, Vol.37, No.14 食品科学工艺技术限制了机体对孢内有效物质的消化吸收为了充分利用灵芝孢内有效物质, 破壁处理是必要的, 且破壁处理可以提高 GLS 的生物活性 [9-10] 目前, 国内外关于 GLS 破壁方法有超声波处理法 [11-13] 酶水解处理法离心剪切粉

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租永庾
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1 工艺技术食品科学 2016, Vol.37, No 灵芝孢子粉破壁工艺优化及其抗肿瘤作用刘春延, 张国财 *, 程方志, 张国珍 *, 赵博, 林连男 ( 东北林业大学林学院, 黑龙江哈尔滨 ) 摘要 : 以灵芝孢子粉为原料, 采用高压均质法破壁灵芝孢子, 研究灵芝孢子粉破壁优化工艺及破壁孢子粉抗肿瘤作用选取水为破壁溶剂, 以均质压力均质次数料液比为试验因素, 以灵芝孢子破壁率为试验指标, 通过单因素试验及正交试验对灵芝孢子破壁工艺进行优化通过建立 S180 荷瘤小鼠模型, 对破壁灵芝孢子粉的抗肿瘤作用进行研究结果表明, 最佳破壁工艺条件为均质压力 150 MPa 均质次数 3 料液比 1 100(g/mL), 破壁率为 94.35% 抗肿瘤实验表明, 破壁灵芝孢子对小鼠 S180 肉瘤的抑制率为 43.37%~57.59%, 且肝体比和肺体比变化稳定, 并可显著提高小鼠的胸腺指数和脾指数因此, 破壁灵芝孢子粉具有良好的抗肿瘤作用关键词 : 灵芝孢子 ; 破壁 ; 高压均质法 ; 抗肿瘤作用 Optimization of Disruption of Ganoderma lucidum Spores and Antitumor Effect of the Broken Spores LIU Chunyan, ZHANG Guocai*, CHENG Fangzhi, ZHANG Guozhen *, ZHAO Bo, LIN Liannan (College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin , China) Abstract: The purpose of this study was to investigate the optimum conditions for breaking Ganoderma lucidum spores by high-pressure homogenization using water as the solvent and to evaluate the antitumor effect of the broken spores. The optimization of three process variables including solid-to-liquid ratio, homogenization pressure, and the number of homogenization cycles for improved percentage of broken spores was conducted through one-factor-at-a-time and orthogonal array experiments. S180 tumor-bearing mice models were established for evaluation of the antitumor effect of the broken G. lucidum spores. The results showed that the optimal conditions for breaking G. lucidum spores were obtained as follows: homogenization pressure, 150 MPa; homogenization cycles, 3 times; and solid-to-liquid ratio, 1:100 (g/ml). Under these conditions, the percentage of broken spores could be up to 94.35%. Antitumor tests showed that the percentage inhibition of tumor growth in S180 tumor-bearing mice by the broken spores was 43.37% 57.59%, and the liver index and lung index were little affected while the thymus index and spleen index were significantly enhanced. Therefore, broken G. lucidum spores possessed good antitumor effect. Key words: Ganoderma lucidum spores; spore disruption; high pressure homogenization method; antitumor effect DOI: /spkx 中图分类号 :R285.5 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 引文格式 : 刘春延, 张国财, 程方志, 等. 