第 4 期王珊珊等 : 过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响 43 制, 且通过这种方法生产的 GlcN 用来做药物作用于人体会有贝类蛋白过敏的风险 [5] 生物法制备氨基葡萄糖不会有原料来源的限制及贝类蛋白过敏的风险, 环境污染小, 操作简单等优点, 近年来已成

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裤郎
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1 第 11 卷第 4 期 2013 年 7 月生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol. 11 No. 4 Jul doi: / j. issn 过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响王珊珊, 高璐, 严明, 许琳 ( 南京工业大学生物与制药工程学院, 南京 ) 摘要 : 考察过表达氨基葡萄糖脱氨酶对氨基葡萄糖合成及大肠杆菌 (Escherichia coli) 中心碳代谢的影响实验结果表明 : 过表达氨基葡萄糖脱氨酶使得在 36 g / L 葡萄糖,pH 为 9 0 的发酵条件下, 发酵 24 h 后, 重组菌发酵液中氨基葡萄糖丙酮酸和乙酸的量分别是对照菌 Rosetta 的和 1 74 倍 ; 而乳酸的量为 2 53 g / L, 对照菌 Rosetta 发酵液中的乳酸含量未检测到, 重组菌发酵液中柠檬酸及 α 酮戊二酸的含量分别是 Rosetta 的 2 99 和 2 73 倍关键词 : 大肠杆菌 ; 脱氨酶 ; 氨基葡萄糖中图分类号 :Q78 文献标志码 :A 文章编号 : (2013) Effects of overexpression glucosamine deaminase on glucosamine synthesis and central carbon metabolism in Escherichia coli WANG Shanshan,GAO Lu,YAN Ming,XU Lin ( College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing ,China) Abstract:The effects on glucosamine synthesis and central carbon metabolism in E coli by overexpression glucosamine deaminase were investigated The results showed that overexpression glucosamine deaminase nagb could improved the content of glucosamine by two times of that of Rosetta,under the conditions of 36 g / L glucose,ph 9 0,after 24 h fermentation The content of pyruvate was 1 48 times,acetic acid was 1 74 times,citric acid was 2 99 times,α ketoglutaric acid was 2 73 times of that of Rosetta,respectirely. Lactic acid content of recombinant was 2 53 g / L. Lactic acid content of the original bacteria was not detected. These preliminary findings showed that,overexpression of the glucosamine deaminase promoted the accumulation of glucosamine in E coli,overexpression of the glucosamine deaminase also made the accumulation of pyruvate,acetic acid and lactic acid Overexpression of the glucosamine deaminase has great impact on the TCA cycle,high level of the citric acid and α ketoglutaric acid were detected Key words:e. coli;deaminase;glucosamine 氨基葡萄糖 (2 氨基 2 脱氧 D 葡萄糖, 简称 GlcN) 是人体合成关节软骨及滑液的中间物, 人体及动物体内关节组织中糖蛋白的天然成分 [1-2] 国内外研究发现 GlcN 对骨关节炎有一定的疗效 [3-4] 目前, 工业上主要通过化学法水解甲壳素得到, 但原材料来源逐渐成为这种生产方法的限收稿日期 : 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863 计划 )(2012AA022101) 作者简介 : 王珊珊 (1988 ), 女, 河南洛阳人, 硕士研究生, 研究方向 : 生物化工 ; 严明 ( 联系人 ), 副教授,E mail:yanming@ njut. edu. cn

