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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (3): 灵芝多组分微乳一步制备方法的探索 1, 贺俊杰 2 1,, 陈彦 2*, 杜萌 2, 曹伟 1, 袁菱 1, 郑丽燕 2 (1. 江苏省中医药研究院, 国家中医药管理局中药释药系统重点研究室, 江苏南京 ; 2. 南京中医药大学附属中西医结合医院, 江苏南京 ) 关键词 : 灵芝 ; 多组分 ; 微乳 ; 制备 中图分类号 : R943 文献标识码 : A 文章编号 : (2013) Exploration of one-step preparation of Ganoderma lucidum multicomponent microemulsion HE Jun-jie 1, 2, CHEN Yan 1, 2*, DU Meng 2, CAO Wei 1, YUAN Ling 1, ZHENG Li-yan 2 (1. Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Meteria Medica, Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine, Nanjing , China; 2. Affiliated Hospital on Integration of Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing , China) Abstract: To explore one-step method for the preparation of Ganoderma lucidum multicomponent microemulsion, according to the dissolution characteristics of triterpenes and polysaccharides in Ganoderma lucidum, formulation of the microemulsion was optimized. The optimal blank microemulsion was used as a solvent to sonicate the Ganoderma lucidum powder to prepare the multicomponent microemulsion, besides, its physicochemical properties were compared with the microemulsion made by conventional method. The results showed that the multicomponent microemulsion was characterized as (43.32 ± 6.82) nm in size, ± in polydispersity index (PDI) and (3.98 ± 0.82) mv in zeta potential. The contents of Ganoderma lucidum triterpenes and polysaccharides were (5.95 ± 0.32) and (7.58 ± 0.44) mg ml 1, respectively. Sonicating Ganoderma lucidum powder by blank microemulsion could prepare the multicomponent microemulsion. Compared with the conventional method, this method is simple and low cost, which is suitable for industrial production. Key words: Ganoderma lucidum; multicomponent; microemulsion; preparation 灵芝为多孔菌科真菌赤芝 Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr.) Karst. 或紫芝 Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang 的干燥子实体 [1] 最早记载于汉代 神农 本草经, 具有滋补强壮 延年益寿 宁心安神 扶 正固本之功效 [2, 3] 现代研究表明灵芝具有较好的抗 肿瘤作用, 其中灵芝中含有的脂溶性三萜及水溶性 多糖是灵芝抗肿瘤的主要有效组分 [4 7] 本课题组在 前期研究中发现灵芝三萜溶解性较差, 而多糖为水 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 江苏省中医药领军人才项目 (LJ200913). * 通讯作者 Tel / Fax: , ychen202@yahoo.com.cn 溶性大分子物质, 二者在肠道内吸收均较差, 口服不利于其药效的发挥 微乳是一种由油相 水相 乳化剂及助乳化剂组成的特殊油水混合纳米系统, 具有可同时增溶不同溶解性能成分 增加难溶性成分溶解度 提高药物的生物利用度等优点 近年来, 微乳作为药物的载体被逐渐应用在中药领域, 研究制备了一批中药单体成分的微乳制剂, 如 : 水飞蓟素微乳 秋水仙碱微乳 去甲斑蝥素微乳 青藤碱微乳 苦参碱微乳和芍药苷微乳等 [8 13], 提高了药物的生物利用度 也有学者应用微乳作为溶剂对当归 丹参 厚朴及穿心莲等中药

