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娟龙卞
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1 植物乳杆菌降胆固醇 Lp10 菌株的 rhad 基因敲除株的构建 1 1 郭天芬, 林俊芳, 郭丽琼, 叶志伟, 魏韬, 许之恒 (1. 华南农业大学食品学院生物工程系, 食品生物技术研究所, 广东广州 ) (2. 广东省微生态制剂工程技术研究中心, 广东广州 ) 摘要 : 以转录组数据为依据推测植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 中 rhad 基因参与胞外多糖 (exopolysaccharide,eps) 合成代谢中的鼠李糖代谢过程, 从而通过调节胞外多糖合成并利用其吸附作用达到降胆固醇效果为了进一步验证 rhad 基因的功能, 本论文研究利用同源重组技术, 构建 rhad 基因敲除载体, 采用电击转化方法将构建的敲除载体导入植物乳杆菌 Lp10 菌株感受态细胞, 并在抗性平板上筛选转化子, 以转化子的基因组 DNA 为模板进行 PCR 及测序鉴定, 再利用邻苯二甲醛法测定突变株与初始菌株的降胆固醇能力结果表明, 敲除载体 pnz5319-rhad 被成功构建, 测序结果显示 rhad 基因被成功敲除 ; 敲除菌株的降胆固醇能力略有上升本论文研究结果不仅为植物乳杆菌基因敲除载体的构建提供了实验技术支持, 同时为植物乳杆菌降胆固醇相关功能基因的验证分析奠定了理论依据关键词 : 植物乳杆菌 ;rhad 基因 ; 同源重组 ; 基因敲除文章篇号 : (2018) DOI: /j.mfst Construction of an rahd Gene Konckout Mutant of Cholesterol-lowering Lactobacillus plantarum Lp10 GUO Tian-Fen 1, LIN Jun-Fang, GUO Li-Qiong, YE Zhi-Wei, WEI Tao, XU Zhi-Heng 1 (1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou , China) (2. Research Center for Micro-Ecological Agent Engineering and Technology of Guangdong Province, Guangzhou , China) Abstract: Based on the analysis of transcriptome data, it was speculated that rhad gene in Lactobacillus plantarum was involved in metabolism of rhamnose metabolism responsible for the biosynthesis of exopolysaccharide (EPS). As a result, the cholesterol-lowering effect of L. plantarum is realized by the adsorption of EPS whose biosynthesis was regulated by the expression of rhad gene. In order to verify the function of rhad gene, rhad gene knockout vector of L. plantarum Lp10 was constructed by homologous recombination technology, the knockout vector pnz5319-rhad was transformed into L. plantarum Lp10 competent cells by the method of electroporation. Resistance plate was used to screen the transformants followed by the performances of PCR identification and DNA sequencing using the genome DNA as template. Results showed that the knockout vector pnz5319-rhad was constructed successfully, and the DNA sequencing results indicated that rhad gene was successfully knocked out, and the cholesterol lowering ability of knockout strain increased slightly. This research not only provides technical support for the construction of L. plantarum gene knockout vectors, but also lays the theoretical foundation for the subsequent functional verification of genes related to the cholesterol-lowering effects of L. plantarum. Key words: Lactobacillus plantarum; rhad gene; homologous recombination; gene knockout 血清中高浓度的胆固醇是诱发高血压冠心病收稿日期 : 项目基金 : 广东省自然科学基金博士启动项目 (2015A ); 广东省自然科学基金项目 (2015A ) 作者简介 : 郭天芬 (1993-), 女, 硕士研究生, 研究方向 : 微生物学通讯作者 : 郭丽琼 (1963-), 女, 博士, 教授, 研究方向 : 天然产物与微生物工程 ; 叶志伟 (1984-), 男, 博士, 助理研究员, 研究方向 : 天然产物与微生物工程等众多心血管疾病的重要因素 [1], 控制血清胆固醇水平已经受到越来越广泛的关注传统药物治疗存在药费昂贵, 毒副作用较大治疗效果不明显等缺陷 [2] [3] Mathara 等从传统发酵乳中分离出了 23 株乳酸菌, 分析显示部分乳杆菌具有降胆固醇的能力益生菌对降胆固醇的治疗效果明显, 对高血脂的防治有积极作用, 并有望替代药物治疗法成为了更安全更有效的降胆固醇方法 [4,5] 28