2 第 4 期王珊珊等 : 过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响 43 制, 且通过这种方法生产的 GlcN 用来做药物作用于人体会有贝类蛋白过敏的风险 [5] 生物法制备氨基葡萄糖不会有原料来源的限制及贝类蛋白过敏的风险, 环境污染小, 操作简单等优点, 近年来已成为研究热点 [5-7], 通过基因工程手段改变宿主的代谢途径产 GlcN 就是其中的一种方法氨基葡萄糖脱氨酶 ( NagB) 主要催化 ( GlcN 6 P) 合成 Fru 6 P, 此酶会受到乙酰氨基葡萄糖 6 磷酸的变构激活 ( 图 1), 使得正逆反应的 K m 值均减小 [8] 而黑曲老霉的氨基葡萄糖脱氨酶催化 Fru 6 P 形成 GlcN 6 P 的 K m 值是已报道的氨基葡萄糖脱氨酶中最低的, 且此酶在偏酸性的环境下脱氨的反应酶活较高, 在偏碱性的条件下加氨反应酶活较高 [9] 因此, 通过过表达黑曲老霉的氨葡萄糖脱氨酶并控制发酵过程, 在偏碱性的条件下研究其对大 [10-11] 肠杆菌 ClcN 的合成的影响由于 Fru 6 P 在细胞内不仅用来合成氨基葡萄糖, 还有一部分经过 EMP 途径, 生成丙酮酸, 而丙酮酸一部分代谢生成乳酸和乙酸, 一部分在有氧条件下进入 TCA 循环这就造成氨基葡萄糖的合成途径和 EMP 途径会竞争 Fru 6 P 这个共同的底物 [5,9], 所以过表达氨基葡萄糖脱氨酶可能会对中心碳代谢产生影响因此, 笔者拟考察在大肠杆菌中过表达黑曲霉的氨基葡萄糖脱氨酶及其对大肠 [12-13] 杆菌 GlcN 的合成及中心碳代谢的影响, 为通过改变大肠杆菌代谢途径生产 GlcN 的研究奠定基础 1 材料与方法 1 1 菌株和质粒大肠杆菌 Rosetta DH5α, 质粒 pmd18t - nagb 由笔者所在实验室保藏表达载体 pet15b 购自 TaKaRa 公司 1 2 培养基种子液采用 LB 培养基 ( g / L): 胰蛋白胨 10 酵母粉 5 NaCl 10 自诱导培养基 ( g / L) [14] : 胰蛋白胨 10 酵母粉 5 Na 2 H KH ( NH 4 ) 2 SO α 甘油 5 葡萄糖 0 5 α 乳糖 3, 微量元素溶液微量元素 ( mmol / L):FeCl CaCl MnCl ZnSO CoCl CuCl NiCl NaMoO 图 1 大肠杆菌 GlcN 的生物合成与分解途径 Fig. 1 Pathways of biosynthesis and catabolism GlcN for E. coli Na 2 SeO H 3 BO 用 NaOH 调 ph 至 7 5, 加入 MgSO g / L, 加氨苄青霉素的终质量浓度为 0 1 g / L 发酵液 ( g / L): 葡萄糖 36 NH 4 HCO K 2 H 3H 2 O 7 2 KH , MgSO ZnCl 磷酸缓冲液 ( PBS) 体系 ( g / L): NaCl 8 KCl 0 2 KH Na 2 H 主要试剂和仪器限制性内切酶 DNA Marker 购自 TaKaRa 公司, LApro TaqDNA 聚合酶购自南京金斯瑞生物科技有限公司,Taq DNA 聚合酶质粒小量抽提试剂盒购自上海申能博彩生物技术有限公司, 胶回收试剂盒购自美国 Biomiga 公司, 氨苄青霉素购自 BBI 公司, 乙腈购自美国 ROE 公司, 其他试剂均为国产试剂纯, 高效液相色谱系统购自美国戴安公司 1 4 氨基葡萄糖脱氨酶基因 nagb 在 E coli 中的表达重组质粒 pet15b nagb 的构建根据 NCBI 中黑曲霉基因组中的 nagb 基因序列设计氨基葡萄糖脱氨酶基因的 PCR 扩增引物上游引物 P1:5 GCGGCGTCTCACATGAGAGTAAT CATTAGGGAGACTAGCC 3 ; 下游引物 P2:5 CCG CTCGAGTCAATGCGATGCAACCC 3