灵芝孢子粉破壁工艺优化及其抗肿瘤作用 [J]. 食品科学, 2016, 37(14): DOI: /spkx LIU Chunyan, ZHANG Guocai, CHENG Fangzhi, et al. Optimization of disruption of Ganoderma lucidum spores and antitumor effect of the broken spores[j]. Food Science, 2016, 37(14): (in Chinese with English abstract) DOI: / spkx 灵芝孢子粉 (Ganoderma lucidum spores,gls) 是灵芝在生长成熟期从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞, 具有灵芝的全部遗传物质 [1] 药理研究表明,GLS 具有抗肿瘤增加免疫调节保护肝脏治疗神经性疾病等多种药理作用 [2-8] 但由于 GLS 为双壁结构, 质地坚硬, 由几丁质和纤维素等高分子物质构成, 收稿日期 : 基金项目 : 哈尔滨市科技局科技项目 (2014FF6CJ002); 中央高校基本科研业务费专项 ( AA08) 作者简介 : 刘春延 (1993 ), 女, 硕士研究生, 研究方向为食用菌活性成分 Lcy7621@126.com * 通信作者 : 张国财 (1964 ), 男, 教授, 博士, 研究方向为森林资源保护及利用 Zhang640308@126.com 张国珍 (1964 ), 女, 高级工程师, 博士, 研究方向为森林培育资源 Zhangguozhen60@126.com

2 , Vol.37, No.14 食品科学工艺技术限制了机体对孢内有效物质的消化吸收为了充分利用灵芝孢内有效物质, 破壁处理是必要的, 且破壁处理可以提高 GLS 的生物活性 [9-10] 目前, 国内外关于 GLS 破壁方法有超声波处理法 [11-13] 酶水解处理法离心剪切粉碎法和 CO 2 超临界处理法等, 但这些方法普遍存在效率低破壁率较低的缺点, 关于高压均质法破壁 GLS 的工艺亦有报道, 本实验系统研究了高压均质法 GLS 破壁工艺优化, 并对破壁后灵芝孢子粉 (broken Ganoderma lucidum spores,bgls) 的抗肿瘤作用进行了研究 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 GLS 由吉林白石山林业局培养并提供, 品种为韩芝 1 号抗肿瘤实验中 BGLS 是用高压均质机在最佳破壁工艺条件下获得清洁级昆明种小鼠 ( 雄雌各半, 体质量 (20±2)g) 黑龙江省中医药大学小鼠实体移植肉瘤 180(S180) 由东北林业大学食品科学实验室提供, 液氮冻存无水硫酸锌无水乙醇国药集团化学试剂有限公司 ; 注射用环磷酰胺 ( 批号 : ,200 mg/ 支 ) 江苏恒瑞医药股份有限公司 1.2 仪器与设备血球计数板 (25 mm 16 mm) 哈尔滨赛拓生化试剂仪器公司 ;TH-500BQ 型超声波仪济宁天华超声电子仪器有限公司 ;QL901 型涡旋混合器江苏海门其林贝尔公司 ;BH-2 型普通光学显微镜奥林巴斯公司 ; AH100B 型高压均质机上海市 ATS 工业系统有限公司 1.3 方法 GLS 破壁工艺 GLS 过 80 目筛冲洗数次抽干烘干 (60 ) 预处理 GLS 制成悬浊液超声处理 (1 h) [14] 振荡 (1 次 /10 min 数次 ) 高压均质机破壁 BGLS 悬浊液减压浓缩 BGLS 破壁率的测定 [15] 参考倪伟锋方法对 BGLS 采用血球计数板计数, 并绘制标准曲线 y= x (y 为孢子粉平均数,x 为孢子粉质量,R 2 = ), 按照 (1) 式计算破壁率 : N 1 N 2 X 100 (1) N 1 式中 :X 为破壁率 /%;N l 为从标准曲线查到的与待测样品相同质量的未破壁 GLS 数目 ;N 2 为计数得到的 BGLS 样品中未破壁的 GLS 数目单因素试验设计以水为破壁工艺溶剂, 按照节中的工艺对 GLS 进行破壁处理, 通过单因素试验考察料液比均质压力均质次数对 GLS 破壁率的影响, 单因素试验设计见表 1, 固定条件为 : 料液比 1 100(g/mL) 均质压力 130 MPa 均质次数 1 表 1 单因素试验因素及水平设计 Table 1 Factors and their levels used for one-factor-at-a-time experiments 水平因素料液比 (g/ml) 均质压力 /MPa 均质次数正交试验设计以料液比均质压力均质次数为试验因素, 以 [16] 破壁率为指标采用正交试验设计法对破壁工艺进行优化, 