2 442 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (3): 的脂溶性或脂溶性与水溶性有效成分进行提取 [14 17], 不仅可以提高有效成分的提取效率, 而且可以显著提高有效成分的生物活性和生物利用度 由于中药具有多成分 多靶点的特点, 因此单一成分微乳还不能全面体现中医药的治疗优势, 目前有关中药多组分微乳的研究较少 本课题组在前期研究中分别提取了灵芝三萜和多糖, 再负载于微乳体系中, 制备得到了灵芝糖萜复合微乳 [18], 促进了灵芝三萜和多糖的吸收, 体现了灵芝多靶点的治疗特色, 增强了灵芝的抗肿瘤疗效 本实验在此基础上进一步探索一种集提取 制备一体化的灵芝多组分微乳制备的方法, 即采用优选的空白微乳超声处理灵芝药材粉末制备灵芝多组分微乳, 使灵芝三萜与多糖同时溶出并形成微乳, 并从理化参数及质量上将一步制备法得到的多组分微乳与已有方法制备的多组分微乳进行比较, 为中药多组分微乳的制备提供一种简便易行的方法 材料与方法仪器 UV-2802 型紫外可见分光光度计 ( 上海尤尼克仪器有限公司 ); Nano-ZS 型马尔文粒径测定仪 ( 英国马尔文公司 ); Tecnai12 透射电镜 (Manufacturer Philips company, 荷兰 ); METLER TOLEDO 分析天平 (METLER TOLEDO 分析仪器有限公司 ); 85-2 型恒温磁力搅拌器 ( 上海司乐仪器厂 ); KQ-250DE 型超声波清洗仪 ( 昆山舒美超声仪器有限公司 ) 材料灵芝子实体, 购于盐城神农保健食品有限公司 ( 产地 : 江苏东台 ; 批号 : ), 经南京中医药大学吴德康教授鉴定为赤芝 Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr.) 的干燥子实体 ; 灵芝三萜 ( 自制, 由超临界萃取制得, 以熊果酸计纯度为 62%), 灵芝多糖 ( 自制, 由超临界萃取药渣水提醇沉制得, 以葡萄糖计为 46%); D- 无水葡萄糖 ( 纯度 99%, 中国食品药品检定研究院 ); 熊果酸 ( 纯度 98%, 南京泽朗医药科技有限公司 ); 辛酸癸酸三甘油酯 (Crodamol GTCC), 单油酸甘油酯 ( 英国 Croda 公司 ); 聚氧乙烯氢化蓖麻油 (Cremophor RH40) ( 德国 BASF 公司 ); 聚甘油油酸酯 (Plurol Oleique CC 497), 辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 (Labrasol), 辛 / 癸酸甘油三酯 (Labrafac lipophile WL1349), 油酸聚乙二醇甘油酯 (Labrafil M 1944CS) ( 法国 Gattefosse 公司 ); 油酸乙酯 ( 上海飞祥化工厂 ); 油酸, Tween 80, Tween 20 ( 成都市科龙化工试剂厂 ); OP-10 乳化剂 ( 上海久亿化学试剂有限公司 ); 肉豆 蔻酸异丙酯 (isopropyl myristate, IPM), 橄榄油, 聚 乙二醇 400 (PEG400), 1, 2- 丙二醇, 异丙醇, 无水乙 醇 ( 国药集团化学试剂有限公司 ); 其余试剂均为色 谱纯或分析纯 灵芝三萜在各介质中的溶解度实验 分别取各 种油相 乳化剂 助乳化剂 1 ml, 加入过量的灵芝 三萜, 在室温下磁力搅拌 24 h, r min 1 离心 15 min, 取上清液, 以对应空白介质为对照, 按以下 分光光度法测定灵芝三萜的含量 方法测定并计 算灵芝三萜在各介质中的溶解度 [19] 构建伪三元相图筛选最佳空白微乳处方 择乳化剂和助乳化剂的质量比 (K m 值 ) 分别为 , 按油相和混合乳化剂质量比为 的比例 精密称取各油相 乳化剂和助乳化剂, 混匀, 在室温 磁力搅拌下滴加水, 直至形成澄清透明的微乳 当外 观不再澄清时, 记录临界加水量 按油 水 混合乳 化剂在临界点的质量百分比, 在伪三元相图中绘制 曲线, 确定微乳区 灵芝多组分微乳的制备 一步制备法 选 称取过 50 目筛的灵芝粉末 10 g, 加 入优选的空白微乳 40 ml, 超声 60 min ( 功率 100 W, 频率 40 khz), 滤过, 挤净药渣中的微乳溶液, 得灵 芝一步制备多组分微乳 (one-step multicomponent microemulsion, OSMM) 34 ml, 用空白微乳定容至 40 ml 备用 常规制备法 精密称取灵芝三萜 374 mg ( 相当 于灵芝药材 10 g), 按最终空白微乳处方的比例依次 加入 Labrafid M 