3 44 生物加工过程第 11 卷在上下游分别设计了 BsmBI 和 XhoI 点用于连接到表达载体 pet15b 以 pmd18t nagb 为模板, 用设计的引物 PCR 扩增 nagb 基因所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成扩增条件 :94 预变性 5 min;94 变性 45 s, 54 退火 45 s,72 延伸 1 min 30 s,30 个循环 ;72 延伸 10 min 将 pet15b 和 PCR 扩增片段用 BsmBI 和 XhoI 进行双酶切, 胶回收 nagb 片段, 将其与经相同酶切线性化并胶回收过的 pet15b 载体连接, 转化入大肠杆菌 DH5α, 挑取阳性转化子提取质粒酶切鉴定, 将重组表达载体命名为 pet15b nagb 并将其转化大肠杆菌 Rosetta, 筛选出阳性转化子重组菌诱导表达重组菌 Rosetta pet15b nagb 在液体 LB 中,37 培养活化然后按 2% 接种量转接入自诱导培养基中, r / min 培养 2 5 h 然后转入 r / min 条件下, 进行诱导表达 15 h SDS PAGE 电泳分析采用 5% 的浓缩胶及 12% 分离胶的不连续垂直平板电泳进行蛋白分离, 考马斯亮蓝 R 250 染色蛋白质含量测定蛋白质含量的测定采用 Bradford 法, 以牛血清白蛋白为标准蛋白质酶活力的测定粗酶液的制备 : 低温收集菌体, 用 100 mmol / L PH 8 3 Tris 洗菌 2 次, 破碎细胞, 低温离心, 取上清作为酶液酶活力单位定义 :1 min 生成 1 μmol GlcN 所需的酶量为 1 个单位 (U) 酶活力测定方法 [9] : 取 1 2 mol / L 的 Na 2 CO 3 溶液 10 ml 加入 700 μl 乙酰丙酮得乙酰丙酮溶液 ; 称 g 对二甲氨基苯甲醛溶于 25 ml 浓盐酸和 25 ml 无水乙醇的混合液中得对二甲氨基苯甲醛溶液 ; 取一个 1 5 ml 的 EP 管, 加入 600 mmol / L NH 4 Cl 10 μl,60 mmol / L 的 Fru 6 P10 μl, 酶液 80 μl, 放入 30 水浴锅中, 反应 5 min 后, 加入乙酰丙酮溶液 50 μl, 沸水浴 30 min, 冷却后加入 100 μl 无水乙醇,50 μl 对二甲氨基苯甲醛溶液, 混匀, 再加入 200 μl 无水乙醇,60 保温 1 h, 用酶标仪测 540 nm 处的吸光值 1 5 发酵体系的优化以及有机酸随发酵时间的变化低温收集诱导表达后的菌体, 并用 PBS 低温洗菌 2 次, 加入发酵液, 转移至 250 ml 三角瓶中, r / min 条件下, 发酵葡萄糖形成 GlcN 在此基础上对于初始 ph 发酵温度底物浓度, 菌体浓度的发酵条件进行了优化 1 6 测定方法 GlcN 含量的测定 [15] : 采用戴安 Ultimate 3000 高效液相色谱系统, 汉邦 C18 色谱柱, 检测器为紫外检测器, 检测波长 254 nm, 流动相为乙酸钠乙腈溶液有机酸含量的检测 : 采用戴安 Ultimate 3000 高效液相色谱系统, 戴安有机酸色谱柱, 检测器为紫外检测器, 检测波长 210 nm, 流动相为 6 8 g / L KH 2 溶液 2 结果与讨论 2 1 含有氨基葡萄糖脱氨酶基因 nagb 重组质粒的构建及表达以实验室已有 pmd18t nagb 载体为模板, 利用合成的引物 P1 和 P2 进行 PCR 扩增, 通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段, 扩增 DNA 片段长为 bp 将该片段纯化和酶切后, 插入载体 pet15b 的 NcoI 和 XhoI 酶切位点之间用所构建的重组质粒转化大肠杆菌 DH5α, 转化子涂布于含有 34 μg / ml 氯霉素和 100 μg / ml 氨苄青霉素的 LB 平板, 提取阳性重组子质粒重组质粒经过双酶切验证 ( 预期两片段大小分别为 :6 270 和 441 bp), 结果如图 2 所示由图 2 可知, 泳道 4 重组质粒双酶切验证结果片断大小与预期相符该质粒命名为 pet15b nagb 将重组质粒 pet15b nagb 转化进入大肠杆菌 Rosetta 中, 挑取单菌落接入 LB 液体培养基培养, 12 h 后转接入自诱导培养基 15 诱导 15 h 菌液经超声破碎细胞后, 上清液经 SDS PAGE 蛋白质电泳分析, 结果如图 3 所示由图 3 可知 : 重组菌的破碎上清液中出现 1 条约为的特异性条带, 与理论值相符合同时测得重组菌破碎上清液中氨基葡萄糖脱氨酶活性为 2 mu / mg, 而对照菌的破碎上清液中检测到氨基葡萄糖脱氨酶的活性为 0 4 mu / mg, 说明氨基葡萄糖脱氨酶基因 nagb 在重组菌中已获得成功表达

第 4 期王珊珊等 : 过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响 45 1 ~ 2 nagb 基因 PCR 扩增产物 ;3 DNA Marker DL2000;4 ~ 5 重组质粒 pet15b nagb 双酶切产物 ; 6 DNA Marker DL2000;7 DNA Marker DL15000 图 2 nagb 的基因扩增与重组质粒 pet15b nagb

4 Effects of different initial ph on fermentation GlcN yield 2 2 Marker Protein Marker;1 Rosetta 菌 ;2 Rosetta pet15b nagb 2 2 1 图 3 Fig.