2 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 是具有降胆固醇 [6] 改善免疫功能 [7], 维持肠道菌群平衡 [8], 抑 [9] 制肿瘤细胞的形成等益生功能的革兰氏阳性细菌目前, 植物乳杆菌降胆固醇的作用机理主要有以下几种观点 :(1) 细胞直接吸收胆固醇 ;(2) 胆盐水解酶 (bile salt hydrolase,bsh) 作用 ;(3) 胞外多糖 (exopolysaccharide,eps) 的吸附作用 ;(4) 鉴于植物乳杆菌降低胆固醇效果受多种因素的影响, 还存在一些其他理论 [10] 植物乳杆菌的次级代谢产物 EPS 种类繁多, 其组分包括果糖葡萄糖甘露糖半乳糖和鼠李糖等 L- 鼠李树胶糖 -1- 磷酸醛缩酶 (L-rhamnulose-1-phosphate aldolase,rhad) 按照供体专一性进行分类, 属于磷酸二羟基丙酮 (DHAP) 依赖性醛缩酶, 在植物乳杆菌中参与 L- 鼠李糖的代谢首先,L- 鼠李糖在 L- 鼠李糖异构酶的催化下生成 L- 鼠李树胶糖, 然后经过 L- 鼠李树胶糖激酶的作用生成 L- 鼠李树胶糖 -1- 磷酸, 最后经 RhaD 裂解为 L- 乳醛和磷酸甘油酮, 进入糖酵解循环 [11,12] 研究组前期的转录组分析结果表明, 在植物乳杆菌 Lp10 菌株降胆固醇过程中 rhad 基因表现为转录水平下调, 推测植物乳杆菌在添加胆固醇环境下主要是通过产生 EPS 对胆固醇进行吸附, 而此过程中植物乳杆菌为提高 EPS 的合成量以下调 rhad 基因的表达量来抑制了 L- 鼠李糖的代谢为了深入分析 rhad 基因与植物乳杆菌 Lp10 菌株降胆固醇功能的关系, 本研究利用同源重组原理敲除 rhad 基因, 并比较初始菌株与突变菌株的降胆固醇能力同源重组技术在乳酸菌中已经应用广泛, [13] 例如李娅妮等在 puc18 敲除载体的基础上成功构建了基因敲除载体 puc18 lai 并实现对植物乳杆菌的亚油酸异构酶 (Linoleic isomerase,lai) 基因的敲除 ; 岳 [14] 云春等利用同源重组法构建质粒 pklkrt, 并电转化于副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei) 感受态细胞, 成功构建组氨酸蛋白激酶基因缺失突变株植物乳杆菌 Lp10 菌株是本研究组前期从海带中分离出来的一株具有高降胆固醇能力的乳酸菌 [15] 本实验选用 pnz5319 作为敲除质粒, 构建 rhad 基因敲除载体, 试图摸索出一套完整的植物乳杆菌基因敲除载体的构建及转化体系, 为植物乳杆菌降胆固醇机制及其功能基因的分析研究奠定实验基础 1 材料与方法 1.1 材料菌株与质粒植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)lp10 菌株由本研究组从海带中分离纯化并保存 ; 大肠杆菌 (Escherichia coli)dh5α 购买于大连 TaKaRa 公司 ; 质粒 pnz5319 由南开大学乔明强教授惠赠主要试剂和培养基细菌基因组 DNA 提取试剂盒购买于 TIANGEN 公司 ; 琼脂糖凝胶 DNA 纯化回收试剂盒质粒小提试剂盒购买于 MAGEN 公司 ;Ex Taq 酶购买于大连 Takara 公司 ; 限制性内切酶 XhoI Pme I Sac I Bgl II 购买于 Thermo Fisher Scientific 公司 ; 氯霉素 (chloramphenicol,cm) 购于 Solarbio 公司 ; 其余试剂均为分析纯 MRS 培养基 (1 L): 蛋白胨 10 g 葡萄糖 20 g 牛肉膏 10 g 酵母粉 5 g 磷酸氢二钾 2 g 乙酸钠 5 g 柠檬酸氢二铵 2 g 吐温 ml 硫酸镁 0.58 g 硫酸锰 0.25 g ph 6.8 琼脂 20 g( 固体培养基添加 ) LB 培养基 (1 L): 胰蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g ph 7.0 琼脂粉 20 g( 固体培养基添加 ) 恢复培养基 : 含 0.3 mol/l 蔗糖 20 mmol/l MgCl 2 2 mmol/l CaCl 2 的 MRS 培养基表 1 基因扩增的引物序列 Table 1 DNA sequences of primers for gene amplification 名称序列 (5-3 ) 目的片段 rhad-up-f GGACCGATAACGCGCTCGAGCTGCAGCACTATTCGAATCTG 上游同源臂 rhad-up rhad-up-r GTAGATTTAAATTGTTTAAACGTTTGGCCTGAGAAGAGGGTTATCATG (1200 bp) rhad-down-f GTACAGCCCGGGCATGAGCTCTGCCAACCTTTTCTTGTTAATTTTTG 下游同源臂 rhad-down rhad-down-r cm-f cm-r CCCGTCAGCTTTAGAGATCTTCGGGTGATTACCCAGGTATTGCGC ATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACAATTG TTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATC (1200 bp) cm 基因 (651 bp) rhad-f rhad-r ATGATTATGACAGACTTTATTGATTCAC TTAGTCAACCGTTGCTCCG 仪器 SPX-158L 生化培养箱宁波新芝生物科技股份有 rhad 基因 (852 bp) 限公司 ;FRESC21 微量台式冷冻离心机 Thermo Fisher Scientific 公司 ;YXQ50 蒸汽灭菌锅西安太康生物科技 29