正交试验因素与水平设计见表 2 表 2 GLS 破壁工艺正交试验因素与水平 Table 2 Factors and their levels used for orthogonal array experiments 水平因素 A 料液比 (g/ml) B 均质压力 /MPa C 均质次数 BGLS 抗肿瘤作用荷瘤造模复苏 S180 肿瘤细胞, 腹腔接种, 传代 3 次后用于实验无菌抽取传代 7 d 生长良好的 S180 荷瘤小鼠的腹水, 加入生理盐水调节肿瘤细胞分子数量浓度至 /ml 小鼠 60 只, 雌雄各半, 喂养 1 周造模时每鼠右腋皮肤消毒, 于右腋皮下接种瘤细胞悬液, 每只小鼠接种 0.2 ml [17] 分组给药接种 24 h 后, 将小鼠随机分为 8 组, 即模型对照 ( 等容食用油 ) GLS( g/kg) 环磷酰胺 (75 mg/kg) 和 BGLS( g/kg) 组灌胃给药, 每天 1 次, 连续 10 d [18-20] BGLS 对 S180 荷瘤小鼠模型的影响停药次日称质量并处死小鼠, 分别称取小鼠肿瘤质量肝脏肺胸腺和脾脏质量, 计算抑瘤率 [21] [22] 肝体比肺体比胸腺指数和脾指数等, 如式 (2)~(6) 所示 : /%100 (2)

3 工艺技术食品科学 2016, Vol.37, No / mg/g (3) / mg/g (4) / mg/g (5) / mg/g (6) 2 结果与分析 2.1 单因素试验结果料液比对破壁率的影响 Fig. 1 /% g/ml 图 1 料液比对破壁率的影响 Effects of solid-to-liquid ratio on the percentage of broken spores 由图 1 可知, 料液比在 1 50~1 100(g/mL) 范围内,GLS 破壁率随着溶剂用量的增加而提高, 当料液比为 1 100(g/mL) 时, 破壁率最大, 达 57.24% 当溶剂用量继续增加时破壁率反而下降然而高压均质机处理 GLS 时, 强大的机械力使 GLS 相互碰撞达到破壁的目的, 当溶剂用量较小时,GLS 之间碰撞距离较短, 撞击力较低, 导致破壁率较低, 随着溶剂用量的增大,GLS 之间的碰撞距离随之增大, 破壁率会因撞击力变大而提高, 但当溶剂用量增大到一定程度时 GLS 破壁率会因碰撞几率减小而下降故选料液比 1 100(g/mL) 为最佳均质压力对破壁率的影响 Fig. 2 /% /MPa 图 2 均质压力对破壁率的影响 Effects of homogenization pressure on the percentage of broken spores 由图 2 可知,GLS 破壁率随着均质压力的增大而升高, 当均质压力在 70~110 MPa 时, 破壁率较低且缓慢升高, 当均质压力达到 110 MPa 时, 破壁率显著升高, 当达到高压均质机最大均质压力 150 MPa 时, 破壁率达到 57.38% 结果表明, 利用高压均质机对 GLS 破壁处理, 均质压力越大, 提供的机械能越大,GLS 破壁率越高考虑到本实验高压均质机最大使用均质压力为 150 MPa, 因此, 均质压力选择 130 MPa 均质次数对破壁率的影响 Fig. 3 /% 图 3 均质次数对破壁率的影响 Effects of the number of homogenization cycles on the percentage of broken spores 由图 3 可知,GLS 破壁率随着均质次数增加而升高, 当均质 3 次时, 破壁率达到 89.33%, 均质次数继续增加, 破壁率趋于平稳因此, 选择均质次数正交试验结果 Table 3 试验号表 3 GLS 破壁工艺优化正交试验设计与结果 Orthogonal array design layout with experimental results for percentage disruption of G. lucidum spores A 料液比 B 均质压力 C 均质次数破壁率 /% k cb ba k bab aa k aa aa R 注 : 同列大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01); 小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) 下同 Table 4 表 4 正交试验结果方差分析 Analysis of variance of the results of orthogonal array experiments 变异来源 Ⅲ 型平方和自由度均方 F 值 P 值校正模型截距 ** A 料液比 B 均质压力 ** C 均质次数 * 误差总计校正总计注 : **. 差异极显著 (P<0.01); *. 差异显著 (P<0.05)

54 2016, Vol.37, No.14 食品科学工艺技术表 4 方差分析结果表明 :3 个因素的主次顺序为均质压力 (B)> 均质次数 (C)> 料液比 (A), 即均质压力对 GLS 破壁率具有极显著的影响 (P<0.01), 均质次数对破壁率影响显著 (P<0.