而另一个底物谷氨酰胺主要用来提供 NH + 4, 因此发酵底物选择葡萄糖和铵盐由文献 [9] 知,pH 对该酶的活性影响较大, 因此在发酵条件中, 选择不同的初始 ph 条件作为考虑的首要问题由图 4 可知 : 初始 ph 7 0 时, 发酵液中 GlcN 含量较低, 这主要是由于在酸性缓冲液中氨基葡萄糖脱氨酶的加氨反应活性较低所致 ; 初始 ph 为 8 0 至 9 3 时,

4 第 4 期王珊珊等 : 过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响 45 1 ~ 2 nagb 基因 PCR 扩增产物 ;3 DNA Marker DL2000;4 ~ 5 重组质粒 pet15b nagb 双酶切产物 ; 6 DNA Marker DL2000;7 DNA Marker DL15000 图 2 nagb 的基因扩增与重组质粒 pet15b nagb 的酶切鉴定 Fig. 2 Amplification of gene nagb and identification of restriction analysis of pet15b nagb 图 4 不同初始 ph 对发酵合成 GlcN 的影响 Fig. 4 Effects of different initial ph on fermentation GlcN yield 2 2 Marker Protein Marker;1 Rosetta 菌 ;2 Rosetta pet15b nagb 图 3 Fig. 3 重组大肠杆菌 Rosetta pet15b nagb 细胞的 SDS PAGE 电泳分析 SDS PAGE analysis of recombinant Rosetta pet15b nagb 发酵条件对大肠杆菌合成 GlcN 的影响初始 ph 对重组大肠杆菌合成 GlcN 的影响在大肠杆菌中, 合成 GlcN 的底物 Fru 6 P 是葡萄糖经 EMP 途径转化而来, 而另一个底物谷氨酰胺主要用来提供 NH + 4, 因此发酵底物选择葡萄糖和铵盐由文献 [9] 知,pH 对该酶的活性影响较大, 因此在发酵条件中, 选择不同的初始 ph 条件作为考虑的首要问题由图 4 可知 : 初始 ph 7 0 时, 发酵液中 GlcN 含量较低, 这主要是由于在酸性缓冲液中氨基葡萄糖脱氨酶的加氨反应活性较低所致 ; 初始 ph 为 8 0 至 9 3 时, 发酵液中 GlcN 的含量较高, 这主要是因为氨基葡萄糖脱氨酶在偏碱性的条件下, 酶的加氨方向的反应活性较高 ; 初始 ph 为 10 0 时, 发酵液中 GlcN 含量骤然减少, 这是由于碱性过强的溶液对于菌体会产生影响因此, 初始 ph 对于重组菌发酵合成 GlcN 有影响, 且发酵液的最适初始 ph 为温度对重组大肠杆菌合成 GlcN 的影响考察了温度对重组菌发酵合成 GlcN 的影响, 结果如图 5 所示由图 5 可知 : 发酵温度在 20 ~ 48 时, 发酵液中 GlcN 的含量随着温度的降低而增高这是因为温度升高时, 温度对酶稳定性的影响增强, 酶会逐渐失活, 产物得率降低确定体系最适发酵温度为铵盐对重组大肠杆菌合成 GlcN 的影响考察铵盐对重组菌发酵合成 GlcN 有影响, 结果见图 6 由图 6 可知 :NH 4 HCO 3 对发酵产生 GlcN 最