3 公司 ;BIO-RADC1000 梯度 PCR 仪和 Gel Doc TM XR+ 凝胶成像系统 BIO-RAD 公司 ;SKJH-1109 超净工作台上海苏坤实业公司 ;EPS-300 电泳仪上海天能公司引物本文所用引物如表 1 所示 1.2 实验方法 rhad 基因同源臂的克隆及纯化根据 GenBank 中已登录的植物乳杆菌 rhad 基因两侧序列, 设计引物 rhad-up-f/rhad-up-r rhad-down-f/rhad-down-r 分别扩增长约为 1200 bp 的 rhad 基因上游同源臂 (rhad-up) 和下游同源臂 (rhad-down), 并在 rhad-up 片段引入限制性酶切位点 Xho I 和 Pme I,rhaD-down 片段引入限制性酶切位点 Sac I Bgl II 植物乳杆菌 Lp10 菌株基因组 DNA 按照 TIANGEN 细菌基因组 DNA 提取试剂盒说明书步骤提取 PCR 反应体系 (50 μl): 模板 DNA(225 ng/μl)2 μl,10 Ex Taq buffer(20 mm)5 μl,dntps (2.5 mm)4 μl, 上下游引物 (20 μm) 各 1 μl,ex Taq 酶 (5 U/μL)0.5 μl,ddh 2 O 补足 50 μl PCR 条件为 :94 预变性 5 min;94 变性 30 s,65 (rhad-up) 或 68 (rhad-down) 退火 30 s,72 延伸 72 s,34 个循环 ;72 延伸 10 min,4 保存 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳后, 切下目的条带并使用琼脂糖凝胶 DNA 纯化回收试剂盒回收目的片段并进行测序比对分析 rhad 基因敲除质粒的构建 30 图 1 敲除载体 pnz5319-rhad 构建路线 Fig.1 Structure route of knockout vector pnz5319-rhad 植物乳杆菌 rhad 基因的 pnz5319-rhad 敲除质粒的构建路线如图 1 所示利用限制性内切酶 Xho I 和 Pme I 分别对 pnz5319 质粒和 rhad-up 进行双酶切并进行琼脂糖电泳回收, 利用 abm 必克隆试剂盒将双酶切处理后的 pnz5319 质粒和 rhad-up 片段进行连接处理, 转化 DH5α 感受态细胞并于终浓度为 15 μl/ml 氯霉素的 LB 固体培养基过夜培养挑取转化子并扩大培养后, 提取质粒进行 Xho I 和 Pme I 双酶切鉴定和测序鉴定, 将正确的重组质粒命名为 pnz5319-up 分别将 pnz5319-up 质粒和下游同源臂 rhad-down 片段进行 Sac I 和 Bgl II 双酶切和回收处理将双酶切后的 pnz5319-up 质粒和 rhad-down 片段连接并转化 E. coli DH5α 感受态细胞对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定 ( 参照 ), 将正确的重组质粒命名为 pnz5319-rhad 植物乳杆菌感受态细胞的制备植物乳杆菌 Lp10 菌株按 1% 接种量接种于 100 ml 含 1% 甘氨酸的 MRS 培养基,37, 静置培养至 OD 600 约 0.8(6~7 h); 冰浴 15 min, 使菌停止生长 ; 于 4,8000 g 下离心 5 min 后收集菌体 ; 用 100 ml 冰浴的 30% PEG4000 洗涤 3 次, 离心条件同上 ; 用 1 ml 冰浴的 30% PEG4000 重悬菌体, 分装每管 100 μl, -80 保存电转化将 20 μl 重组质粒 ( 浓度 ng/μl) 与 100 μl 植物乳杆菌 Lp 10 菌株感受态细胞在冰浴条件下混匀, 转移至电转杯中, 冰浴 10 min 在电阻 200 Ω, 电容值 25 μf, 电压 2.5 kv 条件下进行电击, 电击后迅速加入 800 μl 恢复培养基, 混合均匀后 37 静置培养 3 h 并涂布于含终浓度为 5 μg/mg 氯霉素的 MRS 培养基, 于 37 培养 24~48 h 植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株的鉴定利用 TIANGEN 细菌基因组 DNA 提取试剂盒 ( 离心柱 ) 提取植物乳杆菌 Lp10 初始菌株和重组转化子的基因组 DNA 以重组转化子和初始菌株基因组 DNA 为模板, 分别扩增上游同源臂 rhad-up 下游同源臂 rhad-down cm 基因和 rhad 基因等 DNA 片段植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株的生长分析将植物乳杆菌突变株与初始菌株按接种量 1% 接种于 MRS 液体培养基中,37 静置培养, 以 0 h 为起点, 每隔 2 h 取一次样并测定 OD 600, 测定到 24 h, 通过软件 Origin 绘制生长曲线, 观察两株菌的生长情