破壁率在各水平间无显著差异, 在 A 2 水平上破壁率最大, 因此, 实践中选取 A 2 为最佳综合考量得出 :GLS 破壁工艺最优条件为 B 3 C 2 A 2, 即均质压力 150 MPa 均质次数 3 料液比 1 100(g/mL) 2.3 验证实验按照最佳破壁工艺 B 3 C 2 A 2 采用高压均质法对 GLS 进行 3 次平行破壁处理, 破壁率的平均值达 94.

4 , Vol.37, No.14 食品科学工艺技术表 4 方差分析结果表明 :3 个因素的主次顺序为均质压力 (B)> 均质次数 (C)> 料液比 (A), 即均质压力对 GLS 破壁率具有极显著的影响 (P<0.01), 均质次数对破壁率影响显著 (P<0.05), 而料液比对破壁率的影响不显著由表 3 4 可知, 在正交试验设计中, 对于 B 因素, GLS 破壁率在各水平间的差异显著,B 3 和 B 1 破壁率差异极显著, 以 B 3 为最佳对于 C 因素,GLS 破壁率 C 1 水平分别与 C 2 C 3 水平差异显著, 但 C 2 水平和 C 3 水平间无显著差异, 实践中选取 C 2 为最佳对于 A 因素,GLS 破壁率在各水平间无显著差异, 在 A 2 水平上破壁率最大, 因此, 实践中选取 A 2 为最佳综合考量得出 :GLS 破壁工艺最优条件为 B 3 C 2 A 2, 即均质压力 150 MPa 均质次数 3 料液比 1 100(g/mL) 2.3 验证实验按照最佳破壁工艺 B 3 C 2 A 2 采用高压均质法对 GLS 进行 3 次平行破壁处理, 破壁率的平均值达 94.35%, 与正交试验中的结果相吻合, 进一步验证了该破壁工艺的可行性其中,GLS 和 BLGS 的显微结构见图 4, 未破壁 GLS 视野范围内孢子完整, 而 BGLS 视野范围内大部分孢子已被破壁, 两者差异明显 a b 由表 5 可知, 给药 10 d 后处死小鼠, 剥离肿瘤后, 各组肿瘤质量均低于模型对照组, 且抑瘤率与给药剂量呈一定正相关关系, 当 GLS 给药剂量相同时,BGLS 剂量组抑瘤率均高于 GLS 剂量组, 其中 BGLS 高剂量组肿瘤质量最小, 抑瘤率最高, 为 57.59%, 相比环磷酰胺组低了 10.58%, 相比 BGLS 中剂量组仅提高了 0.53% 方差分析表明,GLS 剂量组肿瘤质量与模型对照组差异显著, 证明 GLS 对 S180 有明显的抑制作用, 同时,BGLS 剂量组与 GLS 剂量组差异显著,BGLS 高剂量组与 BGLS 中剂量组肿瘤抑制率无显著差异, 结果表明 BGLS 剂量组抑瘤率优于 GLS 剂量组综合考量, 选 BGLS 中剂量组为最佳 GLS 对 S180 荷瘤小鼠肺体比肝体比胸腺指数和脾脏指数的影响表 6 BGLS 对 S180 荷瘤小鼠肺体比肝体比胸腺指数脾指数的影响 (x±s,n=6) Table 6 Effects of broken G. lucidum spores on lung index, liver index, chest gland index, and spleen index in S180 tumor-bearing mice (x ± s, n=6) mg/g 组别肺体比肝体比胸腺指数脾指数模型对照组 10.17±0.65 bb 60.91±1.60 bb 2.61±0.16 bc 5.13±0.64 cc GLS 低剂量组 10.04±0.85 bb 60.41±1.14 bb 2.45±0.88 bc 5.91±0.95 bb GLS 中剂量组 10.17±0.96 bb 60.42±0.77 bb 2.58±0.48 bc 6.13±1.12 aba GLS 高剂量组 10.13±0.31 bb 60.55±0.92 bb 2.87±0.47 bbc 6.41±1.25 aa BGLS 低剂量组 10.23±0.70 bb 60.44±1.44 bb 3.60±0.70 aab 6.40±1.25 aa BGLS 中剂量组 10.82±0.50 bb 60.92±1.78 bb 3.79±0.38 aa 6.50±1.18 aa BGLS 