1944CS mg Cremophor RH mg 和 PEG mg, 在磁力搅拌器下搅拌 均匀, 得非水相 精密称取灵芝粗多糖 655 mg ( 相当 于灵芝药材 10 g, 由灵芝超临界萃取药渣水提醇沉制 得 ) 溶解于 22 ml 水中, 得水相 将水相用水滴定法 加入到非水相中, 即得常规方法制备的多组分微乳 (conventional method multicomponent microemulsion, CMMM) 约 30 ml OSMM 及 CMMM 的表征 平均粒径 zeta 电位及 PDI 采用马尔文激光散 射粒度测定仪, 在室温下测定灵芝多组分微乳的平 均粒径 PDI 及 zeta 电位 [20] 微乳外观形态观察 将载有 Formvar 支持膜 的铜网置于蜡板上, 在膜上滴加微乳液 1 滴, 自然晾

3 贺俊杰等 : 灵芝多组分微乳一步制备方法的探索 443 干 30 min, 再滴加 2% 磷钨酸 1 滴, 自然晾干 10 min, 用滤纸吸走多余的液体, 置于透射电子显微镜下观 察微乳的形态 稳定性考察 稀释对稳定性的影响 取 OSMM 及 CMMM 溶 液各 1.0 ml, 将其稀释 10 倍 100 倍, 观察两种微乳 的外观状态并测定平均粒径 高速离心对稳定性的影响 各取 1.0 ml OSMM 及 CMMM 溶液于 1.5 ml 离心管中, 以 r min 1 离心 30 min, 观察微乳溶液的澄明度及有无分层 放置时间对稳定性的影响 OSMM 及 CMMM 溶液在 4 和 40 的条件下保存 1 个月, 观察微乳 溶液有无分层 絮凝等现象 ph 对稳定性的影响 取 OSMM 及 CMMM 溶 液各 10 份, 分别调节 ph 为 和 8.0, 观察微乳外观状态的变化 并测定平均粒径 生理盐水对稳定性的影响 用生理盐水将 OSMM 和 CMMM 稀释 10 倍 100 倍, 观察微乳外 观状态的变化并测定粒径 [21] 分光光度法测定灵芝三萜的含量 精密称取 熊果酸对照品 2.0 mg 置于 10 ml 量瓶中, 加无水乙 醇适量使溶解, 定容, 摇匀, 即得 0.20 mg ml 1 熊果 酸对照品溶液 精密吸取熊果酸对照品溶液 和 0.8 ml, 分别置 10 ml 具塞 试管中 ( 同时吸取无水乙醇 0.8 ml 作为空白对照 ), 置沸水浴中挥干溶剂, 再依次分别加入新配制的 5% 香草醛 冰醋酸溶液 0.5 ml 高氯酸 0.8 ml, 密塞, 置 60 水浴中加热 15 min, 取出, 置冰水浴中冷却 5 min, 然后分别加冰醋酸 5 ml, 摇匀, 以无水乙醇 作为空白对照, 在 543 nm 处测定吸收度, 以熊果酸 对照品 (μg) 为横坐标 (X), 吸收度为纵坐标 (Y), 绘制标准曲线 取 OSMM 及 CMMM 供试品溶液各 600 μl, 以空白微乳溶剂进行对照, 测定吸收度, 计 算灵芝三萜的含量 [1] 分光光度法测定灵芝多糖的含量 精密称定 葡萄糖对照品 1.0 mg, 加入到 10 ml 量瓶中, 用水 定容至刻度, 制成 0.1 mg ml 1 的葡萄糖对照品溶液 分别精密量取对照品溶液 和 1.2 ml, 置 10 ml 具塞试管中, 加水至 2.0 ml, 精密 加入硫酸蒽酮溶液 6 ml ( 精密称取蒽酮 0.l g, 加 80% 硫酸溶液 l00 ml 溶解 ), 摇匀, 置水浴中加热 15 min, 取出, 放入冰浴中冷却 15 min, 以相应的试剂为空白, 在 625 nm 波长处测定吸收度, 以葡萄糖 (μg) 为横 坐标 (X), 吸收度为纵坐标 (Y), 绘制标准曲线 取 OSMM 及 CMMM 供试品溶液各 10 ml, 加入乙醇 100 ml 沉淀, 4 放置 12 h, 取出, 离心, 倾去上清 液, 沉淀加水溶解, 转移至 50 ml 量瓶中, 加水至刻 度, 摇匀, 测定吸收度, 计算灵芝多糖的含量 验证试验 取 500 g 灵芝粉末, 按一步制备法制 备灵芝多组分微乳并考察其理化性质及稳定性 结果 1 灵芝三萜在各介质中的溶解度实验 灵芝三萜在各介质中的溶解度见表 1, 结果显示 灵芝三萜在油相 Labrafil M 1944CS 乳化剂 Tween 20 中的溶解度最大, 因此选择 Labrafil M 1944CS 作为油相 虽然灵芝三萜在 Tween 20 中的溶解度最 大, 但实验中发现使用 Tween 20 难以与其他介质形 成微乳, 而与其溶解度接近的 Cremophor RH40, 与 其他介质易于形成微乳, 且形成微乳的范围较大, 因 而最终选择了 Cremophor RH40 作为乳化剂 此外, 灵芝三萜在助乳化剂乙醇中溶解度也较大, 但由于 PEG400 生物相容性较好, 且更易于形成微乳, 因此 选择 PEG400 作为助乳化剂 Table 1 Solubility of triterpenes in various media. n = 3, x ± s Group Media Solubility /mg ml 1 Oil phase Crodamol GTCC ± 2.57 Oleic acid ± 1.94 Ethyl oleate ± 1.86 IPM ± 3.31 Olive oil ± 