ND ND L L L ND ND ND ND ND ND ND ND ND L ND ND ND ND ND L L ND ND L ND ND ND ND ND L L L ND ND ND L L ND ND ND L ND ND ND ND ND : Note: ND ND means sample has not been detected. 45 resistance , [ ] ( MDA), MDA , 532 nm
5 78 12 Fig. 1 1 Resistance rate of lactic acid bacteria to hydrogen peroxide ( 2), L4 L CFUmL - 1, 5% 34% L11 ( ) %, V C ( ) mgml - 1, ( P < 0. 05) % 7%, L21, ( ) %,, OH O 2 - H 2 O 2 46%, mgml - 1 V C Fe 2+ + H 2 O 2Fe 3 + +OH + OH - Haber-Weiss O H 2O 2 O 2 + OH - [ 23 ] +OH 2% 13%, L4 ( ) %, Fenton 60%, mgml - 1 V C, Fenton 2 Tab. 2 Inhibitory rate of different lactic acid bacteria isolates on lipoperoxidation fermentation supernatant intact cell intracellular extract strain /% V C / mgml - 1 anti-lipid V peroxidation rate C /% V C / mgml - 1 anti-lipid V peroxidation rate C /% V C / mgml - 1 anti-lipid V peroxidation rate C : L b b ab ab a a L f d bc b e c d L a a ab ab b a L e cd bc ab d bc L d cd bc ab e c d L c bc a a c ab L g d c ab f d ( P < 0. 05) ; Note: Values with different letters at top right corner in the same column are significantly different ( P < ) ; the same case in the following tables.
6 3 : 79 ( P < 0. 05) L11, 8% 34%, ( P < 0. 05), L4 L11 30% ( 3) CFUmL - 1 L11 10% 45% 83 % L4 L4( ) %, L11, ( ) mgml - 1 V C, 3 Tab. 3 Scavenging of hydroxyl free radicals by different lactic acid bacteria isolates fermentation supernatant /% V strain C / mgml - 1 hydroxyl radical rate V C intact cell /% V C / mgml - 1 hydroxyl radical rate V C intracellular extract /% V C / mgml - 1 hydroxyl radical rate V C L a a a a b b L c b c c cd c d L b a a a a a L d bc bc bc ef de L e c d b bc de de L cd b b b c c L f d bc bc f e , 700 nm, [ 24] ( P < 0. 05),, ( 2) CFUmL - 1 L4 L nm 1. 3, 2, L21 ( ) L21 Fig. 2 Reducing power of different lactic acid bacteria isolates L4 L11, are significantly different ( P <0. 05). L %, L4 L nm, h 3 L4L11 L21 ( P < 0. 05) Values with different letters at top corner in the same group 24 h, 3
7 Fig h Growth curve of excellent antioxidant fermentation agent in 24 h L4L11 L21, 8 h 3 OD 650 ), 95% ; L11 16 h OD 650, 68%, Lactococcus lactis ssp. lactis, L21 2 2, OD 650 NA VITEK-2 VITEK-2,,,,, VITEK-2 L4L11 L21, L4 Pediococcus pentosaceus ( ), 93% ; L21 Lactobacillus paracasei ( ( 4), 16S rd- biochemical reaction Tab. 4 4 VITEK-2 Identification results by VITEKsystem L4 L11 L21 biochemical reaction L4 L11 L21 ( AMY) B ( POLYB) ( PIPLC) D- ( dgal) D- ( dxyl) D- ( drib) ( ADH 1) L- ( llatk) D- ( BGAL) ( LAC) ( AGLU) N- -D- ( NAG) ( APPA) D- ( dmal) ( CDEX) ( BACI) L-( AspA) ( NOVO) ( BGAR) % NaCl ( NC6. 5) ( AMAN) D- ( dman) ( PHOS) D- ( dmne) ( LeuA) B-D- ( MBdG) L- ( ProA) ( PUL) ( BGURr) D- ( draf) ( AGAL) O/129 ( O129R) ( PyrA) ( SAL) D- ( BGUR) ( SAC) ( AlaA) D- ( dtre) ( TyrA) ( 2ADH2s) D- ( dsor) ( OPTO) + + +