高剂量组 10.75±0.99 bb 60.78±1.26 bb 3.71±0.58 aab 5.8±0.85 bb 环磷酰胺组 12.13±1.26 aa 63.03±1.39 aa 1.31±0.32 cd 2.40±0.74 dd 图 4 GLS (a) 和 BGLS (b) 显微镜图 ( 400) Fig. 4 Optical microscope photographs of intact (a) and broken (b) G. lucidum spores ( 400) 2.4 BGLS 抗肿瘤功能 BGLS 对 S180 荷瘤小鼠肿瘤质量的影响表 5 BGLS 对 S180 荷瘤小鼠肿瘤质量及抑瘤率的影响 (x±s,n=6) Table 5 Inhibitory effects of broken G. lucidum spores on tumor growth in S180 tumor-bearing mice (x ± s, n=6) 组别剂量 /(g/kg) 肿瘤质量 /g 平均抑瘤率 /% 模型对照组 1.10±0.08 GLS 低剂量组 ±0.05* ee GLS 中剂量组 ±0.08** dd GLS 高剂量组 ±0.04** cc BGLS 低剂量组 ±0.04** dcd BGLS 中剂量组 ±0.02** bb BGLS 高剂量组 ±0.03** bb 环磷酰胺组 ±0.05** aa 注 : 与模型对照组比较 : **. 差异极显著 (P<0.01), *. 差异显著 (P<0.05) 由表 6 可知, 不同处理组肺体比和肝体比中, 不同剂量组与模型对照组相比变化不大, 且差异不显著, 表明 GLS 对小鼠肝肺影响较小 ; 但环磷酰胺组肺体比和肝体比均高于其他处理组, 且与其他处理组均有显著差异不同处理组胸腺指数中,BGLS 剂量组胸腺指数均高于其他处理组, 以 BGLS 中剂量组为最高, 方差分析表明, BGLS 剂量组胸腺指数与其他各处理组差异显著 ;GLS 剂量组胸腺指数与模型对照组相比变化不大且无显著差异, 环磷酰胺组胸腺指数比模型对照组下降了 49.81% 分析结果表明,BGLS 可以提高小鼠胸腺指数,GLS 对小鼠胸腺指数无影响而环磷酰胺可以对使小鼠胸腺指数大大下降不同处理组脾指数中, 随着 GLS 剂量组剂量的增加, 脾指数呈上升趋势, 但 BGLS 高剂量组脾指数低于 BGLS 中剂量组, 同时,BGLS 中剂量组脾指数高于 GLS 剂量组, 此外, 环磷酰胺组胸腺指数与模型对照组相比下降了 53.21% 方差分析表明,GLS 和 BGLS 剂量组脾指数与模型对照组具有显著差异, 与环磷酰胺处理组差异极显著, 分析结果表明,GLS 可以提高小鼠脾指数, 且以 BGLS 中剂量组为最佳, 环磷酰胺可以对使小鼠脾指数下降

5 工艺技术食品科学 2016, Vol.37, No 讨论与结论通过单因素试验和正交试验优化法探讨高压均质法破壁 GLS 工艺条件, 确定最佳破壁工艺参数为 : 均质压力 150 MPa 均质次数 3 料液比 1 100(g/mL) 高压均质机与传统工艺相比, 高压均质机操作简单, 更易于实现工业化生产本研究发现,GLS 平均破壁率与均质压力呈正相关, 由于受实验装置的构造所限不可能无限地增大均质压力, 故本实验选择最大均质压力为 150 MPa 抗肿瘤实验表明,GLS 剂量组与模型对照组相比具有明显的抗肿瘤作用, 环磷酰胺组对 S180 荷瘤小鼠的平均抑瘤率虽然最高, 但其会大大降低 S180 荷瘤小鼠胸腺指数脾脏指数, 出现肺体比增大和肝体比增大等现象, 对免疫器官的损伤, 极大降低了机体的抵抗力, 同时,GLS 剂量组中 S180 荷瘤小鼠肺体比和肝体比比较稳定, 且胸腺指数和脾指数与模型对照组相比有上升趋势, 这表明 GLS 对小鼠不但有抑制肿瘤生长的作用, 同 [23] 时还可以增强小鼠的免疫功能, 这与李洁的白花蛇舌草对 S180 小鼠的抗肿瘤研究的结果相符此外, 通过比较 BGLS 与 GLS 的抗肿瘤效果, 结果发现,BGLS 可以更显著提高 S180 小鼠的抗肿瘤活性及免疫功能, 这与 Liu Xin [2] [24] 吴学谦等的研究结果相符, 并且肿瘤抑制 [25] 率与给药剂量的呈正相关, 这与马晶晶的研究结果相符, 但 BGLS 的抗肿瘤效果中,BGLS 中剂量组作用最明显, 因此,BGLS 使用时并不是剂量越大越好, 而是存在 [26] 最适剂量, 这与林庶茹等的研究结果相符故在抗肿瘤实验中选用 BGLS 中剂量组为最佳, 为 1 g/kg 本研究为 BGLS 的抗氧化改善细胞呼吸抑制凋亡肠道菌群调节和刺激细胞因子等生物活性的深入研究提供了参考参考文献 : [1] 姜余梅, 杨艳, 陈晓姗, 等. 