2.24 Labrafac lipophile WL ± 3.94 Labrafil M 1944CS ± 1.27 Glyceryl monooleate ± 3.75 Plurol Oleique CC ± 1.27 Surfactant Cremophor RH ± 2.20 Labrasol ± 3.76 Tween ± 2.24 OP ± 2.03 Tween ± 1.16 Cosurfactant PEG ± 3.51 Ethanol ± 3.63 Isopropanol ± 3.13 Propylene glycol ± 构建伪三元相图筛选最佳空白微乳处方 构建的伪三元相图见图 1 从图中可以看出当 K m = 2 1 时, 微乳区域最大, 所以本实验选择乳化剂

4 444 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (3): Figure 1 Pseudo-ternary phase diagrams of microemulsion. a: Km = 1 1, b: Km = 2 1, c: Km = 3 1; Sm: Surfactant mixture; E: Emulsion; Gray region: Microemulsion; Gray slash region: Microemulsion gel 与助乳化剂的比例为 2 1 最终确定空白微乳处方: 乳与常规制备方法得到的微乳平均粒径均较小, 分 油相为 400 mg Labrafil M 1944CS, 乳化剂为 400 mg 布均匀, 且带负电荷, 有利于微乳的稳定 Cremophor RH40, 助乳化剂为 200 mg PEG 400, 在 透射电镜观察结果见图 3 从图中可以看出, 磁力搅拌下加水 3 g, 并以此空白微乳供制备灵芝多 OSMM 外观圆整, 分散均匀, 粒径较小, 与 CMMM 组分微乳用 相比没有明显差别 3 OSMM 及 CMMM 的表征 OSMM 及 CMMM 的平均粒径 PDI 及 zeta 电 位结果见图 2 和表 2 结果表明, 一步制备得到的微 Table 2 The mean droplet size, polydispersity index (PDI) and the zeta potential of one-step multicomponent microemulsion (OSMM) and conventional method multicomponent microemulsion (CMMM). n = 3, x ± s Sample Figure 2 Mean droplet size distribution of OSMM and CMMM Mean droplet size /nm PDI Zeta potential /mv OSMM ± ± (3.98 ± 0.82) CMMM ± ± (5.06 ± 1.34) Figure 3 CMMM Transmission electron microscopies of OSMM and

5 贺俊杰等 : 灵芝多组分微乳一步制备方法的探索 OSMM 及 CMMM 的稳定性考察本研究对 OSMM 及 CMMM 的稳定性进行了较全面的考察, 结果见图 4 和表 3 结果表明, 稀释使微乳平均粒径小幅度减小, 可能是因为稀释减少了微乳粒子的聚集 在考察范围内 ph 对微乳的粒径无明显影响, 且未见絮凝 分层现象, 微乳各项指标仍保持稳定 Figure 4 Influence of microemulsion mean droplet size by ph (n = 3, x ± s) 5 微乳中各指标成分含量的测定分光光度法测定灵芝三萜的线性方程为 Y = X , r = , 结果表明熊果酸在 40.0~160.0 μg 内呈现良好的线性关系 分光光度法测定灵芝多糖的线性方程为 Y = X , r = , 结果表明葡萄糖在 20~120 μg 内呈现良好的线性关系 微乳中各指标成分含量的测定结果见表 4 从表中可见, 由 10 g 药材通过两种不同方法所制得的微乳样品中, OSMM 中所含灵芝三萜及灵芝多糖的总量均略大于 CMMM 6 验证试验验证试验中测定了一步制备法的平均粒径为 (48.56 ± 8.34) nm PDI 为 ± zeta 电位为 (4.35 ± 0.60) mv 一步制备法所得的灵芝多组分微 乳在稀释 高速离心 长时间放置 不同 ph 及生理盐水环境等条件下稳定性良好 灵芝三萜与灵芝多糖的含量分别为 (6.14 ± 0.48) mg ml 1 和 (7.75 ± 0.61) mg ml 1, 总量为 (12.28 ± 0.98) g 和 (15.50 ± 1.22) g, 此结果与上述实验结果一致, 表明灵芝多组分微乳一步制备法具有可行性 讨论在前期实验研究中, 作者分别比较了微乳回流 微乳温浸和微乳超声 3 种条件下所形成的微乳及其对多糖和三萜含量的影响, 结果发现微乳温浸和微乳超声的提取效率较高 此外, 研究发现通过微乳超声的方法对微乳体系的平均粒径及分布等影响较小, 更能使微乳体系保持完整性 常规微乳的制备方法是将预先提取所得的有效成分或组分负载于微乳各相中, 