8 3 : 81 Fig. 4 4 PCR 16S rdna, Electrophoretogram of PCR-amplification of 16S rdna from antioxidant strains S rdna L4L11 L21, DNA, 16S rdna PCR ( 4), bp RAFFAELLA [ 25 ] PCR ( L. plantarum FP3), NCBI, L. plantarum ClustalX BLAST MEGA FP3 DPPH ( ( neighbor-joining) 2- ) % 16S rdna ( 5), %, ; L4 P. pentosaceus( KF ) 4 98%, L11 L. plantarum( DI ) 91%,, 7FM10 1RM3, 16S rrna, 2 [ 26 ],, L4 ; L11, L4 L11 L4 P. pentosaceus ( ), L11 L. plantarum( ) L21 L. casei( EU ) 92%, L21 L. casei 3, [ 9 ] 1 ( Leuconostoc mesenteroides), 6 5 L4L11L21 Fig. 5 Phylogenetic tree of antioxidant Lactobacillus strains L4, L11 and L21
9 82 12, 6 : L2L4 E mmol L - 1 H 2 O 2 [ 16 ] H 2 O 2, 3 [ J]. L4 L11 L21,,, [ 6] : 1) SOD NADH CAT, [ 27-28] ; 2), NADH / NADH [ 29 ] ; 3),, [ 30 ] 3, 223., 4 H 2 O H 2 O 2 ( 0. 75% ), 30%, [ J] L4L11 L21, VITEK-2 16S rdna L4 P. pentosaceus ( ) L11 L. plantarum( ) L21 L. casei( ) [ 1] ENG X, XIA W, JIANG Q, et al. Chemical and microbial properties of Chinese traditional low-salt fermented whole fish product Suan Yu[ J]. Food Control, 2013, 30( 2) : [ 2],. [ J]., 2015, 11( 1) : [ 3]., 2012, 36( 6 ) : [ 4] SAMPAIO G, SALDANHA T, SOARES R, et al. Effect of natural antioxidant combinations on lipid oxidation in cooked chicken meat during refrigerated storage [ J]. Food Chem, 2012, 135 ( 3 ) : [ 5 ] SANCHES-SILVA A, COSTA D, ALBUQUERQUE T G, et al. Trends in the use of natural antioxidants in active food packaging: review[ J]. Food Addit Contam A, 2014, 31 ( 3) : [ D]. :, 2013: [ 7] LI J, JIN M, MENG J, et al. Exopolysaccharide from Lactobacillus planterum LP6: antioxidation and the effect on oxidative stress [ J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 98( 1) : [ 8] CARVALHO B, VILA C, PINTO J, et al. Microbiological and chemical profile of sugar cane silage fermentation inoculated with wild strains of lactic acid bacteria[ J]. Anim Feed Sci Tech, 2014, 195 ( 9) : [ 9],. [ J]., ( 8 ) : , 364. [ 10],,. [ J]., 2014, 35 ( 10 ) : [ 11],. [ J]., 2014, 10( 5 ) : 1-7. [ 12]. [ M]. : 2006 : [ 13],,,. [ J]., 2014, 35( 3) : [ 14],. [ J]., 2005, 33( 9 ) : [ 15],. [ J]., 2007, 35( 2) : 4-7. [ 16],. 6, 2013, 29 ( 7 ) : , [ 17] TIIU K, EPP S, MARIKA M, et al. Antioxidative probiotic fermented goatsmilk decreases oxidative stress-mediated atherogenicity in human subjects. [ J]. Brit J Nutr, 2003, 90 ( 2 ) : [ 18] WANG Y, YU R, CHOU C. Antioxidative activities of soymilk fermented with lactic acid bacteria and bifidobacteria[ J]. a Food
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[ 2 ] ; ( Lactobacillus plantarum) ( Leuconostoc mesentcroides) ( L. pentosus) ( Pp) [ 3 ] ; [ ( Pseudosciaena crocea) ( Pediococcus ( Lactobac
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