5 46 生物加工过程第 11 卷有利, 其余来源的铵盐对于发酵产生 GlcN 没有明显的作用因此确定体系最适铵盐来源为 NH 4 HCO 3 图 5 温度对发酵合成 GlcN 的影响 Fig. 5 Effects of temperature on fermentation of GlcN yield Fig. 7 图 7 底物浓度对发酵合成 GlcN 的影响 Effects of substrate concentration on fermentation GlcN yield 图 6 铵盐对发酵合成 GlcN 的影响 Fig. 6 Effects of different ammonium ion source on fermentation GlcN yield 底物浓度对重组大肠杆菌合成 GlcN 的影响考察底物浓度对重组菌发酵合成 GlcN 的影响, 结果见图 7 由图 7 可知 : 底物浓度 0 2 mol / L 时, 随着底物浓度的增加, 发酵液中 GlcN 的量增加这主要是根据酶反应动力学原理, 在底物浓度 K m 的时候, 提高底物浓度会提高反应速率, 产物的量会增加当底物浓度在 0 3 ~ 0 6 mol / L 时, 随着底物浓度增加, 发酵液中 GlcN 的量减少这主要是由于菌体所处的胞外环境浓度过高, 不利于菌体代谢确定体系最适底物浓度为 0 2 mol / L 菌体密度对重组大肠杆菌合成 GlcN 的影响考察菌体浓度对发酵产物合成的影响 [16], 结果见图 8 由图 8 可知 : 在菌体 OD 600 为 20 左右的情况下, 发酵液中 GlcN 的积累最多因此, 确定最适菌体浓度 OD 600 为 20 图 8 菌体密度对发酵合成 GlcN 的影响 Fig. 8 Effects of cell concentration on fermentation GlcN yield 发酵时间对重组大肠杆菌合成 GlcN 的影响考察发酵时间对发酵产物的影响 [16], 结果见图 9 由图 9 可知 : 发酵时间在 0 ~ 24 h 时, 随着发酵时间的延长, 发酵液中 GlcN 的含量不断增加,24 h 达到最大值,28 h 开始减少因此确定体系最佳发酵时间为 24 h 图 9 发酵时间对发酵合成 GlcN 的影响 Fig. 9 Effects of fermentation time on fermentation GlcN yield

6 第 4 期王珊珊等 : 过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响过表达 nagb 基因对 GlcN 积累以及中心碳代谢的影响在最适发酵条件下, 检测发酵液中残糖 GlcN 的含量, 以及丙酮酸乙酸乳酸柠檬酸及 α 酮戊二酸几种有机酸的含量, 观察过表达氨基葡萄糖脱氨酶对于 GlcN 积累以及中心碳代谢的影响过表达 nagb 基因对发酵过程中糖耗以及 GlcN 积累的影响图 10 为过表达 nagb 基因对发酵过程中糖耗的影响结果由图 10 可知 : 在优化的最佳发酵条件下,0 ~ 18 h, 重组菌的糖耗速率比原始菌 Rosetta 大, 而且在 24 h 葡萄糖均已耗尽由此可见, 过表达 nagb 造成了发酵过程中的糖耗速率增大过表达 nagb 基因对大肠杆菌中心碳代谢的影响合成 GlcN 6 P 的底物 Fru 6 P 在细胞内除了用来合成 GlcN 6 P 之外, 还会经 EMP 途径形成丙酮酸, 丙酮酸一部分经代谢会合成乳酸或乙酸, 另一部分进入 TCA 循环因此, 通过观察乙酸乳酸和柠檬酸及 α 酮戊二酸的积累, 观察过表达 nagb 对中心碳代谢的影响, 结果见图 12 图 12 Fig. 12 过表达 nagb 对大肠杆菌有机酸积累的影响 Effects on overexpression nagb on organic acids production in E. coli 图 10 过表达 nagb 对发酵过程中糖耗的影响 Fig. 10 Effects on overexpression genes nagb on sugar consumption 图 11 为在最佳发酵条件下, 过表达 nagb 基因对发酵过程中大肠杆菌 GlcN 积累的影响结果由图 11 可知 : 在最佳发酵条件下, 葡萄糖耗尽, 重组菌发酵液中的 GlcN 含量是 Rosetta 的 2 1 倍这说明过表达 nagb 对大肠杆菌 GlcN 的合成有一定的促进作用图 11 过表达 nagb 对大肠杆菌 GlcN 积累的影响 Fig. 11 Effects on gene nagb overexpression on GlcN production in E coli 由图 12 可知 : 在最佳发酵条件下, 重组菌发酵液中丙酮酸的含量是 Rosetta 的 1 48 倍 ; 丙酮酸的代谢产物乙酸的含量是 Rosetta 的 1 74 倍 ; 丙酮酸的代谢产物乳酸的含量为 2 53 g / L,Rosetta 发酵液中没有检测到乳酸含量 ; 重组菌发酵液中柠檬酸及 α 酮戊二酸的含量分别是 Rosetta 的 2 99 和 2 73 倍实验数据表明 : 过表达 nagb 导致了有机酸的积累, 且跟 TCA 途径相关的柠檬酸及 α 酮戊二酸的含量较高, 分别为 2 39 和 g / L 3 结论研究了在大肠杆菌 Rosetta 中过表达黑曲霉氨基葡萄糖脱氨酶, 对于大肠杆菌 GlcN 的合成和中心碳代谢的影响实验结果表明 : 过表达氨基葡萄糖脱氨酶使得在 36 g / L 葡萄糖,pH 为 9 0 的发酵条件下, 发酵 24 h 后, 重组菌发酵液中氨基葡萄糖丙酮酸和乙酸的量分别是对照菌 Rosetta 的和 1 74 倍 ; 而乳酸的量为 2 53 g / L, 对照菌 Rosetta 发酵液中的乳酸含量并未检测到, 重组菌发酵液中柠檬酸及 α 酮戊二酸的含量分别是 Rosetta 的 2 99 倍和 2 73 倍过表达黑曲霉氨基葡萄糖脱氨酶能够促进 GlcN 的合成, 导致糖代谢减慢, 使得葡萄糖主要经过 EMP 途径进入 TCA 循环