况 1.2.7 植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株的降胆固醇能力测定将植物乳杆菌突变株与初始菌株分别接种于加有 1% 胆固醇溶液的 MRS 培养基中,37 培养 20 h [15] 按照邻苯二甲醛法对初始菌株和突变菌株进行降胆固醇能力的测定, 每个样品进行 3 次重复进行试验 1.2.8 数据统计分析实验中每个数据重复三次, 结果表示为平均数 ± 标准差采用 Origin 8.

1 rhad 基因同源臂的克隆及纯化以植物乳杆菌 Lp10 菌株基因组 DNA 为模板, 分别扩增 rhad 基因上下游同源臂, 将 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳, 发现在 1200 bp 处都有明显的单一条带, 与预计大小一致 ( 图 2) 目的条带的测序鉴定表明 rhad 基因上下游同源臂被成功克隆图 3 敲除载体转化子的鉴定 Fig.

);(c) 菌液 PCR 鉴定下游同源臂 rhad-down (M:DNA marker;1 和 2: 下游同源臂 rhad-down 的 PCR 扩增电泳结果 );(d)pnz5319-rhad 质粒双酶切鉴定 (M:DNA marker;1:pnz5319-rhad 质粒双酶切电图 2 rhad 基因同源臂的 PCR 扩增 Fig.

4 况植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株的降胆固醇能力测定将植物乳杆菌突变株与初始菌株分别接种于加有 1% 胆固醇溶液的 MRS 培养基中,37 培养 20 h [15] 按照邻苯二甲醛法对初始菌株和突变菌株进行降胆固醇能力的测定, 每个样品进行 3 次重复进行试验数据统计分析实验中每个数据重复三次, 结果表示为平均数 ± 标准差采用 Origin 8.5 软件作图,SPSS 17.0 进行显著性分析 Sac I 和 Bgl II 双酶切鉴定 ( 图 3c 和 3d) DNA 测序结果进一步验证敲除载体 pnz5319-rhad 被成功构建 2 结果与分析 2.1 rhad 基因同源臂的克隆及纯化以植物乳杆菌 Lp10 菌株基因组 DNA 为模板, 分别扩增 rhad 基因上下游同源臂, 将 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳, 发现在 1200 bp 处都有明显的单一条带, 与预计大小一致 ( 图 2) 目的条带的测序鉴定表明 rhad 基因上下游同源臂被成功克隆图 3 敲除载体转化子的鉴定 Fig.3 Identification of transformants with knockout vector 注 :(a) 菌液 PCR 鉴定上游同源臂 rhad-up (M:DNA marker;1 和 2: 上游同源臂 rhad-up 的 PCR 扩增电泳结果 ); (b)pnz5319-up 质粒双酶切鉴定 (M:DNA marker;1: pnz5319-up 质粒双酶切电泳结果 );(c) 菌液 PCR 鉴定下游同源臂 rhad-down (M:DNA marker;1 和 2: 下游同源臂 rhad-down 的 PCR 扩增电泳结果 );(d)pnz5319-rhad 质粒双酶切鉴定 (M:DNA marker;1:pnz5319-rhad 质粒双酶切电图 2 rhad 基因同源臂的 PCR 扩增 Fig.2 PCR amplification for homologous arms of rhad gene 注 :(a) 上游同源臂 rhad-up 的 PCR 扩增 (M:DNA marker; 1 和 2: 上游同源臂 rhad-up 的 PCR 扩增电泳结果 );(b) 下游同源臂 rhad-down 的 PCR 扩增 (M:DNA marker;1 和 2: 下游同源臂 rhad-down 的 PCR 扩增电泳结果 ) 2.2 同源臂与 pnz5319 载体的连接及转化对上游同源臂 rhad-up 片段与敲除载体 pnz5319 连接所得的 pnz5319-up 转化子进行菌液 PCR 鉴定及 Xho I 和 Pme I 双酶切鉴定 PCR 凝胶电泳结果显示在 1200 bp 处有一清晰条带, 与目的片段 rhad-up 大小相符 ( 图 3a); 双酶切 pnz5319-up 质粒, 得到 2 个片段, 大小与 pnz5319 质粒和 rhad-up 相符 ( 图 3b) 同理, 得到的 pnz5319-rhad 转化子进行菌液 PCR 鉴定及泳结果 ) 2.3 重组转化子的鉴定利用引物 rhad-up/rhad-down cm-up/cm-down 对植物乳杆菌初始菌株和重组转化株进行 PCR 鉴定实验结果显示, 从植物乳杆菌 Lp10 初始菌株基因组 DNA 中能扩增到与目的基因 rhad(852 bp) 大小相同的片段, 而不能从重组转化株的基因组 DNA 和 ddh 2 O( 阴性对照 ) 中扩增出相同的片段 ( 图 4b); 从重组转化株基因组 DNA 中能扩增出与目的基因 cm (651 bp) 大小相同的片段, 而不能从初始菌株基因组 DNA 和 ddh 2 O 中扩增出相同片段 ( 图 4c) 分别将以上扩增所得的两个片段进行回收和测序鉴定, 表明两者分别为 rhad 和 cm 基因因此, 重组转化株的 rhad 基因被成功敲除 31

植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株与初始菌株在 MRS 培养基中的生长曲线如图 5, 两株菌都符合典型的生长曲线趋势, 在 4 h 进入对数生长期,14 h 后进入稳定生长期, 但突变株进入稳定生长期后相比于初始菌株生长稍缓慢 2.

plantarumlp10 注 :(a) 植物乳杆菌 Lp10 重组转化株的菌落 ;(b) 菌株的 rhad 基因的 PCR 鉴定 (M:DNA marker;1 和 2: 植物乳杆菌 Lp10 重组转化株 rhad 基因的 PCR 扩增电泳结果 ;3: 植物乳杆菌 Lp10 初始菌株 rhad 基因的 PCR 扩增电泳结果 ; ddh 2

扩增电泳结果 ) 2.4 植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株的生长曲线图 5 突变菌株和初始菌株的生长曲线 Fig.5 growth curve of mutant strain and original strain 图 6 胆固醇能力的测定 Fig.

05) 根据邻苯二甲醛法测定胆固醇降解率, 据图 6 可知, 初始菌株的胆固醇降解率为 45%, 突变菌株的胆固醇降解率为 41%, 两株菌株的 OD 600 分别为 2.373 和 2.133, 即初始菌株的胆固醇降解率为 18.96%/OD 600, 敲除菌株的胆固醇降解率为 19.

5 植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株与初始菌株在 MRS 培养基中的生长曲线如图 5, 两株菌都符合典型的生长曲线趋势, 在 4 h 进入对数生长期,14 h 后进入稳定生长期, 但突变株进入稳定生长期后相比于初始菌株生长稍缓慢 2.5 植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株的降胆固醇能力图 4 植物乳杆菌 Lp10 重组转化株的鉴定 Fig.4 Identification of recombinant transformation of L. plantarumlp10 注 :(a) 植物乳杆菌 Lp10 重组转化株的菌落 ;(b) 菌株的 rhad 基因的 PCR 鉴定 (M:DNA marker;1 和 2: 植物乳杆菌 Lp10 重组转化株 rhad 基因的 PCR 扩增电泳结果 ;3: 植物乳杆菌 Lp10 初始菌株 rhad 基因的 PCR 扩增电泳结果 ; ddh 2 O 阴性对照的 rhad 基因 PCR 扩增电泳结果 );(c) 菌株的 cm 基因的 PCR 鉴定 (M:DNA marker;1 和 2: 植物乳杆菌 Lp10 重组转化株 cm 基因的 PCR 扩增电泳结果 ;3: 植物乳杆菌 Lp10 初始菌株 cm 基因的 PCR 扩增电泳结果 ;ddh 2 O 阴性对照的 cm 基因 PCR 扩增电泳结果 ) 2.4 植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株的生长曲线图 5 突变菌株和初始菌株的生长曲线 Fig.5 growth curve of mutant strain and original strain 图 6 胆固醇能力的测定 Fig.6 Determination of cholesterol lowering ability 注 : 不同字母表示差异显著 (p<0.05), 相同字母表示差异不显著 (p>0.05) 根据邻苯二甲醛法测定胆固醇降解率, 据图 6 可知, 初始菌株的胆固醇降解率为 45%, 突变菌株的胆固醇降解率为 41%, 两株菌株的 OD 600 分别为和 2.133, 即初始菌株的胆固醇降解率为 18.96%/OD 600, 敲除菌株的胆固醇降解率为 19.22%/OD 600, 结果表明基因 rhad 敲除后, 植物乳杆菌 Lp10 的降胆固醇能力略有上升, 但差异不显著 (p>0.05) 3 结论 3.1 近年来, 利用组学研究挖掘差异基因已经成为趋势, 例如基因组转录组以及蛋白组学等, 了解差异基因的功能已成为研究的热点和核心内容研究基因功能的一个重要方法, 就是对该基因进行敲除, 获得突变株, 然后根据突变株的变化来推测基因产物的功能 [17] 本研究基于植物乳杆菌 Lp10 降胆固醇过程的转录组数据, 通过 GO 数据库和 KEGG 代谢通路数据分析, 选择 rhad 基因为研究对象利用同源重组原理, 成功获得植物乳杆菌 Lp10 rhad 基因敲除突变株对初始菌株与敲除菌株进行生长曲线及降胆固醇能力测定, 结果表明, 敲除菌株的生长较初始菌株更缓慢, 初始菌株的胆固醇降解率为 18.96%/OD 600, 敲除菌株的胆固醇降解率为 19.22%/OD 600, 表明基因 rhad 基 32