灵芝孢子和抗性淀粉对糖尿病大鼠糖脂代谢及氧化应激的协同干预 [J]. 食品科学, 2014, 35(23): DOI: /spkx [2] LIU Xin, YUAN Jianping, CHUNG C K, et al. Antitumor activity of the sporoderm-broken germinating spores of Ganoderma lucidum[j]. Cancer Lett, 2002, 182(2): DOI: /S (02) [3] GUO Liang, XIE Jianhui, RUAN Yuanyuan, et al. Characterization and immunostimulatory activity of a polysaccharide from the spores of Ganoderma lucidum[j]. International Immunopharmacology, 2009, 9(10): DOI: /j.intimp [4] JIN Hai, JIN Feng, JIN Jiaxing, et al. Protective effects of Ganoderma lucidum spore on cadmium hepatotoxicity in mice[j]. Food and Chemical Toxicology, 2013, 52(1): DOI: / j.fct [5] ZHOU Yan, QUA Zeqiang, ZENG Yuanshan, et al. Neuroprotective effect of preadministration with Ganoderma lucidum spore on rat hippocampus[j]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2012, 64(7/8): DOI: /j.etp [6] 王淑秋, 李晓捷, 姜志梅, 等. 灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑组织细胞色素 C 线粒体钙 HSP70 和 BDNF 的影响 [J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(6): DOI: /j.issn [7] WANG Quanxi, HUANG Yifan, WU Baocheng, et al. Inhibitive effect on apoptosis in splenic lymphocytes of mice pretreated with Lingzhi (Ganoderma lucidum) spores[j]. Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 34(2): DOI: /S (14) [8] 唐柳, 张志军, 魏雪生, 等. 灵芝孢子粉药理作用研究进展 [J]. 天津农业科学, 2011, 17(3): DOI: / j.issn [9] 黄晓兰, 吴惠勤, 黄芳, 等. 破壁与不破壁灵芝孢子粉多糖的分析 [J]. 中草药, 2006, 37(6): [10] SANODIYA B S, THAKUR R K, BAGHEL G B, et al. Ganoderma lucidum: a potent pharmacological macrofungus[j]. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009, 10(8): DOI: / [11] ZHU H S, YANG X L, WANG L B, et al. Effects of extracts from sporoderm-broken spores of Ganoderma lucidum on HeLa cells[j]. Cell Biology and Toxicology, 2000, 16(3): DOI: / A: [12] FU Yujie, LIU Wie, ZU Yugang, et al. Breaking the spores of the fungus Ganoderma lucidum by supercritical CO 2 [J]. Food Chemistry, 2009, 112(1): DOI: /j.foodchem [13] 赵洁胜, 魏联, 虞燕萍, 等. 灵芝孢子粉破壁率的检验方法研究进展 [J]. 中国医药指南, 2013, 11(5): DOI: /j.cnki. gocm [14] 朱俊洁, 张守勤, 王长征, 等. 破壁提取综合法提取灵芝孢子多糖的研究 [J]. 农业机械学报, 2004, 35(3): [15] 倪伟锋. 灵芝破壁孢子粉破壁率测定技术和质量安全评价的研究 [D]. 福州 : 福建农林大学, [16] 焦艳丽, 温升南, 杜冰, 等. 挤压处理灵芝孢子粉提取灵芝多糖 [J]. 食品科学, 2011, 32(16): [17] 张秀娟, 刘斌, 孙宇婷, 等. 大豆多糖对 S-(180) 荷瘤小鼠抗肿瘤作用的免疫机制研究 [J]. 食品工业科技, 2012, 33(2): DOI: /j.issn [18] 张艳, 叶克难. 虫草灵芝孢子粉复合物对小鼠免疫功能的影响 [J]. 食品科学, 2012, 33(17): [19] 杨丽丽, 邓志钦, 黄维渊, 等. 灵芝孢子粉对抗亚急性酒精性肝损伤的实验研究 [J]. 时珍国医国药, 2013, 24(3): DOI: / j.issn [20] 张荣标, 陈润, 陈冠敏, 等. 破壁灵芝孢子粉对小鼠免疫功能影响的研究 [J]. 预防医学论坛, 2013, 19(12): ; 954. [21] 金玲, 刘菊妍, 孙升云, 等. 灵芝孢子油软胶囊对 H22 肝癌小鼠抑瘤作用及免疫功能的影响 [J]. 中华中医药杂志, 2011, 26(4): [22] 蒋丽, 黄远英, 殷光玲. 灵芝孢子油免疫调节作用的研究 [J]. 现代食品科技, 2013, 29(3): ; 542. [23] 李洁. 白花蛇舌草对 S-(180) 荷瘤小鼠抑瘤作用的实验研究 [J]. 中医研究, 2008, 21(5): [24] 吴学谦, 吴学良, 楼利明, 等. 原木灵芝破壁孢子粉对小鼠免疫功能的影响 [J]. 中国食用菌, 2014, 33(1): DOI: / j.cnki [25] 马晶晶. 高速离心剪切粉碎对灵芝孢子粉破壁及特性的影响 [D]. 武汉 : 武汉理工大学, [26] 林庶茹, 杜松, 郑洪新, 等. 灵芝破壁孢子粉对 LEWIS 荷瘤小鼠细胞免疫干预作用 [J]. 中国中医基础医学杂志, 2005, 11(6): ; 433.

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H 2 SO ml ml 1. 0 ml C 4. 0 ml - 30 min 490 nm 0 ~ 100 μg /ml Zhao = VρN 100% 1 m V ml ρ g 16 6 2018 11 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol. 16 No. 6 Nov. 2018 doi 10. 3969 /j. issn. 1672-3678. 2018. 06. 004 1 2 1 1 1. 330200 2. 330006 4 Box-Behnken 1 25 g /ml 121 92 min 2 6. 284%