7 48 生物加工过程第 11 卷在后期的工作中, 可以对大肠杆菌的代谢途径进一步的改造, 加强 GlcN 合成途径, 弱化中心碳代谢途径, 以实现 GlcN 的有效积累参考文献 : [ 1 ] de los Reyes G C, Koda R T, Lien E J. Glucosamine and chondroitin sulfates in the treatment of osteoarthritis: a survey [ J]. Prog Drug,2000,55: [ 2 ] Vangsness C T,Jr Spiker W,Erickson J. A review of evidence based medicine for glucosamine and chondroitin sulfate use in knee osteoarthritis[ J]. Arthroscopy,2009,25(1): [ 3 ] Distier J, Anguelouch A. Evidence based practice: review of clinical evidence on the efficacy of glucosamine and chondroitin in the treatment of osteoarthritis [ J]. J Am Acad Nurse Pract, 2006,18(10): [ 4 ] Barrientos C, Racotta R, Quevede L. Glucosamine attenuates increases of intraabdominal fat,and insulin resistance induced by a high fat diet in rats[ J]. Nutr Res,2010,30(11): [ 5 ] Deng M D,Wassink S L,Grund A D. Engineering a new pathway for N acetylglucosamine production:coupling a catabolic enzyme, glucosamine 6 phosphatedeaminase,with a biosynthetic enzyme, glucosamine 6 phosphate N acetyltransferase[ J]. Enzyme Microb Technol,2006,39: [ 6 ] Deng M D, Severson D K, Grund A D, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for industrial production of glucosamine and N acetyl glucosamine[ J]. Metab Eng,2005,7: [ 7 ] Hong K K, Chung J S, Shin S, et al. Corynebacterium genus microorganism having ability to produce N acetyl glucosamine and method for producing N acetyl glucosamine or glucosamine using same:ep, a2[ P] [ 8 ] Álvarez Añorve L I, Bustos Jaimes I, Calcagno M L, et al. Allosteric regulation of glucosamine 6 phosphate deaminase (NagB) and growth of Escherichia coli on glucosamine [ J]. J Bacteriol, 2009,191(20): [ 9 ] Šolar T,TuršičJ,Legiša M. The role of glucosamine 6 phosphate deaminase at the early stages of Aspergillus niger growht in a high citric acid yielding medium[ J]. Microbiol Biotechnol,2008,78: [10] Ishikawa M, Koizumi S. Microbial production of N acetylneuraminic acid by genetically engineered Escherichia coli [ J]. Carbohydr Res,2010,345: [11] White R J. Control of amino sugar metabolism in Escherichia coli andisolation of mutants unableto degrade amino sugars [ J ]. Biochem,1968,106: [12] Papagianni M,Wayman F,Mattey M. Fate and role of ammonium ions during fermentation of citric acid by Aspergillus niger[ J]. J Am Soc Microbiol,2005,71(11): [13] Legiša M, Mattey M. Changes in primary metabolism leading to citric acid overflow in Aspergillus niger [ J]. Biotechnol Lett, 2007,29(2): [14] Studier F W. Protein production by auto induction in high density shaking cultures[ J]. Protein Expr Purif,2005,41: [15] 周慧, 郝宁, 严明, 等. 柱前衍生化 HPLC 法测定发酵液中 L 瓜氨酸和 L 鸟氨酸含量 [ J]. 南京工业大学报 : 自然科学版,2009,31(2): [16] 陈金燕, 邹树平, 何冬梅, 等. 水 / 离子液体 [ BMIM] PF 6 两相体系中全细胞催化生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸 [ J]. 化工学报,2011,62(11):

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