6 因经敲除后, 植物乳杆菌 Lp10 的降胆固醇能力略有上升, 但差异不显著, 推测可能原因是敲除载体 pnz5319-rhad 在植物乳杆菌 Lp10 发生同源重组时, cm 抗性基因与 rhad 基因发生互换,cm 基因整合到基因组上, 对植物乳杆菌 Lp10 生长生理活动等产生 [14] 负影响, 后续研究可将 Cre-loxP 系统转化至突变株中, 对抗性筛选标记 cm 基因进行敲除, 此外,rhaD 基因的敲除对菌体生长也有所影响, 该基因参与鼠李糖在生物体内的代谢, 且鼠李糖属于细胞初级代谢产物,rhaD 基因的敲除影响菌体细胞正常的初级代谢, 从而导致菌体生长减缓, 菌体量下降 3.2 本研究构建 pnz5319-rhad 敲除载体时, 考虑同源重组效率与同源臂长度有一定的关系, 在 0.3~1.2 kb 范围内, 随着同源臂长度的增加, 同源重组效率呈对数增加 [14],rhaD 基因的上下游同源臂 rhad-up/rhad-down 长度都约为 1200 bp, 有利于目标基因与抗性筛选基因发生同源重组本研究选用的载体 pnz5319 是植物乳杆菌 - 大肠杆菌穿梭载体, 氯霉素抗性筛选标记在植物乳杆菌和大肠杆菌中都能发挥作用, 无需其他抗性基因的引入, 简化了实验操作 3.3 近年来, 随着分子生物学的大力发展, 基因敲除技术成为了热点同源重组技术已成功应用于乳酸菌中, 但存在效率低工作量大等缺点, 通过合理设计同源臂选择合适的敲除载体优化电击条件均可以提高同源重组效率除了传统的同源重组技术, CRISPR/Cas 技术已日渐成熟 [18,19] [20] Jiang 等利用 CRISPR/Cas 系统成功实现了原核生物基因的定向修饰后续研究可尝试利用 CRISPR/Cas 技术建立和完善的植物乳杆菌基因操作系统 3.4 植物乳杆菌敲除系统可以用于降胆固醇功能性植物乳杆菌的开发, 应用于酸奶乳酸菌饮料及益生菌制剂等方面达到降胆固醇的目的, 弥补药物治疗引发的肝肾受损戒断反应和复发等副作用, 减少心脑血管发病率, 并且食品级敲除菌株包括独特风味, 成本低, 效率高等优点, 具有一定的市场前景 3.5 本研究成功建立了一套完整的植物乳杆菌敲除体系及电转化体系, 这不仅为植物乳杆菌基因敲除载体的构建提供了一定的实验经验, 也为后续 rhad 基因的功能验证奠定了基础为了进一步深入验证 rhad 基因与 EPS 吸附作用降胆固醇机制的关系, 后续研究将对敲除前后菌体表面的 EPS 含量及种类进行分析鉴定, 为高效降胆固醇乳酸菌制剂的研究和开发利用提供实验基础和理论依据参考文献 [1] Grill J, Schneider F, Crociani J, et al. Purification and characterization of conjugated bile salt hydrolase from Bifidobacterium longum BB536 [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(7): [2] Ashen M D, Blumenthal R S. Low HDL cholesterol levels [J]. New England Journal of Medicine, 2005, 353(12): [3] Mathara J M, Schillinger U, Guigas C, et al. Functional characteristics of Lactobacillus spp. from traditional Maasai fermented milk products in Kenya [J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 126(1): [4] Pereira DIA, Gibson G R. Effects of consumption of probiotics and prebiotics on serum lipid levels in humans [J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 37(4): [5] 王玉文, 王延祥, 李平兰, 等. 胆盐水解酶的分离纯化与部分特性研究 [J]. 中国食品学报,2007,7(5):35-41 WANG Yu-wen, WANG Yan-xiang, LI Ping-lan, et al. Studies on the isolation, purification and partial characteristics of bile salt hydrolase [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2007, 7(5): [6] Choi E A, Chang H C. Cholesterol-lowering effects of a putative probiotic strain Lactobacillus plantarum EM isolated from kimchi [J]. LWT - Food Science and Technology, 2015, 62(1): [7] Hirose Y, Murosaki S, Yamamoto Y, et al. Daily intake of heat-killed Lactobacillus plantarum L-137 augments acquired immunity in healthy adults [J]. Journal of Nutrition, 2006, 136(12): [8] Falaye A, Emikpe B O, Ogundipe E T. Effects of dietary supplementation of Lactobacillus plantarum probiotics from corn slurry on growth performance, gut morphometry and profile of the intestinal mocrobial flora of Clarias gariepinus fingerlings [J]. International Journal of Infectious Diseases, 2016, 45: 336 [9] Dhanani A S, Bagchi T. Lactobacillus plantarum CS24.2 prevents Escherichia coli adhesion to HT-29 cells and also down-regulates enteropathogen-induced tumor necrosis factor-α and interleukin-8 expression [J]. Microbiology and Immunology, 2013, 57(4): [10] 赵佳锐, 杨虹. 益生菌降解胆固醇的作用及机理研究进展 [J]. 微生物学报,2005,45(2): ZHAO Jia-rui, YANG Hong. Research progress on the mechanism and effect of probiotics on cholesterol degradation [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2005, 45(2):

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

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