而本实验研究了一种用空白微乳超声处理灵芝药材粉末直接制备多组分微乳的方法 该方法将提取和制备过程一步完成, 制备工艺简单, 且不使用有机溶剂, 而灵芝三萜与多糖均能很好地溶出, 降低了制备成本, 为寻求一种效率高且经济实用的灵芝多组分微乳制备方法提供了实验依据 通过与常规方法制备的微乳比较, 一步制备法制备的灵芝多组分微乳粒径小, 达到纳米级, 有利于有效组分在胃肠道的吸收 制剂的稳定性考察表明, 在不同条件下, 如稀释 高速离心 长时间放置 不同 ph 及生理盐水环境下, 一步制备法制备的微乳与常规微乳均较稳定, 说明一步制备法可以保证微乳在保存 运输及口服后在人体内的稳定性 此外, 一步制备法所制备的微乳含有的灵芝三萜与灵芝多糖总量均大于常规方法所制备的微乳, 而载药量与常规方法所制备的微乳相比略低, 今后可尝试通过挥发部分水分以进一步提高灵芝多组分微乳的载药量 Table 3 Influence of microemulsion mean droplet size by dilution. n = 3, x ± s Sample Original sample Diluted 10-fold by water Diluted 100-fold by water Diluted 10-fold by saline Diluted 100-fold by saline OSMM ± ± ± ± ± 3.55 CMMM ± ± ± ± ± 0.98 Table 4 Content of effective components in OSMM and CMMM ( n = 3, x ± s). Equivalent to 10 g herbs Sample Microemulsion volume /ml Total content of triterpene /mg Concentration of triterpene /mg ml 1 Total content of polysaccharide /mg Concentration of polysaccharide /mg ml 1 OSMM ± ± ± ± 0.44 CMMM ± ± ± ± 0.27

6 446 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (3): References [1] State Pharmacopoeia Commission of the People s Republic of China. Pharmacopoeia of the People s Republic of China ( 中华人民共和国药典 ) [S]. Vol 1. Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2010: 174. [2] Lakshmi B, Ajith TA, Jose N, et al. Antimutagenic activity of methanolic extract of Ganoderma lucidum and its effect on hepatic damage caused by benzo [α] pyrene [J]. J Ethnopharmacol, 2006, 107: [3] Lin L, Fang NH, Wu D. Research overview of Ganoderma lucidum active ingredients [J]. Chin Tradit Pat Med ( 中成药 ), 2002, 24: 793. [4] Li Y, Zhu ZM, Yao WX, et al. Study progress on triterpenoids from Ganoderma lucidum [J]. China J Chin Mater Med ( 中 国中药杂志 ), 2012, 37: [5] Li XB, Zhao HY, Guo D, et al. Pharmacology research of Ganoderma lucidum polysaccharides [J]. Chin Tradit Pat Med ( 中成药 ), 2012, 34: [6] Li P, Wei XX, Xu JH. Experimental study on anti-tumor effects of extracts from Ganoderma lucidum [J]. Chin J Mod Appl Pharm ( 中国现代应用药学 ), 2011, 28: [7] Ma L, Wu F, Chen RY. Analysis of triterpene constituents from Ganoderma lucidum [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2003, 38: [8] Yuan Q, Li QR, Wang HJ, et al. The absorption kinetics of silymarin microemulsion in rat intestine [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2004, 39: [9] Liu X, Zhang ZH, Du M, et al. Studies on preparation of colchicine microemulsion and its transdermal absorption [J]. Chin Tradit Herb Drugs ( 中草药 ), 2011, 42: [10] Zhang L, Xiang D, Hong Z, et al. Studies on the liver targeting of norcantharindin microemulsion [J]. Acta Pharm Sin ( 药学 学报 ), 2004, 39: [11] Li X, Liu YT, Wu SM, et al. Transdermal delivery character of sinomenine microemulsion [J]. Chin Tradit Pat Med ( 中成 药 ), 2008, 30: [12] Wei H, Zhang Z, Niu XF. Pharmacokinetics and distribution of microemulsion system for transdermal delivery of matrine in mouse [J]. Chin Pharm J ( 中国药学杂志 ), 2010, 45: [13] Nie XX, Jiang L, Wei W, et al. In vitro permeability of paeoniflorin microemulsion [J]. Chin J New Drugs ( 中国新药杂志 ), 2009, 18: [14] Gao J, Yi H, Yang H, et al. Extraction of Angelica sinensis by using O/W microemulsion [J]. Chin J New Drugs ( 中国新药杂志 ), 2011, 20: [15] Yang H, Deng M, Yi H. Experiment of extracting Salviae miltiorrhizae on using O/W microemulsion [J]. China J Chin Mater Med ( 中国中药杂志 ), 2008, 33: [16] Yi H, Sun LY, Gao J, et al. Extracting Magnolia officinalis by using O/W microemulsion [J]. Chin J Exp Tradit Med Formulae ( 中国实验方剂学杂志 ), 2011, 17: 1 5. [17] Song Q, Du H, Feng QJ, et al. Primary experimental research on the microemulsion-extraction technology from Chinese herb medicine [J]. World J Integr Tradit West Med ( 世界中西医结合杂志 ), 2007, 2: [18] Chen Y, Lu H, Song SH, et al. Preparation of Ganoderma lucidum polysaccharides and triterpenes microemulsion and its anticancer effect in mice with transplant Heps tumors [J]. China J Chin Mater Med ( 中国中药杂志 ), 2010, 35: [19] Ja XB, Song SH, Chen Y. Comparison of supercritical CO 2 extraction and alcohol refluxing method to extract Ganoderma lucidum triterpenes [J]. Chin Tradit Pat Med ( 中成药 ), 2010, 32: [20] Xiao YY, Liu F, Chen ZP, et al. Water in oil microemulsions containing NaCl for transdermal delivery of fluorouracil [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2011, 46: [21] Li GL, Fan YT, Zhang YH, et al. In vitro and in vivo evaluation of total flavones of hippophae rhamnoides self- microemulsifying drug delivery system [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2012, 47: